基于EST-SNP 的福建云霄茶樹種質資源遺傳多樣性分析

王澤涵，于文濤，方德音，蔡捷英，王金煥，樊曉靜，劉財國，徐 飆，葉乃興 *

（1. 福建農林大學園藝學院，福建 福州 350002；2. 福州海關技術中心，福建 福州 350001；3. 云霄縣茶葉科學研究所，福建 云霄 363300；4. 福建省亞熱帶作物學會，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意義】茶樹[Camellia sinensis（L.）O.Kuntze]作為重要的經濟作物，目前在全球50 多個國家廣泛種植[1?2]。中國茶樹種質資源豐富，有較高的遺傳多樣性[3]。茶樹遺傳多樣性是生物多樣性的組成部分之一，對一些地區(qū)茶樹遺傳多樣性和遺傳結構的研究有助于對該地區(qū)茶樹種質資源的認識和保護[4]。福建省由于獨特的地理位置和氣候，使得該地區(qū)孕育了大量的茶樹種質資源[5]。云霄位于福建南部，云霄縣地方茶樹種質資源豐富，其主要分布在云霄大帽山、小帽山、梁山、烏山等地[6?7]。利用SNP分子標記技術對云霄茶樹資源親緣關系、遺傳多樣性、群體結構的分析，對該地區(qū)地方茶樹種質的認識、保護和開發(fā)具有重要意義。【前人研究進展】隨著分子標記技術的發(fā)展，RAPD[7]、AFLP[8]、ISSR[9]、SSR[10]等技術已廣泛應用于茶樹。SNP 作為第三代分子標記技術，具有自動化、高通量、遺傳穩(wěn)定性高[11]等優(yōu)點。由于單核苷酸多態(tài)性( single nucleotide polymorphisms，SNPs）廣泛存在于植物基因中，因此目前在植物鑒定中占據相對的優(yōu)勢[12]。SNP 技術在茶樹上也得到了有效的利用，如林浥等[13]利用SNP技術對閩北、閩南、粵東、臺灣等4 個烏龍茶主產區(qū)茶樹種質資源組群間的遺傳關系進行了分析。陳立杰等[14]采用SNP 技術分析了貴陽花溪茶樹資源的遺傳多樣性。樊曉靜等[15]以前期開發(fā)的SNP 候選位點為基礎，進一步篩選得到最優(yōu)SNP 位點，結合茶樹品種基本信息構建茶樹品種資源分子身份證?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組前期在云霄縣發(fā)現(xiàn)野生禿房茶樹群體種質資源[16]，但其親緣關系有待深入探討?！緮M解決的關鍵問題】利用SNP 分子標記技術對云霄縣地方茶樹種質資源進行親緣關系的研究，以期在分子水平上分析云霄野生禿房茶樹群體種間的遺傳關系，為該地區(qū)地方種質的利用、開發(fā)和選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料共62 份，包括福建云霄縣的61 份和云南的南糯山大茶樹1 份。南糯山大茶樹是來源于茶樹起源地中國西南部地區(qū)的喬木大葉種[1]，為茶樹種質資源演化的基部類群，適于作為置根參照來分析云霄茶樹種質資源的親緣關系。按照取樣地，可將云霄的茶樹種質資源分為6 組，分別為組別I、II、III、IV、Ⅴ和Ⅵ。組別I 為來源于南烏山的9 份茶樹種質，組別II 為來源于烏山的6 份茶樹種質，組別III 為來源于小帽山的16 份茶樹種質，組別IV 為來源于大帽山的20 份茶樹種質，組別Ⅴ為來源于雞籠山的1 份茶樹種質，組別Ⅵ為來源于梁山的9 份茶樹種質（表1）。采集后的樣品經過液氮固定后置于?80 ℃冰箱保存。

表1 供試云霄茶樹種質資源基本信息Table 1 Basic information on tea germplasms in Yunxiao

1.2 樣品DNA 的提取

采用新型植物基因組DNA 提取試劑盒(TIANGEN，DP320，北京)提取樣品DNA。用超微量紫外分光光度計（Implen，S60716，德國）測定DNA 濃度和純度。

