黃帝陵側(cè)柏葉枯病的病原菌鑒定及防治藥劑篩選

李培琴,明 潔,張舒瑤,余仲東,賀 虹,唐光輝

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院 西部森林生物災(zāi)害治理國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)試驗(yàn)室，陜西 楊凌712100)

側(cè)柏(Platycladusorientalis)，又名扁柏、香柏，隸屬柏科(Cupressaceae)側(cè)柏屬(Platycladus)，耐干旱貧瘠，是我國(guó)分布最廣的特有常綠針葉喬木，也是重要的園林綠化樹(shù)種。目前對(duì)側(cè)柏的研究主要集中在生態(tài)氣候調(diào)節(jié)功能[1-3]、化學(xué)成分及活性分析[4-5]、種源遺傳多樣性[6]等方面。病蟲危害嚴(yán)重影響了側(cè)柏的生長(zhǎng)及其觀賞效果，尤其是葉枯病[7-9]。葉枯病是我國(guó)側(cè)柏上最主要的常見(jiàn)病害，在全國(guó)各地屢見(jiàn)報(bào)道，主要集中在其病原物鑒定及相關(guān)防治方法探索方面。由于生長(zhǎng)地理位置及生境差異，側(cè)柏葉枯病的病原有所不同。蔣金升等[10]報(bào)道了陜西省洋縣漢王山林場(chǎng)的側(cè)柏葉枯病是由盤單毛孢屬M(fèi)onochaetia. sp引起的；戴雨生等[11]報(bào)道了江蘇省盱眙縣丘陵山區(qū)發(fā)生的大面積側(cè)柏葉枯病是由一種新的寄生性盤菌側(cè)柏綠膠杯菌ChloroscyphaplatycladusDai sp. nov.侵染引起的；該病原也是引起甘肅省天水市甘谷縣天門山景區(qū)的側(cè)柏葉枯病的病原[12]；張舒瑤等[13]通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，黃帝陵側(cè)柏葉枯病主要由擬盤多毛孢Pestalotiopsissp.和鏈格孢Alternariasp.單獨(dú)或復(fù)合侵染引起。國(guó)外有關(guān)側(cè)柏葉枯病的報(bào)道并不多見(jiàn)，Phillips等[14]報(bào)道了病原真菌Keithiathajina侵染也能造成側(cè)柏葉枯病。受限于病原物鑒定技術(shù)的發(fā)展，在前期開(kāi)展的側(cè)柏葉枯病菌病原鑒定基本都是采用形態(tài)學(xué)方法，但形態(tài)學(xué)鑒定有時(shí)只能鑒定到屬而不是種，其鑒定的準(zhǔn)確性還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，真菌ITS-rDNA(internal transcribed spacer-ribosome DNA)序列分析已經(jīng)成為真菌屬內(nèi)種間鑒定、系統(tǒng)發(fā)育及親緣關(guān)系分析的重要方法[15]。

