丁酸的生產(chǎn)方法及在腸道中的生理功能研究進展

岳瑩雪,王玉琦,閆芬芬,李 娜,李柏良,霍貴成

(東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

丁酸又稱酪酸,是一種短鏈脂肪酸,無色至淺黃色透明油狀液體,具有濃烈干酪般不愉快氣味,廣泛應(yīng)用于工業(yè)化學品、動物飼料添加劑、食品和藥品等領(lǐng)域,每年全球市場量超過8×104噸[1]。丁酸作為一種重要的精細化工原料,主要用于制造丁酸纖維素和合成丁酸酯。合成丁酸的化學方法主要有3種:正丁醛氧化法、正丁醇氧化法及丙烯羰基化法。此外,許多從廢水、土壤、受污染的乳制品和食品、肉類和動物消化系統(tǒng)中分離的菌株適合生產(chǎn)生物丁酸,目前共報道了超過10種產(chǎn)丁酸的菌株(如梭菌屬、丁弧菌屬、丁桿菌屬、真細菌屬、大梭桿菌屬和八疊球菌屬)[2]。雖然生物合成方法生產(chǎn)丁酸的生產(chǎn)率低,丁酸回收成本高[3],但消費者更喜歡天然來源的丁酸,尤其是在食品添加劑和藥品領(lǐng)域。隨著食品工業(yè)副產(chǎn)品供應(yīng)量的增加,消費者對丁酸生產(chǎn)的有機天然產(chǎn)品的需求增加,通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的丁酸在食品添加劑、藥品和防腐劑等方面發(fā)展趨勢較好。在食品領(lǐng)域中丁酸還可被用作乳酸工業(yè)中的酸或作為食物酯形式的添加劑來增加水果香味[4]。在其他方面丁酸被視為未來再生的綠色化學品之一,可以替代化石燃料使用,并減少與健康和環(huán)境有關(guān)的問題,包括溫室氣體排放,全球變暖和氣候變化。同時,丁酸還具有促進健康的作用,如為腸上皮細胞提供能量并且保護腸黏膜屏障中的機械和化學屏障[5]。人和動物胃腸道中都有大量產(chǎn)丁酸的微生物,這些微生物及其發(fā)酵產(chǎn)物丁酸對宿主有著重要的意義,具有維護腸道健康、增強機體免疫、誘導腫瘤細胞凋亡、抗氧化等多重生理功能。因此,深入研究丁酸生產(chǎn)的方法及其調(diào)節(jié)腸道的生理功能具有重要的意義。本文主要綜述了生產(chǎn)丁酸的方法以及其在腸道中的生理功能,為進一步研究丁酸生理功能的作用機制提供理論參考。

1 丁酸的生產(chǎn)方法

1.1 丁酸的化學合成

1.1.1 正丁醛氧化法 正丁醛氧化法是以正丁醛為原料,以空氣或氧氣為氧化劑,在有無催化劑的情況下均可完成的一種反應(yīng)。韓奎武等[6]通過分子氧液相氧化利用正丁醛生產(chǎn)正丁酸,在不使用催化劑、最佳反應(yīng)溫度為55～60 ℃、反應(yīng)時間6～7 h、氧氣流量10.8～11.8 L/h和反應(yīng)液中過氧化物質(zhì)量分數(shù)1.4%的條件下,得到反應(yīng)液中正丁酸質(zhì)量分數(shù)為82%～86%。反應(yīng)原理為:CH3CH2CH2CHO+O2→CH3CH2CH2COOOH;CH3CH2CH2CHO+CH3CH2CH2COOOH→2CH3CH2CH2COOH。李興存等[7]研究了塔式反應(yīng)器的氧化反應(yīng)過程,在氧醛摩爾比0.75～0.875、反應(yīng)溫度50～60 ℃、催化劑與正丁醛的質(zhì)量比0.1%～0.2%條件下反應(yīng)3 h左右,正丁醛的轉(zhuǎn)化率在99.5%以上,而正丁酸的選擇性超過了95.0%。其反應(yīng)原理主反應(yīng)為CH3(CH2)2CHO+1/2O2→CH3(CH2)2COOH,副反應(yīng)為CH3(CH2)2CHO+2O2→CH3CH2COOH+CO2+H2O;CH3(CH2)2CHO+O2→CH3CH2CH2OH+CO2;CH3(CH2)2COOH+CH3(CH2)2OH CH3(CH2)2CO2(CH2)2CH3+H2O。試驗流程如圖1所示。

