基于轉(zhuǎn)錄組測序分析研究枸芪多糖對育肥豬腸黏膜免疫功能的作用機(jī)理

霍金金 褚耀誠 金 娜 李 禎 郝 壯 陳長增 李建東 劉鳳華*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院，張家口 075000)

腸道作為動物發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要場所，與動物機(jī)體的健康息息相關(guān)，是機(jī)體最大的免疫器官。腸道黏膜可以有效阻止細(xì)菌或毒素等生物化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，是機(jī)體天然的免疫屏障[1]，腸道黏膜系統(tǒng)受損會導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂、組織損傷和病理變化，增加疾病的發(fā)生[2]。枸芪多糖主要由枸杞、黃芪等天然植物經(jīng)干燥提煉后配伍而成，具有安全無害、無抗藥性、無殘留、加工工藝簡便等特點[3]。黃芪主要含皂苷、黃酮類化合物、多糖等成分，具有改善動物生產(chǎn)性能、增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗病毒、抗細(xì)菌感染、抗炎癥和抗癌癥等功能[4-6]。枸杞的主要營養(yǎng)和功能成分有多糖、維生素、氨基酸等，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎抗癌等作用[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖不僅能夠有效促進(jìn)仔豬的生長發(fā)育，還能提高其免疫力，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能[10]。在肉雞養(yǎng)殖中添加枸杞多糖能夠提高其脾臟、法氏囊、胸腺的白細(xì)胞介素-2(IL-2)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)的基因相對表達(dá)水平，促進(jìn)機(jī)體的正常代謝，提高肉雞的免疫力[11]。枸杞多糖對免疫抑制小鼠具有免疫增強(qiáng)作用，可調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫系統(tǒng)[12]。黃芪多糖和復(fù)方多糖可促進(jìn)雞免疫器官的生長發(fā)育，提高機(jī)體的免疫功能[13]。黃芪多糖和枸杞多糖也是增強(qiáng)T細(xì)胞功能的免疫增強(qiáng)劑[14-16]。Chen等[16]研究表明，粗多糖可以提高動物的免疫力，其中最有效的方式是刺激轉(zhuǎn)錄因子中的活化T細(xì)胞核因子(NFAT)和刺激蛋白-1(AP-1)，抵抗機(jī)體的炎癥反應(yīng)，阻擋病原體造成的感染，從而得到提高免疫能力的目的。

本項目組前期研究發(fā)現(xiàn)，枸芪多糖可有效提高育肥豬的生長性能，降低腹瀉率，改善腸道形態(tài)和菌群結(jié)構(gòu)[17-18]，這些變化與腸黏膜免疫有著很大關(guān)聯(lián)，但關(guān)于把枸杞和黃芪提煉為枸芪多糖探究其對育肥豬腸道免疫的潛在分子機(jī)制的影響尚不明確。鑒此，本研究進(jìn)一步研究枸芪多糖對育肥豬腸黏膜免疫功能的作用機(jī)理，以期為枸芪多糖在育肥豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

枸芪多糖為本實驗室自制，枸杞與黃芪1∶1混合后取1 500 g，加10倍量的水煎煮、干燥，加淀粉至900 g，粉碎，混勻，經(jīng)提取、濃縮、干燥后制得，每克枸芪中提取的復(fù)合多糖含量為106 mg。

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計

選用80～90日齡、初始體重為(50±3)kg、血緣和胎次相近的健康杜×長×大三元雜交育肥母豬180頭，隨機(jī)分成對照組和試驗組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)15頭豬。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組在基礎(chǔ)飼糧中添加0.1%枸芪多糖，試驗期90 d?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗開始前對豬舍及料槽、水槽全面消毒，試驗豬分欄飼養(yǎng)，按常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫和驅(qū)蟲，自由采食和飲水。

1.4 樣品采集與處理

1.4.1 空腸組織總RNA提取

試驗結(jié)束后，從每組隨機(jī)選取3頭育肥豬進(jìn)行屠宰，迅速剪取3 cm左右的空腸腸段，沖洗后裝入5 mL的無菌離心管中，立即放入液氮中保存待檢，并嚴(yán)格按照總RNA提取試劑盒說明書對樣品中總RNA進(jìn)行抽提。