陜西省延安市黃帝陵古柏群是中國(guó)最古老、覆蓋面積最大、保存最完整的古柏群，共8萬(wàn)余株，千年以上3萬(wàn)余株，側(cè)柏為黃帝陵古柏群的主要樹(shù)種之一。古柏群是黃帝陵歷史文化遺產(chǎn)的重要組成部分，隨著國(guó)家對(duì)黃帝陵保護(hù)工作進(jìn)一步重視，黃帝陵周邊人工栽植的側(cè)柏面積不斷擴(kuò)大。但由于一些林地栽培密度過(guò)大，病蟲害滋生，進(jìn)一步影響了古柏群的健康。特別是近年來(lái)黃帝陵側(cè)柏葉枯病大面積發(fā)生，嚴(yán)重威脅古柏群的生存。側(cè)柏葉枯病主要在春季發(fā)病，幼苗和成年樹(shù)木均會(huì)受到危害。發(fā)病植株鱗葉變黃，逐漸枯萎。側(cè)柏葉枯病具有潛伏侵染的特性，往年病原菌隱藏于側(cè)柏植株體內(nèi)，成為來(lái)年初的侵染源，在發(fā)病初期癥狀表現(xiàn)不明顯，危害嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成側(cè)柏林成片枯萎死亡，嚴(yán)重影響其觀賞價(jià)值[13]。在前期的研究中，本課題組通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定，初步確定引起黃帝陵側(cè)柏葉枯病的病原菌為鏈格孢Alternariasp.和擬盤多毛孢Pestalotiopsissp.[13]，本研究在此基礎(chǔ)上結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法，對(duì)黃帝陵側(cè)柏葉枯病的病原菌進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，探討病原菌在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性，并采用室內(nèi)殺菌劑毒力測(cè)定和田間試驗(yàn)，篩選對(duì)黃帝陵側(cè)柏葉枯病具有良好防治效果的藥劑，以期為黃帝陵側(cè)柏葉枯病的防治提供依據(jù)，同時(shí)也為黃帝陵古柏群的保護(hù)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試培養(yǎng)基 本研究采用的培養(yǎng)基主要有馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)培養(yǎng)基、水瓊脂(WA)培養(yǎng)基、玉米(CA)培養(yǎng)基、薩氏(SDAY)培養(yǎng)基、查彼(Czapek)培養(yǎng)基、馬鈴薯蛋白胨葡萄糖瓊脂(PPDA)培養(yǎng)基、黃豆(SA)培養(yǎng)基，其具體配方參照文獻(xiàn)[16]。

1.1.2 室內(nèi)毒力試驗(yàn)殺菌劑 供試殺菌劑包括：98%咪鮮胺原藥、99%代森錳鋅原藥、97%多菌靈原藥、96%嘧菌酯原藥和98%百菌清原藥，青島翰生生物科技股份有限公司；97%丙環(huán)唑原藥、98%戊唑醇原藥、97%甲基硫菌靈原藥、96%烯唑醇原藥和97%腈菌唑原藥，陜西上格之路生物科學(xué)有限公司。

1.1.3 田間防效試驗(yàn)殺菌劑 供試殺菌劑包括：80%代森錳鋅可濕性粉劑，利民化工股份有限公司； 80%戊唑醇可濕性粉劑，陜西先農(nóng)生物科技有限公司；250 g/L嘧菌酯懸浮劑，北京穎泰嘉和生物科技股份有限公司；25%咪鮮胺乳油，江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司。

1.2 黃帝陵側(cè)柏葉枯病病原菌的分離培養(yǎng)

于2014年9月在陜西省延安市黃陵縣橋山黃帝陵景區(qū)采集側(cè)柏葉枯病病害材料，采用組織分離培養(yǎng)法對(duì)側(cè)柏葉枯病病原進(jìn)行分離培養(yǎng)。具體操作過(guò)程如下：在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將患病葉片洗凈，切取病健交界處4～5 mm葉片小塊，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% NaClO溶液消毒2 min，再用體積分?jǐn)?shù)75%酒精消毒1 min，無(wú)菌水沖洗3次后用滅菌濾紙吸去多余水分，將其置于PDA培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察[15]。當(dāng)有病原物從病葉小塊邊緣長(zhǎng)出時(shí)，采用無(wú)菌鑷子小心挑取并轉(zhuǎn)移至新配制的PDA平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，共獲得2種病原菌，將其分別命名為PO-LBP1和PO-LBP2。純化后的病原菌于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 黃帝陵側(cè)柏葉枯病病原菌的回接試驗(yàn)

采用柯赫氏(Koch’s)法則對(duì)分離所得病原物進(jìn)行回接試驗(yàn)驗(yàn)證。

1.3.1 病原菌孢子懸浮液制備 分別將分離保存的病原菌菌株P(guān)O-LBP1和PO-LBP2接種于PDA平板上活化，待菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)平板(約5 d)，在平板中依次加入5 mL無(wú)菌水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%吐溫80洗脫孢子，然后用滅菌的紗布過(guò)濾，配制孢子懸浮液(濃度1×106mL-1)，于4 ℃保存待用。