圖1 正丁醛氧化制備正丁酸試驗流程圖

1.1.2 正丁醇氧化法 楊長安等[8]采用新工藝將TS分子篩作為催化劑,H2O2作為氧化劑,催化氧化正丁醇生產(chǎn)正丁酸,得到最佳生產(chǎn)工藝條件為:W(TS)/n(正丁醇)為6.1 g/mol,n(正丁醇):n(H2O2,30%)為1∶3,反應(yīng)溫度為90 ℃、反應(yīng)時間為12 h,此時正丁醇的轉(zhuǎn)化率可達100%,選擇性在99.5%以上。

1.1.3 丙烯羰基化法 丙烯羰基化法以丙烯與合成氣為原料,其工藝分為兩步進行:首先丙烯羰基化生成丁醛,而后在丁醛生成塔中通入氧氣使丁醛氧化產(chǎn)生丁酸,但該法在生產(chǎn)丁酸的過程中會產(chǎn)生一種副產(chǎn)物異丁酸。若以SnCl2、CoCl2和FeCl3的Pd(PPh3)Cl2為催化劑,則可提高生產(chǎn)正丁酸的選擇性以抑制副產(chǎn)物的生成[9]。

其中,正丁醛氧化法具有原料單一、工藝路線簡單、生產(chǎn)控制方便、產(chǎn)品收率較高等優(yōu)點。正丁醇氧化法具有高效、清潔、成本低的特點,并且催化劑易于回收重復利用,具有廣闊的應(yīng)用和市場前景。因此采用此兩種方法優(yōu)勢較大,其中正丁醛氧化法應(yīng)用較早。相比前兩種方法,丙烯羰基合成法由于生產(chǎn)投資較大,在生產(chǎn)過程中存在中間產(chǎn)物正丁醛,隨著工業(yè)中普遍應(yīng)用正丁醛氧化制正丁酸,丙烯羰基合成法已逐步被淘汰。

1.2 丁酸的生物合成

1.2.1 梭菌合成丁酸 在幾種厭氧梭菌(丙酮丁醇梭菌、酪酸梭菌、拜氏梭菌)發(fā)酵過程中,丁酸為主要終產(chǎn)物[10]。其中酪酸梭菌具有營養(yǎng)需求簡單、丁酸產(chǎn)率高以及對毒性代謝物有更好耐受性等特點,因此被證明是丁酸工業(yè)生產(chǎn)中最具前途的梭菌之一[11]。用葡萄糖和木糖作為碳源,兩碳源均經(jīng)反應(yīng)生成丙酮酸,最終生成主要產(chǎn)物丁酸,其中會伴隨少量乳酸、乙酸、丁醇的產(chǎn)生,在梭菌中合成丁酸的具體代謝途徑如圖2所示。有研究報道[12],酪丁酸梭菌通過刪除乙酸激酶基因,構(gòu)建了一個名為PAK-Em的突變體,在纖維床生物反應(yīng)器中的固定化細胞發(fā)酵系統(tǒng)的細胞固定化發(fā)酵下,最終的丁酸濃度和丁酸產(chǎn)量分別達到50.1和0.45 g/g的較高水平。

圖2 以葡萄糖和木糖為碳源的梭菌中丁酸合成的代謝途徑。

微生物法生產(chǎn)丁酸的反應(yīng)途徑還可利用基因組分析進行進一步研究,目前,已知酪丁酸梭菌ATCC 25755的完整基因組序列[13],使研究人員能夠全面了解丁酸生產(chǎn)過程中的微生物生理反應(yīng)。對酪丁酸梭菌的全基因組和蛋白質(zhì)組學進行分析,將促進以代謝工程法生產(chǎn)丁酸的發(fā)展[14]。Chi等[15]研究發(fā)現(xiàn),以梭菌ATCC 27405和梭菌ATCC 49875共培養(yǎng)分批發(fā)酵稻草,丁酸產(chǎn)量高達33.9 g/L。Song等[16]用褐藻和裙帶菜生產(chǎn)丁酸,在適當?shù)臈l件下酪丁酸梭菌的丁酸濃度達到11 g/L。Lee等[17]研究發(fā)現(xiàn),一種含有半乳糖作為主要碳水化合物的紅藻也被用于生產(chǎn)丁酸,當使用經(jīng)酸預處理的紅藻水解產(chǎn)物時,梭菌 S1的丁酸產(chǎn)量為4.83 g/L。因此,梭菌是生產(chǎn)丁酸重要的微生物。