1.4.2 建庫測序與分析

根據(jù)HiSeq平臺，采用Illumina TruseqTMRNA sample prep Kit方法進(jìn)行文庫構(gòu)建。利用帶有Oligo(dT)的磁珠與ploy A進(jìn)行A-T堿基配對，富集mRNA。將富集得到的mRNA隨機(jī)打斷成300 bp左右的小片段，再以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，合成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，在3’末端加上一個A堿基，連接Y字形的接頭，對連接adapter后的產(chǎn)物進(jìn)行純化和片段分選，用分選產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化得到最終的文庫。Illumina HiSeq X10上機(jī)測序。用Trim Galore軟件對原始測序數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行過濾得到高質(zhì)量有效讀段數(shù)據(jù)(clean reads)，利用HISAT2軟件將clean reads與豬的參考基因組比對，將比對成功的clean reads組裝成Unigene，然后分析基因表達(dá)量。

1.4.3 轉(zhuǎn)錄組測序差異表達(dá)基因的實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證

選擇同批次的RNA樣本進(jìn)行qRT-PCR驗證，驗證測序結(jié)果的可靠性?？俁NA樣品經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，用TIANGEN的SYBR Green試劑盒進(jìn)行基因表達(dá)熒光定量分析，反應(yīng)體系共20 μL：1 μL cDNA，上、下游引物各1 μL，6.7 μL 經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的滅菌蒸餾水，10 μL SuperReal PreMix Plus，0.3 μL ROX Reference Dye。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次，用2-ΔΔCt法分析。qRT-PCR所用基因引物序列見表2。

表2 基因引物序列

1.4.4 蛋白免疫印跡(western blot)檢測信號通路

將提取的組織勻漿液于4 ℃、12 000×g離心5 min后取上清液即為全蛋白溶液。將提取的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(上樣量為15 μg)，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜，封閉2 h后，進(jìn)行孵育，一抗孵育2 h，二抗孵育40 min，利用Odyssey成像系統(tǒng)掃描NC膜，分析結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)并進(jìn)行組間差異顯著性比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

通過Illumina HiSeq X10平臺得到轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，6個樣本的clean reads條數(shù)從51 700 340到58 609 640，共得到329 895 374條clean reads(表3)，可以定位到豬基因組上的clean reads數(shù)占84%以上，在參考序列上有唯一比對位置的序列數(shù)占比為76%～79%，有多個比對位置的序列數(shù)占7.0%～8.5%，各個樣本定位到參考基因組不同區(qū)域的分布比例相似，75.99%～78.02%定位到編碼區(qū)(CDS)，其余依次定位到3′端非編碼區(qū)、基因間區(qū)、內(nèi)含子區(qū)和5′端非編碼區(qū)。

表3 育肥豬空腸組織轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)

2.2 差異表達(dá)免疫基因

轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)顯示，以P-adjust<0.05，|log2FC|≥0.75為篩選條件，共鑒定出試驗組相對對照組有479個基因發(fā)生顯著變化，其中免疫基因有75個發(fā)生顯著變化，包括26個基因表達(dá)上調(diào)，以及49個基因表達(dá)下調(diào)(表4)。對表達(dá)水平相似的差異基因進(jìn)行層級聚類分析，構(gòu)建聚類熱圖(圖1)，從圖中可清晰地看出不同基因的表達(dá)量情況。聚類熱圖中，顏色越紅表示表達(dá)量越高，顏色越藍(lán)表示表達(dá)量越低。