1.3.2 接 種 將側(cè)柏苗木種植于花盆中定期澆水。用刷子刷側(cè)柏枝條，并用大頭針刺傷側(cè)柏葉，每片小針葉刺傷6～8個(gè)微傷口，隨后用毛刷將PO-LBP1和PO-LBP2孢子懸浮液分別或混合接種到側(cè)柏枝條上，套袋隔離，并在塑封袋里放入浸濕的棉花保濕，以無(wú)菌水為對(duì)照。每處理10株，每株接種5個(gè)枝條。接種7 d后觀察記錄側(cè)柏枝條的發(fā)病情況。

1.3.3 病原菌的分離與培養(yǎng) 從發(fā)病葉片的病健交界處取樣，采用1.2節(jié)的方法進(jìn)行病原菌的再分離純化培養(yǎng)，并對(duì)分離到的菌株進(jìn)行鑒定。

1.4 黃帝陵側(cè)柏葉枯病病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

將分離純化的病原菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，觀察記錄其菌落形態(tài)，進(jìn)一步采用光學(xué)顯微鏡觀察其菌絲和孢子形態(tài)并拍照。根據(jù)其真菌菌落形態(tài)、菌絲和孢子的形態(tài)特征，對(duì)其分類地位進(jìn)行初步鑒定[17-18]。

1.5 黃帝陵側(cè)柏葉枯病病原菌的分子生物學(xué)鑒定

采用CTAB法[15]進(jìn)行病原物DNA的提取，將提取的DNA樣品放置于-20 ℃冰箱備用。

采用真菌rDNA-ITS、18S rDNA和β-tubulin基因?qū)Ψ蛛x到的側(cè)柏葉枯病菌菌株進(jìn)行分子鑒定。rDNA-ITS PCR擴(kuò)增引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；18S rDNA PCR擴(kuò)增引物為NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)和NS8(5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′)；β-tubulin基因PCR擴(kuò)增引物為BT1(5′-GGTAACCAAATC-GGTGCTGCTTTC-3′)和BT2(5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′)。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增總體系為25 μL：10×PCR緩沖液2.5 μL，正、反向引物(10 μmol/mL)各1 μL，DNA模板1 μL，MgCl2溶液(2 mmol/L)1.5 μL，dNTP混合物2 μL，TaqDNA聚合酶 0.2 μL，雙蒸水15.8 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次； 72 ℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行ITS測(cè)序，將rDNA-ITS、18S rDNA和β-tubulin擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)儲(chǔ)存，采用MEGA 7.0軟件對(duì)ITS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行編輯及拼接，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)與近源物種進(jìn)行BLAST，選取同源性高的序列進(jìn)行同源性分析，采用Neighbor-joining方法建立側(cè)柏葉枯病菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，明確其分類地位[15]。

1.6 黃帝陵側(cè)柏葉枯病病原菌的生物學(xué)特性研究

采用不同培養(yǎng)基(PDA、PSA、WA、CA、SDAY、Czapek、PPDA、SA)研究側(cè)柏葉枯病病原菌的生物學(xué)特性。首先將病原菌接種于PDA培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)5 d，待菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后用滅菌打孔器制備菌餅(直徑=4 mm)，隨后接種在不同培養(yǎng)基平板上，置于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)，然后分別于接種后3，5，7，9 d測(cè)量菌落直徑，計(jì)算病原菌在不同培養(yǎng)基上的平均生長(zhǎng)速率(mm/d)，比較不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌落生長(zhǎng)的影響。

菌落生長(zhǎng)速率=(菌落直徑-4)/生長(zhǎng)天數(shù)。

1.7 殺菌劑對(duì)黃帝陵側(cè)柏葉枯病病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

采用帶毒平板法[19]測(cè)定供試10種殺菌劑對(duì)側(cè)柏葉枯病菌菌落生長(zhǎng)的抑制作用。將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)了5 d的側(cè)柏葉枯病病原菌菌落，用無(wú)菌打孔器于靠近菌落邊緣同一個(gè)圓周上制備菌餅(直徑4 mm)，接種到含有不同濃度殺菌劑的PDA培養(yǎng)基平板上，每皿接種1個(gè)菌餅，25 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測(cè)定各處理菌落直徑，以無(wú)菌水為對(duì)照，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)4次，計(jì)算抑菌率(%)，抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%。

