利用分散液-液微萃取和反相高效液相色譜-熒光檢測器測定硒蛋白多糖中硒含量

王鳳芹 曹進平 路則慶 汪以真

(浙江大學飼料科學研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部(華東)動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，浙江省飼料與動物營養(yǎng)重點實驗室，杭州 310058)

硒(Se)作為動物生命必需的一種微量元素，有著較窄的安全閾值[1-4]，同時其生物活性依賴于其在不同組織的存在形態(tài)[5]，因此關(guān)于硒在不同基質(zhì)中的分析方法研究一直引起廣泛的關(guān)注[6]。此外，亞硒酸鹽和有機硒化合物還常作為一種飼料添加劑加入飼糧中[7]。因此，建立可靠、簡便的硒含量測定方法是非常有必要的。目前測定硒含量的方法有很多，包括原子吸收光譜(AAS)法[8]、原子發(fā)射光譜(AES)法[9]、原子熒光光譜(AFS)法[10]、電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法[11]和大氣壓化學電離質(zhì)譜(APCI-MS)法[12]等，這些方法常用于測定土壤、食品、水和生物樣品中的硒含量。目前廣泛使用的硒含量測定方法是2,3-二氨基萘(DAN)熒光法[13]，樣品衍生后經(jīng)液-液萃取，再利用熒光分光光度計檢測，此過程溶劑消耗較大。迄今為止，對于硒螯合物的前處理方法主要有液-液萃取法[14]和分散液-液微萃取法[15]，液-液萃取法主要是以環(huán)己烷作為萃取劑對硒-DAN螯合物(Se-DAN螯合物)進行萃取，而分散液-液微萃取法是以甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四氫呋喃以及離子液體等為分散劑，以四氯化碳、氯仿、二氯甲烷、四氯乙烯、氯苯、溴乙烷、對氯甲苯以及二硫化碳等為萃取劑，讓體系形成萃取液滴，實現(xiàn)提取和預(yù)濃縮一步到位。Zhou等[15]利用分散液-液微萃取和反相C18柱高效液相色譜紫外檢測法測定了茶葉中硒含量，但是在應(yīng)用此方法對硒蛋白多糖中硒含量進行測定時發(fā)現(xiàn)，前處理過程中對萃取劑的濃縮會造成Se-DAN螯合物的損失，更重要的一點是普通C18色譜柱對于Se-DAN螯合物和體系中的干擾物并不能有效分離。本研究團隊自行篩選、純化、分離得到了1株高產(chǎn)胞外多糖的細菌菌株Z0206。研究表明，該菌株能耐受高濃度的亞硒酸鈉(Na2SeO3)，并且能夠?qū)o機硒轉(zhuǎn)化為有機硒和單質(zhì)硒，該菌株發(fā)酵制備得到的主要產(chǎn)物被命名為Z0206硒蛋白多糖[16]，在小鼠和家禽上應(yīng)用發(fā)現(xiàn)其具有較強的抗氧化和免疫功能[17-20]。因此，本試驗旨在建立一種利用分散液-液微萃取前處理并將一種新型反相色譜柱應(yīng)用于高效液相色譜-熒光檢測測定硒蛋白多糖中硒含量的方法，以促進硒蛋白多糖作為一種新型飼料添加劑在飼料生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，同時為畜牧業(yè)中硒產(chǎn)品中硒含量的測定提供更簡便、更易普及的分析方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑及配制方法

Na2SeO3標準品(純度99%)、乙腈(色譜純)、DAN(純度95%)為Sigma公司產(chǎn)品。乙二胺四乙酸二鈉、鹽酸羥胺、鹽酸、硝酸、高氯酸、氯苯等試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。酵母硒樣品由浙江科盛飼料有限公司提供。

DAN試劑(1.0 g/L)的配制：參照《飼料中硒的測定》(GB/T 13883—2008)。

1.1.2 主要儀器

數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)、pH計(美國Mettler Toledo公司)、Softmax pro5多功能連續(xù)光譜酶標儀(美國Molecular Devices公司)、純水儀(日本Yamato公司)、Ultimate 3000高效液相色譜儀配置紫外檢測器和熒光檢測器(美國Thermo Scientific公司)、高速離心機(美國Thermo Scientific公司)。

1.2 硒蛋白多糖樣品的制備

硒蛋白多糖的制備參考本課題組前期研究報道[18]，該樣品將作為本試驗的待測材料。

1.3 硒蛋白多糖樣品的前處理及分析

樣品按《飼料中硒的測定》(GB/T 13883—2008)規(guī)定進行濕法消解，調(diào)節(jié)pH至1.5～2.0，并用0.1 mol/L HCl定容至250 mL，同時設(shè)置空白對照。取出3 mL樣品至5 mL具塞離心管中，向其中加入0.5 mL DAN，沸水浴反應(yīng)10 min，流水冷卻后，再向其中先后加入400 μL乙腈和120 μL氯苯，振搖5 min，然后靜置5 min，最后以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min。移取100 μL氯苯并向其中加入100 μL乙腈，混勻后進樣，經(jīng)高效液相色譜-紫外檢測器串聯(lián)熒光檢測器(HPLC-UVD-FLD)分析。