C1:對照組樣本1；C2：對照組樣本2；C3：對照組樣本3；T1：試驗組樣本1；T2：試驗組樣本2；T3：試驗組樣本3。

表4 75個差異表達(dá)免疫基因

2.3 差異表達(dá)免疫基因的生物功能分析

為了探究差異表達(dá)免疫基因與表型之間的關(guān)系，將全部差異顯著的免疫基因進(jìn)行基因本體(GO)富集和信號通路(pathway)分析，發(fā)現(xiàn)2組間存在差異的生物學(xué)過程。GO富集分析結(jié)果如圖2所示，差異表達(dá)基因主要在免疫效應(yīng)過程、免疫調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答和應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過程有較高的富集值。信號通路分析結(jié)果如圖3所示，差異表達(dá)基因主要在白細(xì)胞介素-17(IL-17)信號通路、NOD樣受體(NLR)信號通路有較高的富集值，說明這2個信號通路作為差異調(diào)控腸道變化的主要靶信號通路。

圖2 差異表達(dá)免疫基因GO富集分析

圖3 差異表達(dá)免疫基因信號通路分析

將差異表達(dá)免疫基因與其相關(guān)生物學(xué)功能形成基因網(wǎng)絡(luò)圖(圖4)，發(fā)現(xiàn)原癌基因Jun(JUN)和原癌基因Fos(FOS)是其中2個最關(guān)鍵的差異基因，JUN和FOS基因表達(dá)產(chǎn)物Jun和Fos蛋白組成的二聚體復(fù)合物AP-1是細(xì)胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以接收細(xì)胞外界刺激信號進(jìn)而調(diào)節(jié)下游基因。結(jié)合之前的GO富集發(fā)現(xiàn)，基因網(wǎng)絡(luò)圖的節(jié)點位置很多蛋白都與免疫相關(guān)，除了JUN和FOS，白細(xì)胞介素-18(IL-18)、脂肪酸結(jié)合蛋白1(FABP1)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、趨化因子配體16(CXCL16)、補體5(C5)、補體C5a受體1(C5AR1)、谷胱甘肽過氧化物酶2(GPX2)、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP9)基因也是關(guān)鍵的差異基因(表5)，主要參與免疫應(yīng)答、體液免疫、DNA損傷、抗氧化損傷修復(fù)和細(xì)胞凋亡過程，這些基因的表達(dá)在枸芪多糖作用于機(jī)體后調(diào)控腸道免疫功能方面起到了重要作用。

表5 關(guān)鍵免疫基因

圖4 差異表達(dá)免疫基因網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 差異表達(dá)免疫基因的qRT-PCR驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序的準(zhǔn)確性，對JUN、FOS、C5和IL-18這4個差異基因進(jìn)行qRT-PCR驗證，圖5結(jié)果表明，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果趨勢一致，說明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)具有可靠性。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.5 Jun和Fos的Western Blot分析

通過轉(zhuǎn)錄組分析得到JUN和FOS是2個腸黏膜差異表達(dá)的關(guān)鍵基因，在試驗組中表達(dá)下調(diào)。Western Blot證實試驗組的Jun和Fos蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組(圖6)，灰度分析見圖7，結(jié)果均顯示Jun和Fos蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組(P<0.05)，其結(jié)果和聚類熱圖結(jié)果相符合。

圖6 Jun和Fos的Western Blot驗證

圖7 定量驗證Jun和Fos表達(dá)水平

3 討 論

腸道是機(jī)體最大的免疫器官，具有消化吸收、排毒、強(qiáng)化免疫等生物學(xué)功能，機(jī)體自身的免疫力、飼糧結(jié)構(gòu)等均會直接影響腸道功能的正常運作[19]。已有相關(guān)轉(zhuǎn)錄組測序研究得出，一些差異表達(dá)基因與免疫力有關(guān)[20-21]。本文采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，通過枸芪多糖組和對照組免疫基因比較分析，發(fā)現(xiàn)共有75個差異基因發(fā)生顯著變化，26個基因顯著上調(diào)，49個基因顯著下調(diào)，基因的上調(diào)和下調(diào)影響著一些表達(dá)蛋白和因子分泌發(fā)生變化，通過一系列的信號通路過程最終對機(jī)體產(chǎn)生重要影響。