以殺菌劑質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，抑菌率幾率值為縱坐標(biāo)(Y)，得出殺菌劑的毒力回歸方程，并計(jì)算有效中濃度(median effective concentration，EC50)[20]。

1.8 殺菌劑對(duì)黃帝陵側(cè)柏葉枯病的田間防效測(cè)定

1.8.1 施藥濃度設(shè)置 試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理，分別是80%代森錳鋅可濕性粉劑600倍液、80%戊唑醇可濕性粉劑750倍液、250 g/L嘧菌酯懸浮劑1 250倍液處理、25%咪鮮胺乳油3 000倍液、空白對(duì)照(噴施清水)。

1.8.2 田間試驗(yàn)方案 試驗(yàn)地點(diǎn)為黃帝陵景區(qū)西側(cè)的側(cè)柏幼樹(shù)林，共選擇2塊樣地，樹(shù)齡均為7～10 年，樹(shù)高4～6 m。每塊樣地的田間試驗(yàn)小區(qū)隨機(jī)排列，每小區(qū)15～20株側(cè)柏，每處理重復(fù)4次，每塊樣地共20個(gè)小區(qū)。樣地一發(fā)病較重，病情指數(shù)為40.47，于5月上旬開(kāi)始施藥，之后間隔10～14 d施藥1次，共施藥4次。樣地二發(fā)病較輕，病情指數(shù)為37.85，于6月上旬開(kāi)始施藥，之后間隔10～14 d施藥1次，共施藥4次。采用機(jī)動(dòng)噴藥機(jī)械全株莖葉均勻噴霧。噴液量以均勻噴濕葉片正反面、有藥液下滴為宜，每株樹(shù)噴液量約2 L。

1.8.3 防治效果的計(jì)算 分別于施藥前、第2次施藥后10 d及第4次施藥后10 d調(diào)查樣地的病害發(fā)生情況。每小區(qū)調(diào)查8棵側(cè)柏樹(shù)，在每棵樹(shù)的東、西、南、北4個(gè)方向分別固定調(diào)查5個(gè)10 cm左右小枝，按病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄小枝上葉片的發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果[13]。側(cè)柏葉枯病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考王瑜等[21]對(duì)葉斑病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，具體為：0級(jí).無(wú)病斑；1級(jí).病葉面積占總?cè)~面積1%～10%；2級(jí).病葉面積占總?cè)~面積10%～20%；3級(jí).病葉面積占總?cè)~面積20%～30%；4級(jí).病葉面積占總?cè)~面積30%～40%；5級(jí).病葉面積占總?cè)~面積40%～50%；6級(jí).病葉面積占總?cè)~面積50%～60%；7級(jí).病葉面積占總?cè)~面積60%～70%；8級(jí).病葉面積占總?cè)~面積70%～80%；9級(jí).病葉面積占總?cè)~面積的80%以上。

發(fā)病率=發(fā)病小枝數(shù)/調(diào)查總小枝數(shù)×100%；

病情指數(shù)(DI)=∑(各級(jí)發(fā)病小枝數(shù))/調(diào)查總小枝數(shù)最高級(jí)代表值×100；

防治效果=(DI(CK)―DI(CH))/DI(CK)×100%。

式中：DI(CK)為對(duì)照區(qū)病情指數(shù)，DI(CH)為藥劑處理區(qū)病情指數(shù)。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21軟件計(jì)算毒力回歸方程和EC50值，用Duncan’s新復(fù)極差法(DMRT)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃帝陵側(cè)柏葉枯病病原菌的分離與培養(yǎng)

采用組織分離培養(yǎng)法對(duì)側(cè)柏葉枯病病原進(jìn)行分離、純化、培養(yǎng)，獲得兩類具有不同形態(tài)結(jié)構(gòu)的病原菌，將其分別命名為PO-LBP1和PO-LBP2。PO-LBP1和PO-LBP2的菌落形態(tài)如圖1和圖2所示。