1.4 標準曲線的制備

準確稱取適量Na2SeO3，溶解在500 mL 0.1 mol/L HCl中，用0.1 mol/L HCl逐步稀釋成250.0、100.0、50.0、25.0、10.0和5.0 μg/L的硒(Ⅳ)標準工作液。經(jīng)過1.3步驟操作后，利用HPLC-UVD-FLD分析測定Se-DAN螯合物含量。

1.5 HPLC-UVD-FLD分析條件

Welch Ultimate PFP色譜柱[250 mm×4.6 mm，3 μm，月旭科技(上海)股份有限公司]；Xbrige C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Waters公司)；進樣量5 μL；流動相：乙腈。紫外檢測器(UVD)：波長378 nm；熒光檢測器(FLD)：激發(fā)波長376 nm，發(fā)射波長520 nm。

比較Se-DAN螯合物在不同的色譜柱(C18色譜柱與PFP色譜柱)和不同的流速(0.3、0.4與0.5 mL/min)下串聯(lián)紫外檢測器與熒光檢測器色譜保留行為。

1.6 方法的準確度與精密度

考慮到飼料中硒含量的測定濕法消解已經(jīng)有相應(yīng)的國家標準，并且方法已經(jīng)很成熟，本試驗分別取1.0、2.5和5.0 μg/mL 3個濃度的硒標準工作液加入到50 mL硒蛋白多糖消解液(從定容的250 mL樣品溶液中分取)中，得到最終計算值為1.0、2.5和5.0 μg的3個添加水平，計算回收率及變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PFP色譜柱與C18色譜柱分析Se-DAN螯合物

分別使用PFP色譜柱和C18色譜柱，以乙腈作為流動相，設(shè)置流速為0.3 mL/min，分析硒蛋白多糖樣品中Se-DAN螯合物，紫外檢測結(jié)果如圖1所示，熒光檢測結(jié)果如圖2所示。由圖1可知，無論使用PFP色譜柱還是C18色譜柱，用紫外檢測器都不能對硒蛋白多糖樣品中Se-DAN螯合物進行完全基線分離。而由圖2可知，選擇PFP色譜柱，用熒光檢測器時，樣品中的Se-DAN螯合物能呈現(xiàn)出很好的峰形，這一點在C18色譜柱上則不能實現(xiàn)。

高效液相色譜分析條件：流速0.3 mL/min，紫外吸收波長378 nm。

高效液相色譜分析條件：流速0.3 mL/min，激發(fā)波長376 nm，發(fā)射波長520 nm。

2.2 不同流速下分析Se-DAN螯合物

針對PFP色譜柱分別考察了不同流速對儀器靈敏度和分離度的影響。流動相乙腈的流速分別設(shè)置為0.3、0.4和0.5 mL/min，結(jié)果如圖3所示，可知使用低流速(0.3 mL/min)乙腈可獲得更高的靈敏度和分離度。

從上到下流速分別為0.3、0.4和0.5 mL/min。

2.3 所建立方法的線性范圍

使用PFP色譜柱，在流速為0.3 mL/min的條件下分析Se-DAN螯合物色譜圖，如圖4所示。以硒標準工作液濃度為橫坐標(x)，熒光檢測積分面積為縱坐標(y)，擬合計算得到硒(Ⅳ)含量的標準曲線方程及相關(guān)系數(shù)(R2)。在5.0～250.0 μg/L濃度范圍內(nèi)，線性方程式為y=10 608.3x+24 532.8(R2=0.999 8)。

2.4 所建立方法的檢出限與定量限

本試驗選定硒(Ⅳ)含量的檢出限為2.5 μg/L，檢出限大于3倍信噪比，定量限為5.0 μg/L，定量限大于10倍信噪比，滿足國際分析方法性能的要求。

2.5 所建立方法的準確度與精密度

在50 mL硒蛋白多糖消解液中(從定容的250 mL毫升溶液中分取)，加入硒標準工作液，得到的回收率及相對標準偏差(RSD)如表1所示。在1.0、2.5和5.0 μg 3個添加水平范圍內(nèi)，硒蛋白多糖中硒的回收率為82.1%～105.2%，RSD為2.7%～3.9%。采用《飼料中硒的測定》(GB/T 13883—2008)中的熒光分光光度法測得硒蛋白多糖樣品中硒含量為1 327.8 μg/g。經(jīng)過分散液-液微萃取后利用高效液相色譜-熒光檢測器(HPLC-FLD)測得硒蛋白多糖樣品中硒平均含量為1 337.0 μg/g，RSD為0.3%。2種方法的測定結(jié)果十分接近。

表1 硒蛋白多糖中硒回收率和相對標準偏差

2.6 Se-DAN螯合物穩(wěn)定性分析

將5.0、10.0、25.0、50.0、100.0和250.0 μg/L系列濃度的硒(Ⅳ)與DAN反應(yīng)生成的Se-DAN螯合物在室溫下放置，分析10 h前后的熒光強度，結(jié)果如表2所示，可知Se-DAN螯合物的穩(wěn)定性較好。