1.2.2 其它生物方法合成丁酸 目前,葡萄糖、糖蜜、玉米和小麥等已被廣泛用于丁酸的生產(chǎn)[18]。然而,糖基原料是食品供應(yīng)或動物飼料中的主要成分,用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)產(chǎn)品,對于丁酸的大規(guī)模生產(chǎn)是不可持續(xù)的。因此,需要大量與食物無關(guān)的替代原料。目前已經(jīng)有各種材料,包括食品工業(yè)、生物柴油工業(yè)的副產(chǎn)品(乳清、甘油等)和天然未利用生物質(zhì)(淀粉、木質(zhì)纖維素生物質(zhì)、藻類生物質(zhì)等)被視為生產(chǎn)丁酸的替代原料。乳清因含有糖、蛋白質(zhì)和其它細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì),是一種適合生產(chǎn)丁酸的原料。當以乳清為底物添加5 g/L酵母提取物時,丁酸發(fā)酵的性能明顯增強,與沒有添加酵母提取物的發(fā)酵相比,最終丁酸的濃度提高了1.88倍[19]。在以粗甘油為碳源、非無菌的條件下,Varrone等[20]研究了發(fā)酵混合微生物培養(yǎng)產(chǎn)丁酸的性能,最終丁酸的生產(chǎn)水平高達0.46 g(L·h),與初始的結(jié)果相比較提高了2.7倍。Reid等[21]直接利用淀粉生物質(zhì),如馬鈴薯淀粉和支鏈淀粉發(fā)酵合成丁酸。當使用木糖(14 g/L)、纖維素(14 g/L)和半乳糖(14 g/L)為碳源時,利用一種噬熱放線菌muS-1產(chǎn)生了較高水平的丁酸(70.4 g/L)[22]。以玉米粉與蒸餾水配制經(jīng)糊化和糖化處理的發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵溶劑型丙酮丁醇梭菌,在產(chǎn)酸過程中可產(chǎn)生丁酸和乙酸,而主要的發(fā)酵產(chǎn)物為丙酮、丁醇和乙醇[23]。同時,也有研究表明,乳酸菌在含魚類的MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵,利用高效液相色譜法可檢測到丁酸的產(chǎn)生[24]。

化學合成法為生產(chǎn)丁酸常用的方法,丙烯羰基合成法生產(chǎn)丁酸成本較高并且有副反應(yīng)產(chǎn)生,產(chǎn)率降低,純度不高。而正丁醛氧化法與新型工藝正丁醇氧化法則高效成本低,值得開發(fā)研究。同時,生物合成法生產(chǎn)的丁酸更加天然,應(yīng)用于食品中更加健康安全。

2 丁酸的腸道生理功能

2.1 丁酸對腸道微生態(tài)及腸道黏膜的影響

2.1.1 丁酸對腸道微生態(tài)的影響 腸道內(nèi)的丁酸菌可合成腸道丁酸,在生物合成反應(yīng)中利用的主要生物酶為丁酰輔酶A和乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶。生物酶以乳酸為底物,避免了腸道內(nèi)乳酸菌生物代謝積累過量的乳酸對腸黏膜造成破壞,從而維持腸道內(nèi)微生態(tài)的平衡。酪酸梭菌產(chǎn)生丁酸,具有調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群平衡并重新建立平衡腸道微生態(tài)環(huán)境的功能。王愛華[25]在斷奶仔豬、仔雞的飼糧中加入丁酸鈉后,發(fā)現(xiàn)其腸道細菌中乳酸桿菌的比例增大,大腸桿菌的比例減小,沙門氏菌對盲腸的感染率減少,即腸道菌群平衡有所改善。腸道微生態(tài)失調(diào)是腹瀉的主要原因之一,丁酸可促進有益微生物增殖并且抑制有害微生物繁殖,從而改善腸道微生態(tài)平衡,在丁酸被利用的同時,也促進了鈉、鉀和水等對止瀉有利物的吸收[26]。