2.2 黃帝陵側(cè)柏葉枯病病原菌的回接試驗(yàn)結(jié)果

將分離物PO-LBP1和PO-LBP2分別單獨(dú)或者混合接種于盆栽側(cè)柏枝條上，接種7 d后觀察，側(cè)柏葉片褪綠、出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)或壞死斑，發(fā)病癥狀與田間發(fā)病癥狀相同，發(fā)病率均為100%;對(duì)照葉片健康不發(fā)病?；旌辖臃N的發(fā)病情況較單獨(dú)接種嚴(yán)重。根據(jù)柯赫氏法則，對(duì)發(fā)病葉片和對(duì)照葉片進(jìn)行病原菌分離，所有發(fā)病部位均分離得到與接種病原菌菌落和孢子形態(tài)一致的分離物，而對(duì)照葉片上未分離到接種菌。因此，可以明確引起側(cè)柏葉枯病的病原菌為PO-LBP1和PO-LBP2。

A.菌落正面;B.菌落背面

2.3 黃帝陵側(cè)柏葉枯病病原菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 根據(jù)PO-LBP1和PO-LBP2的菌落形態(tài)及其孢子與形態(tài)(圖3)，初步判斷PO-LBP1歸屬于鏈格孢屬Alternaria，PO-LBP2歸屬于擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis。

圖3 黃帝陵側(cè)柏葉枯病病原菌PO-LBP1(A)和PO-LBP2(B)的孢子形態(tài)(×40)

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 結(jié)合rDNA-ITS和18S rDNA測(cè)序結(jié)果，分別獲得PO-LBP1的ITS和18S rDNA序列，并將其提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得PO-LBP1的ITS序列登錄號(hào)為MK795966，18S rDNA序列登錄號(hào)為MN122010。通過(guò)BLAST分析，發(fā)現(xiàn)GenBank 中與菌株P(guān)O-LBP1 ITS序列同源性達(dá) 99%的菌株大部分為互隔交鏈孢(Alternariaalternata)。采用MEGA軟件對(duì)其ITS序列進(jìn)行比對(duì)分析，并建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4)。進(jìn)一步分析菌株P(guān)O-LBP1的18S rDNA，得到堿基序列約為 520 bp，堿基序列通過(guò) NCBI 進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示，同源性為 99%的菌株僅有互隔交鏈孢，PO-LBP1的18S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖5所示。根據(jù)PO-LBP1的ITS和18S rDNA序列分析結(jié)果，可以將PO-LBP1鑒定為互隔交鏈孢Alternariaalternata。

采用rDNA-ITS測(cè)序方法對(duì)PO-LBP2進(jìn)行分子鑒定，獲得PO-LBP2的ITS序列在NCBI登錄號(hào)為MK795967，通過(guò)NCBI進(jìn)行BLAST分析，GenBank中與PO-LBP2同源性達(dá)到99%的菌株大部分為擬盤多毛孢(Pestalotiopsissp.)，其對(duì)應(yīng)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖4所示。進(jìn)一步采用β-tubulin測(cè)序結(jié)果分析，將PO-LBP2的β-tubulin基因序列提交至NCBI，獲得登錄號(hào)為MN122011，并在NCBI中進(jìn)行BLAST分析。發(fā)現(xiàn)PO-LBP2的β-tubulin基因序列與芍藥生擬盤多毛孢(Pestalotiopsispaeoniicola)β-tubulin基因序列具有最高的同源性(99.79%)和覆蓋率(99%)，其對(duì)應(yīng)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖6所示。因此，結(jié)合ITS序列和β-tubulin序列分析，將PO-LBP2鑒定為芍藥生擬盤多毛孢P.paeoniicola。

圖4 黃帝陵側(cè)柏葉枯病病原菌PO-LBP1和PO-LBP2的ITS系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 黃帝陵側(cè)柏葉枯病病原菌的生物學(xué)特性