通過GO富集發(fā)現(xiàn)差異基因主要參與免疫調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答和應(yīng)激反應(yīng)，信號通路分析發(fā)現(xiàn)免疫基因表達(dá)主要集中在IL-17信號通路和NOD樣受體信號通路，這2個信號通路作為差異調(diào)控腸道變化的主要靶信號通路。將差異免疫基因與其相關(guān)生物學(xué)功能形成基因網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)JUN、FOS、IL-18、FABP1、MMP9、CXCL16、C5、C5aR1、GPX2、PARP9的基因表達(dá)情況差異極顯著，差異免疫基因與其相關(guān)生物學(xué)功能形成基因網(wǎng)絡(luò)圖，顯示JUN和FOS是其中2個最關(guān)鍵的差異基因。

炎癥相關(guān)差異表達(dá)的重要基因JUN和FOS，在參與機(jī)體的免疫應(yīng)答方面有著重要的影響，Jun蛋白和Fos蛋白組成的二聚體復(fù)合物AP-1是細(xì)胞核內(nèi)重要的堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，以磷酸化的c-JUN/c-FOS形式與基因序列上的AP-1結(jié)合位點結(jié)合[22]。在炎癥、腫瘤發(fā)生時AP-1是調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子[23]，是IL-17信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路和c-Jun N端激酶(JNK)通路等炎癥信號通路的下游信號因子。當(dāng)受到上游信號刺激后下游因子被激活，后續(xù)引發(fā)一系列鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而使得炎癥反應(yīng)發(fā)生。當(dāng)機(jī)體受到刺激，AP-1接收到上游信號被激活后，會由胞漿進(jìn)入到胞核中，使炎癥因子發(fā)生轉(zhuǎn)錄[24]。本試驗發(fā)現(xiàn)枸芪多糖使Jun蛋白和Fos蛋白表達(dá)明顯降低，表明枸芪多糖組的炎癥反應(yīng)受到抑制，AP-1沒有被激活，未使炎癥因子發(fā)生轉(zhuǎn)錄，使得通路未被激活。炎癥因子通常作為免疫調(diào)節(jié)的生物標(biāo)記，炎癥過程是先天性免疫反應(yīng)的重要組成部分，這也說明枸芪多糖可以通過調(diào)控炎癥因子的激活，調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素和趨化因子的表達(dá)來發(fā)揮抗炎作用，調(diào)節(jié)腸道免疫功能。JUN、FOS、IL-18、FABP1、MMP9、CXCL16、C5、C5aR1、GPX2、PARP9這些基因主要富集在IL-17信號通路、NOD樣受體信號通路，故推測枸芪多糖可能通過作用于IL-17信號通路、NOD樣受體信號通路抑制AP-1入核調(diào)控炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，抑制炎癥因子發(fā)生，從而對育肥豬腸道進(jìn)行免疫保護(hù)。

Okamura等[25]發(fā)現(xiàn)，IL-18是白細(xì)胞介素-1(IL-1)家族蛋白中的一員，作為促炎因子的IL-18在一些疾病發(fā)生中顯著表達(dá)，如腫瘤、胃腸疾病、動脈粥樣硬化等。本試驗發(fā)現(xiàn)，枸芪多糖使IL-18的基因表達(dá)被抑制。補體系統(tǒng)是體液免疫的重要組成部分，被激活后發(fā)揮調(diào)理吞噬、介導(dǎo)炎癥、免疫調(diào)節(jié)及清除免疫復(fù)合物等多種生物學(xué)效應(yīng)。C5是補體系統(tǒng)的重要組成成分，研究表明，C5參與體液免疫，補體系統(tǒng)在炎癥和抗感染中發(fā)揮重要作用[26]。本試驗中，飼糧中添加枸芪多糖育肥豬體內(nèi)C5表達(dá)水平顯著增加，表明枸芪多糖可增強(qiáng)機(jī)體補體系統(tǒng)，進(jìn)而增強(qiáng)腸道黏膜免疫力。

4 結(jié) 論

本試驗通過轉(zhuǎn)錄組分析，在飼糧中添加枸芪多糖能夠增強(qiáng)肥育豬腸黏膜免疫功能，枸芪多糖可能通過調(diào)節(jié)JUN、FOS、IL-18等免疫相關(guān)基因的表達(dá)，影響IL-17和NOD樣受體信號通路，以此來抑制炎癥反應(yīng)。