2.1.2 丁酸對腸道黏膜的影響 丁酸一方面影響覆蓋于結(jié)腸上皮黏液中的粘蛋白和TFFs(三葉因子)來提高腸黏膜的屏障能力,另一方面影響結(jié)腸上皮的通透性,增加腸道的屏障能力,減少炎癥因子的產(chǎn)生,延緩潰瘍性結(jié)腸炎或其它炎癥。有試驗表明[27],丁酸鹽能夠刺激人類結(jié)腸細胞系(LS174T)產(chǎn)生粘蛋白MUC2,而MUC2基因表達的增加促進了黏蛋白MUC2合成,加強了對黏膜層的保護。SCFA(短鏈脂肪酸)滴注法[28]表明,丁酸具有修復腸道黏膜的作用。大鼠模型進一步證實,丁酸的確能減輕實驗性腸炎對黏膜的損傷[29]。Vieira等[30]給DSS(葡聚糖硫酸鈉)誘導發(fā)生結(jié)腸炎的小鼠口服丁酸以后,發(fā)現(xiàn)丁酸可到達結(jié)腸,并抑制免疫細胞激活以緩解黏膜病變,從而緩解炎癥損傷。Abdelqader等[31]研究了丁酸對熱應(yīng)激肉雞性能、腸道組織學變化、有益腸道細菌計數(shù)和恢復反應(yīng)的影響,發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激引起的腸道損傷與腸道相對重量的顯著減少有直接關(guān)系,這可能表明,丁酸通過直接刺激增殖或抑制腸上皮細胞細胞凋亡,對黏膜恢復發(fā)揮積極作用。

2.2 丁酸對腸炎的影響

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種嚴重影響人類健康的炎癥性腸道疾病,丁酸首先可激活GPRs(G蛋白偶聯(lián)受體),受體主要包括GPR43、GPR41和GPR109A,還可激活過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors gamma,PPARγ),從而激活其下游的信號通路,對炎癥因子表達、免疫細胞的分化和遷移產(chǎn)生影響。丁酸與GPR結(jié)合后,激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路,影響炎癥因子表達。其次,丁酸也可激活過氧化物酶體增殖物激活受體,促進緊密連接蛋白表達,保證腸道的屏障能力。最后,丁酸作為組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor,HDACI),還可以抑制NF-κB(核因子-κB)信號通路的激活、抑制炎癥因子的表達、促進T細胞凋亡和腸道抗菌肽的分泌[32],丁酸抑制潰瘍性結(jié)腸炎分子機制如圖3所示。Cox等[33]發(fā)現(xiàn),丁酸可通過Gpr43配體抑制由LPS(脂多糖)刺激的人單核細胞產(chǎn)生IL-1(白細胞介素-1)、腫瘤壞死因子、干擾素γ,且隨著丁酸濃度越大,對炎癥因子的抑制作用越強。敲除小鼠的GPR109A基因?qū)е卵装Y反應(yīng)加重,而丁酸的添加會使IL-6(白細胞介素-6)的表達量下降,IL-18(白細胞介素-18)的表達提高,同時促進了調(diào)節(jié)性T細胞的增殖。Singh等[34]研究發(fā)現(xiàn),GPR109A(由Niacr1編碼)是丁酸在結(jié)腸的受體,能夠促進結(jié)腸巨噬細胞和樹突細胞發(fā)揮抗炎癥作用,并且能夠使它們誘導調(diào)節(jié)性T細胞和產(chǎn)生IL-10(白細胞介素-10)的T細胞。另外,GPR109A在丁酸誘導結(jié)腸上皮細胞產(chǎn)生IL-18的過程中起著重要作用。上述研究證明,丁酸可以激活GPR影響炎癥因子如IL-1、IL-6、IL-10、IL-18等的表達,從而緩解腸道炎癥。由于調(diào)節(jié)性T細胞是有效的抗炎細胞,其產(chǎn)生與增殖一定程度對炎癥產(chǎn)生影響。