本研究利用生長(zhǎng)速率法分析了8種不同培養(yǎng)基對(duì)互隔交鏈孢(A.alternata)和芍藥生擬盤多毛孢(P.paeoniicola)菌落生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7-A可知，最適合互隔交鏈孢生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為SA、PSA和PDA，其菌落的平均生長(zhǎng)速率分別為9.02，8.73和8.59 mm/d，且這3種培養(yǎng)基對(duì)互隔交鏈孢菌落生長(zhǎng)的影響差異不顯著，但均顯著高于其他5種培養(yǎng)基?；ジ艚绘滄咴赪A培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最緩慢(3.56 mm/d)，可能是因?yàn)閃A培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分不全所致。由圖7-B可知， 芍藥生擬盤多毛孢在PPDA、SA、PSA和SDAY培養(yǎng)基上平均生長(zhǎng)速率均較快，分別達(dá)到了11.29，11.40，11.61和11.63 mm/d，且芍藥生擬盤多毛孢在這4種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率差異不顯著。盡管這4種培養(yǎng)基成分有所差異，但均能滿足芍藥生擬盤多毛孢生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求，故芍藥生擬盤多毛孢在這4種培養(yǎng)基上均能很好地生長(zhǎng)。芍藥生擬盤多毛孢在CA、PDA和Czapek培養(yǎng)基上生長(zhǎng)也較好，其菌落平均生長(zhǎng)速率分別為9.15，8.87和8.54 mm/d；在WA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最緩慢。綜合側(cè)柏葉枯病菌互隔交鏈孢和芍藥生擬盤多毛孢在8種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，可以根據(jù)后續(xù)試驗(yàn)要求選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基對(duì)側(cè)柏葉枯病菌進(jìn)行培養(yǎng)。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下圖同

2.5 殺菌劑對(duì)黃帝陵側(cè)柏葉枯病病原菌的室內(nèi)毒力

研究殺菌劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力作用，能夠?yàn)椴『μ镩g防治提供重要的指導(dǎo)依據(jù)。本研究擬通過(guò)分析10種不同殺菌劑對(duì)側(cè)柏葉枯病菌互隔交鏈孢和芍藥生擬盤多毛孢的室內(nèi)毒力作用，篩選出對(duì)側(cè)柏葉枯病菌具有顯著抑制作用的殺菌劑。由表1和表2可知，戊唑醇和咪鮮胺對(duì)側(cè)柏葉枯病菌互隔交鏈孢和芍藥生擬盤多毛孢均具有較強(qiáng)的抑菌作用，其對(duì)互隔交鏈孢的EC50值分別為1.13和1.58 mg/L，對(duì)芍藥生擬盤多毛孢的EC50值分別為1.38和1.44 mg/L，其余殺菌劑表現(xiàn)出不同程度的中等抑菌作用。

表1 殺菌劑對(duì)黃帝陵側(cè)柏葉枯病病原菌互隔交鏈孢的抑菌活性

表2 殺菌劑對(duì)黃帝陵側(cè)柏葉枯病病原菌芍藥生擬盤多毛孢的抑菌活性

2.6 殺菌劑對(duì)黃帝陵側(cè)柏葉枯病的田間防治效果

通過(guò)室內(nèi)毒力試驗(yàn)，篩選出對(duì)側(cè)柏葉枯病菌互隔交鏈孢和芍藥生擬盤多毛孢均具有良好抑菌效果的殺菌劑依次為戊唑醇、咪鮮胺、代森錳鋅、多菌靈、嘧菌酯和甲基硫菌靈。在此基礎(chǔ)上，研究了戊唑醇、咪鮮胺、代森錳鋅和嘧菌酯對(duì)側(cè)柏葉枯病的田間防治效果，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可知，80%戊唑醇可濕性粉劑750倍液、25%咪鮮胺乳油3 000倍液、80%代森錳鋅可濕性粉劑600倍液和250 g/L嘧菌酯懸浮劑1 250倍液均對(duì)側(cè)柏葉枯病有一定的防治效果，其防治效果總體表現(xiàn)為80%戊唑醇可濕性粉劑750倍液>25%咪鮮胺乳油3 000倍液>80%代森錳鋅可濕性粉劑600倍液>250 g/L嘧菌酯懸浮劑1 250倍液，說(shuō)明選用的4種殺菌劑對(duì)側(cè)柏葉枯病的防治效果穩(wěn)定。第2次施藥10 d后，80%戊唑醇可濕性粉劑750倍液和25%咪鮮胺乳油3 000倍液對(duì)側(cè)柏葉枯病的防治效果平均值分別達(dá)到60%和50%左右；第4次施藥10 d后，其防治效果平均值可達(dá)85%左右。