1.3 SNP 位點的挖掘和選擇

本課題組前期從國家生物信息中心（nationalcenter of biotechnology information，NCBI）的數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載了茶樹的表達序列標簽（express sequence tags，EST），并經過裝配、開發(fā)、驗證，最終篩選出96 個可用于茶樹種質資源的SNP 標記位點[13,17]。使用Fluidigm 96.96Dynamic Array?IFC 芯片（Integrated Fluidic Circuit; Fluidigm?Corp，USA）進行基因分型，參照Fluidigm 96.96 SNPtype 基因分型參考書（Fluidigm，PN100-3912）進行試驗，并依后續(xù)樣品情況進行改進。

1.4 數據分析

芯片上機后使用EP1 儀器進行數據的收集。用Fluidigm SNP Genotyping Analysis 軟件（https://www.fluidigm.com/software）進行數據導出和分析，隨后用GenAlEx6.503 軟件[18]分析等位基因頻率（allele frequency）、信息指數（information index，I）、觀察雜合度（observed heterozygosity，Ho）、預期雜合度（expected heterozygosity，He）、固定指數（fixation index，F(xiàn)）和次等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）。使用GenAlEx6.503 軟件進行遺傳距離計算并進行主坐標分析（principal coordinates analysis）。利用MEGA X 軟件，用層次聚類的方法構建樹狀圖，使用南糯山大茶樹置根。

2 結果與分析

2.1 云霄茶樹種質資源的SNP 多態(tài)性位點篩選及分析

通過對96 個位點的篩選，獲得66 個多態(tài)性強、適用于云霄茶樹種質基因分型的特異性引物。試驗篩選出的66 個SNP 位點及多態(tài)性信息見表2。這些SNP 標記多態(tài)性信息指數為0.047～0.693，平均值為0.415。觀測雜合度為0.016～1.000，平均值為0.309。期望雜合度為0.016～0.500，平均值為0.260。固定指數為?1.000～0.658，平均值為?0.072。次等位基因頻率為0.050～0.500，平均值為0.197。觀測雜合度平均值和期望雜合度平均值接近，說明云霄茶樹資源遺傳多樣性豐富。此外，引物篩選時，確保次等位基因頻率MAF≥0.05。本研究引物的次等位基因頻率圖如圖1 所示。云霄茶樹資源的部分引物分型效果如圖2，從圖中可以看出本研究所選的位點分型效果良好，供試樣品在每一個引物中都得到了很好區(qū)分，而且所選引物多態(tài)性強，每個都包含有3 種基因型（XX、YY 和XY）。

圖1 云霄茶樹資源66 個SNP 位點的次等位基因頻率Fig. 1 Minor allelic frequencies of 66 SNP loci in Yunxiao tea germplasms

圖2 云霄茶樹資源部分引物的分簇效果Fig. 2 Clustering of primers in Yunxiao tea germplasms

表2 云霄茶樹資源的66 個茶樹SNP 位點多態(tài)信息Table 2 Allele information of 66 polymorphic SNP markers in Yunxiao tea germplasms

2.2 云霄茶樹種質資源SNP 基因圖譜的構建

DNA 指紋圖譜是指DNA 樣品用特定分子標記技術處理顯示出具有特定DNA 片段的總稱，其可以鑒別品種間的差異，有高度的個體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，具有良好的應用前景。本研究通過Fluidigm SNP Genotyping Analysis 軟件，可以確定每個SNP 位點上每個樣品的基因型，即XX 型、XY 型和YY 型3 種。其中XX 型和YY 型為純合子，包括AA，TT，CC，GG等4 種等位基因；XY 型為雜合子，包括TC，AG，CT，GA，AT，GC，GT，CG，AC，TG，CA，TA等12 種等位基因。其中A、G、T、C 分別代表腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。本研究通過66 個高質量SNP 位點分型，構建了云霄茶樹及其他相關種質資EST 指紋圖譜（圖3）。

圖3 云霄茶樹種質資源的EST-SNP 指紋圖譜Fig. 3 EST-SNP fingerprints of Yunxiao tea germplasms

2.3 云霄茶樹種質資源遺傳關系

云霄茶種質資源遺傳關系如圖4 所示。根據PCoA分析結果，第一主成分、第二主成分和第三主成分的貢獻率分別為29.29%、11.21%、9.57%。從圖中可以明顯看出，云霄地方茶樹種質資源聚集在一起，各組皆存在交流現(xiàn)象。從組內集中程度來看，烏山、大帽山和南烏山組內分布相對集中；而小帽山和梁山分布相對分散，其中梁山組群中的梁山大茶樹1 號、梁山大茶樹2 號和梁山7 號與其他茶樹距離較遠。此外，小帽山的茶樹種質分布相對獨立于其他組群。