圖3 丁酸抑制潰瘍性結(jié)腸炎分子機制示意圖

2.3 丁酸對腸癌的影響

結(jié)直腸癌是指發(fā)生在人和動物大腸部位的惡性腫瘤,是一種最常見的惡性腫瘤。結(jié)直腸癌在癌癥發(fā)病率中排名第三,在全球癌癥死亡率中排名第四[35]。丁酸對結(jié)腸癌癥細胞的主要作用是通過抑制細胞增殖,從而誘導細胞凋亡和細胞周期的停滯。丁酸能夠誘導正常細胞隱窩基底細胞的增殖,提高健康組織的轉(zhuǎn)化和維護效率,抑制癌細胞隱窩表面(潛在的腫瘤發(fā)育位點)細胞的增殖[36]。Ogawa等[37]研究表明,丁酸菌的代謝產(chǎn)物丁酸能發(fā)揮抑制癌細胞增生的作用,也能抑制因表皮生長因子誘導的細胞增生,同時下調(diào)環(huán)氧合酶,進而抑制人腸道微血管內(nèi)皮細胞的血管生成,抑制癌細胞的生長。對人類結(jié)腸中丁酸鹽和G蛋白偶聯(lián)受體GPR109A之間的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn),丁酸鹽與GPR109A的結(jié)合可以誘導結(jié)腸癌細胞的凋亡[38]。Daroqui等[39]的研究顯示,丁酸鹽可通過改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)、修飾組蛋白,抑制人結(jié)腸癌細胞中原癌基因c-myc、細胞周期蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達,促進癌細胞凋亡。目前,丁酸抗腫瘤的理論已成功用于大腸癌的預防和潰瘍性結(jié)腸炎的治療中。

2.4 丁酸對腸道免疫調(diào)節(jié)的影響

在某種程度上,炎癥性腸病是由免疫混亂引起的,而丁酸類代謝產(chǎn)物直接影響宿主的免疫應(yīng)答,在調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎免疫混亂中起到重要作用。NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中處于中心地位,丁酸抑制NF-κB信號途徑和促進T細胞凋亡是其能夠治療UC(潰瘍性結(jié)腸炎)的重要特性。丁酸可以抑制趨化因子的表達、抑制白細胞遷移,從而緩解炎癥反應(yīng),體外試驗表明,丁酸可以通過GPR43受體誘導中性粒細胞遷移[40]。Kvale等[41]通過對體外結(jié)腸上皮細胞株HT-29的作用研究,認為丁酸促進白細胞抗原-1(HLA-1)的表達,與IL-4(白細胞介素-4)、TNF(腫瘤壞死因子)、ICAM-1(細胞黏附因子-1)的分泌有關(guān),而這些因子則可直接參與結(jié)腸細胞的免疫應(yīng)答。丁酸鹽可以通過誘導脾臟組織中PD-1/PD-L1信號通路的方式促進調(diào)節(jié)性T細胞的增殖,并在結(jié)腸組織中通過抑制巨噬細胞表面趨化因子受體和配體表達量的方式,對結(jié)腸組織中M1/M2型巨噬細胞數(shù)量的平衡進行調(diào)節(jié)[42],而M1/M2型巨噬從初始狀態(tài)分化成具有特定免疫模式的狀態(tài),進而分別介導了腸道內(nèi)各個類型免疫與炎癥反應(yīng)的平衡[43]。

丁酸作為一種短鏈脂肪酸對改善腸道微生態(tài)平衡、修復腸黏膜具有一定影響,對腸道疾病如腸炎、腸癌具有緩解作用,而對疾病的影響與丁酸對腸道的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。

3 結(jié)論與展望

由于在食品和藥物中生物基綠色添加劑的需求日益增加,丁酸的微生物發(fā)酵法現(xiàn)已成為替代化學合成的方法。但工業(yè)發(fā)酵丁酸生產(chǎn)需要廉價的原料、高效的工藝性能、高純度的產(chǎn)品和生產(chǎn)菌株的穩(wěn)健性。所以通過基因工程方法以及優(yōu)化發(fā)酵條件使丁酸發(fā)酵菌株產(chǎn)生高的丁酸產(chǎn)率有待研究。丁酸雖然對腸道微生態(tài)及腸道疾病有一定作用,但目前研究多借助單獨培養(yǎng)的細胞研究,結(jié)合具體的動物模型或臨床實驗的報道很少,對丁酸作用腸道疾病作用機制的研究單一,還需大量實驗全面考慮其對腸道疾病的作用機理。隨著丁酸研究的進一步深入以及丁酸生理功能作用機制的進一步闡釋,丁酸必將在保健、腫瘤預防與治療等領(lǐng)域發(fā)揮更廣泛的作用。