圖8 供試藥劑對(duì)黃帝陵側(cè)柏葉枯病的田間防治效果

3 討 論

側(cè)柏葉枯病是我國(guó)側(cè)柏上一種最主要的常見(jiàn)病害，早在1984年和1992年，蔣金升等[10]和戴雨生等[11]分別對(duì)側(cè)柏葉枯病進(jìn)行了研究。本團(tuán)隊(duì)前期通過(guò)形態(tài)學(xué)方法明確了引起黃帝陵側(cè)柏葉枯病的病原為擬盤多毛孢(Pestalotiopsissp.)和鏈格孢(Alternariasp.)[13]。被命名為同種名稱的植物病害，由于寄主植物生境不同會(huì)導(dǎo)致引起該病害的病原物存在較大差異。本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)和ITS-rDNA、18S rDNA和β-tubulin序列分析，將側(cè)柏葉枯病菌PO-LBP1和PO-LBP2分別鑒定到種的水平，其中PO-LBP1為互隔交鏈孢(A.alternata)，PO-LBP2為芍藥生擬盤多毛孢(P.paeoniicola)。

有關(guān)芍藥生擬盤多毛孢(P.paeoniicola)的研究還較少，2009年該菌首次作為病原菌被報(bào)道，其能引起北美芍藥(Paeoniasuffruticosa)枝枯病，其分生孢子大小為(24.0±1.8) μm×(7.1±0.5) μm，有2～4根端生附屬絲，附屬絲長(zhǎng)度為(26.6±4.1) μm[18]。本研究中，引起側(cè)柏葉枯病的病原菌PO-LBP2，其分生孢子大小及其附屬絲的數(shù)目長(zhǎng)度均與該報(bào)道相符合，從形態(tài)學(xué)印證了PO-LBP2為芍藥生擬盤多毛孢。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)中國(guó)南方植物中的擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)的多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，在羅漢松(Podocarpusnagi)中也發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生真菌芍藥生擬盤多毛孢(P.paeoniicola)[22]。本研究中，芍藥生擬盤多毛孢(P.paeoniicola)作為病原物引起了側(cè)柏葉枯病，該發(fā)現(xiàn)揭示了芍藥生擬盤多毛孢的新寄主——側(cè)柏，對(duì)深入研究芍藥生擬盤多毛孢的系統(tǒng)進(jìn)化和多樣性具有重要的意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，黃帝陵側(cè)柏葉枯病既能由互隔交鏈孢或芍藥生擬盤多毛孢單獨(dú)侵染引發(fā)，也能由這2種病原復(fù)合侵染發(fā)病。復(fù)合侵染現(xiàn)象在植物病毒病害中報(bào)道較多，如番茄退綠病毒ToCV和番茄黃化曲葉病毒TYLCV能復(fù)合侵染誘發(fā)番茄病毒病，并且二者在復(fù)合侵染過(guò)程中出現(xiàn)了互作和基因變異情況[23]；姜珊珊等[24]采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)了山東甘薯病毒的種類及侵染類型，發(fā)現(xiàn)了33種復(fù)合侵染組合；錢恒偉等[25]在進(jìn)行甘薯莖枯病研究中，發(fā)現(xiàn)該病是由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和極細(xì)鏈格孢(Alternariatenuissima)復(fù)合侵染引起的，而且發(fā)現(xiàn)復(fù)合侵染較單一接種的發(fā)病率高，發(fā)病早，致病性強(qiáng)。本研究中，互隔交鏈孢和芍藥生擬盤多毛孢復(fù)合侵染黃帝陵側(cè)柏比單獨(dú)接種時(shí)的發(fā)病率高，發(fā)病程度更為嚴(yán)重，說(shuō)明這2種病原可能在復(fù)合侵染過(guò)程中存在一定的互作。本研究還發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)接種互隔交鏈孢時(shí)，黃帝陵側(cè)柏葉片出現(xiàn)癥狀的時(shí)間比單獨(dú)接種芍藥生擬盤多毛孢早，葉片的褪綠程度高于單獨(dú)接種芍藥生擬盤多毛孢?？底域v等[26]研究報(bào)道，鏈格孢菌能穿透破壞寄主細(xì)胞的細(xì)胞壁， 并且分泌纖維素酶和果膠酶等降解酶消化細(xì)胞壁，對(duì)植物造成一定的損傷。因此，推測(cè)黃帝陵側(cè)柏葉枯病病原菌A.alternate能為另一種病原菌P.paeoniicola的快速侵入提供有利條件，但兩者發(fā)生復(fù)合侵染的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