圖4 62 份茶樹種質資源的主坐標分析Fig. 4 Principal coordinates analysis of 62 tea germplasms

2.4 云霄茶樹種質資源群體的遺傳距離

用GenAlEx6.503 軟件計算6 個種群間的遺傳距離如圖3。群體間的遺傳距離為0.150～0.926，其中云霄南烏山云霄梁山的茶樹群體遺傳距離最近，為0.926；大帽山和雞籠山種質遺傳距離最遠，為0.150（表3）。

表3 云霄茶樹種質資源群體間遺傳距離Table 3 Genetic distance between populations of Yunxiao tea germplasms

2.5 云霄茶樹種質資源的聚類分析

中國西南部地區(qū)是茶樹的起源地，南糯山大茶樹為采自云南的古老大喬木種，其為茶樹種質資源演化過程中的基部類群，以其置根進行聚類分析可以更科學地反映出云霄茶樹種質之間的遺傳關系。本研究利用MEGA 軟件，構建云霄地方茶樹種質間的遺傳關系聚類圖（圖5）。從圖中可以看出小帽山組群與大帽山組群的親緣關系相對最遠；各組組群內的茶樹種質大多在同一分支或相鄰的幾個分支，如小帽山組群、梁山組群等；同時不同組群之間也有基因交流，如烏山5 號、梁山大茶樹2 號、梁山3 號、烏山1 號、烏山6 號、梁山1 號、梁山4 號和南烏山8 號等分布在大帽山組群分支上。該聚類分析結果同PCoA 結果一致。從圖中還可以看出，小帽山組群的分支相對其他組最多，與其他5 個組群的交流也相對較少。

圖5 云霄茶樹種質資源的聚類分析Fig. 5 Clustering of Yunxiao tea germplasms

3 討論與結論

3.1 云霄茶樹種質資源的遺傳多樣性豐富

植物基因組中SNP 出現(xiàn)的頻率較高，使得SNP 技術在植物的遺傳多樣性分析上更有優(yōu)勢[13]。同一區(qū)域內的茶樹資源，其遺傳相似性相對較高，這要求DNA 標記采用的引物分型效果好，多態(tài)性強[19]。本研究利用SNP 分子標記技術，對云霄茶樹資源進行基因分型，從96 個SNP 引物中篩選出66 個適用于云霄茶樹種質遺傳關系分析的SNP 位點。茶樹本身具有高度的雜合性，加之其又是異花授粉，在長期雜交演化過程中產生大量不連續(xù)變異[20]。觀測雜合度值和期望雜合度值越接近，群體的遺傳多樣性程度越高[21]。在本研究中，62 份茶樹的觀測雜合度平均值為0.309，期望雜合度平均值為0.260，說明供試的云霄茶樹樣品具有較高的遺傳多樣性。

3.2 云霄茶樹種質資源的DNA 指紋圖譜

當前，對DNA 指紋圖譜的應用已逐漸廣泛，如彭丁文等[22]用SSR 標記構建了中國南方應用面積較大的部分秈型兩系不育系水稻的指紋圖譜。陳亮等[23]通過16 個RAPD 對24 份云南等地野生茶樹進行了鑒定。樊曉靜[19]采用SNP 標記，構建了閩東茶樹種質的DNA 指紋圖譜。云霄縣的野生禿房茶樹資源豐富[7]，本研究以SNP 分子標記技術為支持，篩選66 個SNP 位點，對61 份云霄茶樹種質構建了DNA 指紋圖譜，可以用于云霄茶樹種質資源的精準鑒定。

3.3 云霄茶樹種質資源的研究展望

通過對云霄茶樹種質資源進行主坐標分析和聚類分析可以發(fā)現(xiàn)，云霄6 個組群的茶樹種質資源各自相對獨立，同時又存在基因交流現(xiàn)象。各個組群內分布相對集中，組群間又相互交流，該分析結果與李浩宇等[24]的研究結果相似，說明云霄茶樹種質資源的遺傳多樣性豐富。值得注意的是，小帽山組群內部茶樹資源分布廣泛，表明該組群遺傳多樣性更為豐富。由于不同群體的茶樹種質資源相對獨立，在云霄地方茶樹種質資源的收集、保護和創(chuàng)新研究過程中，應進一步擴大收集云霄縣不同區(qū)域范圍的茶樹種質資源，深入開展云霄縣優(yōu)特茶樹種質資源的鑒定評價研究工作。