表2 利用HPLC-FLD測定10 h前后Se-DAN螯合物結(jié)果

2.7 所建立方法在酵母硒上的應(yīng)用

為考察本試驗所建立方法在常見的飼料添加劑總硒含量檢測中的適用性，對酵母硒樣品進行酸水解和液相分析，色譜圖如圖5所示，可以看到酵母硒中基質(zhì)對Se-DAN螯合物的吸收峰沒有產(chǎn)生干擾。

圖5 酵母硒中Se-DAN螯合物色譜圖

3 討 論

3.1 比較PFP色譜柱與C18色譜柱以及不同檢測器分析Se-DAN螯合物

PFP色譜柱除具有苯基官能團的疏水相互作用與π-π鍵相互作用外，還因其具有高電負性氟官能團，增加了其與化合物的偶極-偶極及電荷轉(zhuǎn)移作用，從而改善了其對結(jié)構(gòu)相近化合物的選擇性，適合于極性較小的化合物[21]。而C18色譜柱主要作用模式是疏水作用，主要用適合于極性和中等非極性分子的化合物。因此，本試驗選擇PFP色譜柱替代常用的C18色譜柱以增強選擇性，用熒光檢測器替代紫外檢測器以排除樣品中具用紫外吸收的物質(zhì)可能造成的基質(zhì)干擾，本試驗最終選擇PFP色譜柱和熒光檢測器。

3.2 不同的流速對結(jié)果的影響

使用PFP色譜柱，乙腈流速分別為0.3、0.4和0.5 mL/min時，流速越低，Se-DAN螯合物和其他雜質(zhì)峰分離情況更好，并且，在低濃度范圍，當流速減小時，儀器會有更高的靈敏度，故最終選擇流速為0.3 mL/min。

3.3 氮氣吹干濃縮對結(jié)果的影響

Zhou等[15]對萃取液進行氮吹濃縮至干再用甲醇復(fù)溶后經(jīng)HPLC分析，本研究在對萃取液氮氣吹干濃縮過程中發(fā)現(xiàn)，濃縮過程尤其是吹干結(jié)束時，空氣對Se-DAN螯合物熒光的猝滅影響很大，這一點與文獻報道[22]一致。因此，為了避免氮吹濃縮過程中空氣對熒光的猝滅，本試驗直接采用乙腈對萃取劑進行1∶1稀釋后進樣，表現(xiàn)出良好的線性和準確度。并且，10 h前后Se-DAN螯合物的HPLC-FLD測定結(jié)果顯示，Se-DAN螯合物在室溫下放置10 h仍然十分穩(wěn)定。

3.4 所建立方法的準確度和適用性

國標法中對于硒含量的測定，通常采用的是熒光分光光度法，將該方法作為本試驗所建立方法測定結(jié)果的對照。采用本試驗所建立方法測定的硒蛋白多糖中硒含量為1 337.0 μg/g，與國標法測定結(jié)果(1 327.8 μg/g)高度一致，說明該方法的準確度較高。利用所建立方法對酵母硒中硒含量進行測定時，酵母硒中基質(zhì)對Se-DAN螯合物的吸收峰沒有產(chǎn)生干擾，說明本試驗所建立的前處理步驟和儀器分析方法在其他含硒樣品中同樣得到了很好的應(yīng)用。

3.5 所建立方法的優(yōu)越性

《飼料中硒的測定》(GB/T 13883—2008)中，對于消解后樣品需要加入甲酚紅指示劑、鹽酸羥胺、乙二胺四乙酸二鈉等試劑，并且需要多次轉(zhuǎn)移，最重要的一點是還需要5 mL環(huán)己烷萃取，再經(jīng)熒光分光光度計檢測。而本試驗僅需對消解后的樣品調(diào)節(jié)pH和定容，用微升級分散劑和萃取劑進行萃取，不需要轉(zhuǎn)移。因此，與GB/T 13883—2008相比較，在分析結(jié)果一致的情況下，本試驗前處理過程中相對簡便、試劑消耗更少。

4 結(jié) 論

本試驗建立了一種分散液-液微萃取前處理和一種新型反相色譜柱應(yīng)用于HPLC-FLD測定硒蛋白多糖中總硒含量的方法，最優(yōu)化的條件為：Se-DAN螯合物以400 μL乙腈為分散劑，120 μL氯苯為萃取劑進行分散液-液微萃取后，經(jīng)乙腈稀釋后直接采用PFP色譜柱分離，以流速為0.3 mL/min的乙腈洗脫，設(shè)置激發(fā)波長376 nm、發(fā)射波長520 nm進行熒光檢測器檢測，外標法定量。采用本方法測定的硒蛋白多糖中總硒含量為1 337.0 μg/g，國標法測定結(jié)果高度一致，并且該方法可用于常見飼料添加劑酵母硒中總硒含量的檢測。本方法具有操作簡便、易普及、試劑消耗少、分離度好、回收率高和適用性強等特點。