鏈格孢屬(Alternaria)能引起多種植物病害，針對(duì)不同種鏈格孢引起的植物病害，其防治藥劑篩選結(jié)果差異也較大，如對(duì)由極細(xì)鏈格孢(A.tenuissima)引起的刺五加黑斑病具有較好防治效果的殺菌劑為氟菌唑、苯醚甲環(huán)唑、菌核凈、多菌靈、嘧霉胺、丙環(huán)唑和吡唑醚菌酯[27-28]；對(duì)由A.solani引起的番茄早疫病具有較強(qiáng)防治作用的殺菌劑為啶菌噁唑[27]；對(duì)由A.alternata引起的煙草赤星病的有效藥劑為多抗霉素和菌核凈[29-30]；對(duì)由擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis引起的核桃樹(shù)上的真菌病害較為有效的藥劑為苯醚甲環(huán)唑、腈菌唑和甲基托布津[31]；對(duì)引起棕櫚樹(shù)葉斑病的病原菌(Pestalotiopsispalmarum)具有較強(qiáng)抑菌作用的殺菌劑為甲基托布津、代森錳鋅、多菌靈、撲海因和腈菌唑[32]。由此可看出，不同植物病原對(duì)同種農(nóng)藥的敏感性存在差異，同種植物病原在不同環(huán)境條件下或不同寄主植物上對(duì)農(nóng)藥的敏感性存在差異。本研究開(kāi)展了黃帝陵側(cè)柏葉枯病發(fā)生情況監(jiān)測(cè)及殺菌劑田間防效試驗(yàn)，篩選出對(duì)側(cè)柏葉枯病具有良好防治效果的藥劑為戊唑醇和咪鮮胺，其防效可達(dá)80%以上。本研究田間調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)側(cè)柏長(zhǎng)勢(shì)旺盛時(shí)發(fā)病較輕或不發(fā)??；當(dāng)側(cè)柏生長(zhǎng)衰弱時(shí)，該病迅速發(fā)生并且擴(kuò)展較快。由此可知，側(cè)柏葉枯病菌是弱寄生性病原物，應(yīng)加強(qiáng)側(cè)柏生長(zhǎng)管理，通過(guò)改善樹(shù)勢(shì)減輕葉枯病的發(fā)生，對(duì)黃帝陵側(cè)柏葉枯病的防控應(yīng)結(jié)合栽培管理措施和化學(xué)防治。

4 結(jié) 論

黃帝陵側(cè)柏葉枯病可由互隔交鏈孢(Alternariaalternata)和芍藥生擬盤多毛孢(Pestalotiopsispaeoniicola)單獨(dú)或復(fù)合侵染引起；側(cè)柏是芍藥生擬盤多毛孢的新寄主；互隔交鏈孢和芍藥生擬盤多毛孢的最佳生長(zhǎng)培養(yǎng)基為黃豆培養(yǎng)基和馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基；對(duì)黃帝陵側(cè)柏葉枯病具有較好防治效果的殺菌劑為戊唑醇和咪鮮胺。