飲水中添加復合維生素納米乳對生長獺兔生長性能、免疫功能、抗氧化能力、腸道組織結構及盲腸微生態(tài)的影響

葉翔楊 宮瑞光 任戰(zhàn)軍*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，楊凌 712100；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所，畜禽育種國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣州 510640)

維生素是一類生理功能和營養(yǎng)意義相似的有機化合物，參與機體代謝調節(jié)，維持人和動物正常生理功能。維生素在動物體內不能合成或合成量不足，只能從食物或飼料中攝取。然而，在飼料生產(chǎn)和貯藏都會對飼料中維生素含量產(chǎn)生影響。目前，國內外普遍認為在配合飼料加工中，溫度、水分、壓力、調質時間、摩擦等是影響維生素穩(wěn)定性的主要因素。有研究顯示，維生素在飼料熱加工過程中損失很大，尤其是維生素A，其活性可降低30%～50%[1]。目前常通過過量添加的形式來補充維生素在飼料配制過程中的損失，但這種方式成本高、浪費大。

納米乳又稱微乳，是由油相、水相、表面活性劑及助表面活性劑，以適當比例混合形成的一種透明或半透明、低黏度的熱力學穩(wěn)定體系，其粒徑一般介于1～100 nm。它被廣泛地應用于封裝親脂性生物活性成分(脂溶性維生素或營養(yǎng)素)，加入以水為基質食品中，具有很高的光學清晰度，就像強化水、軟飲料、果汁等[2]。納米乳由于其粒徑小、表面活性劑和助表面活性劑濃度高，可提高封裝元件的生物利用度[3]。大量資料表明，納米乳具有制備簡單、安全性高、熱力學穩(wěn)定、能增大難溶性藥物溶解度、提高易水解藥物穩(wěn)定性、吸收率高等優(yōu)點。

納米乳技術在食品和藥物加工中已廣泛應用，而在動物營養(yǎng)方面研究較少，尤其是家兔方面未見研究報道。本試驗以獺兔為研究對象，采用納米乳技術將脂溶性維生素A、維生素D、維生素E和水溶性維生素B1、維生素B6、生物素、泛酸、煙酸、膽堿復合制成維生素乳液，并對其品質進行鑒定，通過飲水添加給獺兔，測定該復合維生素納米乳對生長獺兔生長性能、免疫功能、抗氧化能力、腸道組織結構及盲腸微生態(tài)的影響，以期開發(fā)一種安全、穩(wěn)定、高效、品質可控的兔用復合維生素飲品，為獺兔高效補充維生素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

根據(jù)谷子林等[4]推薦的斷奶后生長育肥獺兔飼糧中維生素含量，按照1 mL復合維生素納米乳中各維生素的供應量等于1 kg飼糧中各維生素的供應量，確定復合維生素納米乳中的各維生素含量，詳見表1。采用自發(fā)乳化法制備復合維生素納米乳，即在常溫、常壓下，將配方量的km(表面活性劑吐溫-80∶助表面活性劑丙三醇=3∶1)與油相(維生素A油、維生素D油和維生素E油混合物)混合，攪拌均勻，然后向體系中緩慢滴加水相(含配方量水溶性維生素泛酸鈣、煙酰胺、生物素、維生素B1、維生素B6、膽堿的水溶液)，km∶油相∶水相為4∶1∶15。開始時體系黏度較低，隨著水相的加入，體系會出現(xiàn)由稀變黏的過程，繼續(xù)滴加，體系又會由黏變稀，最后將水相全部加入體系中，即形成穩(wěn)定的復合維生素納米乳。用高效液相色譜法對復合維生素納米乳中各維生素的含量進行測定，結果見表1(由于生物素的添加量過低，測量不準確，故未測定生物素含量；由于測定過程中操作不當，膽堿和泛酸含量數(shù)據(jù)有誤，故未采用)。

表1 復合維生素納米乳中各維生素的設計含量與測定含量

基礎飼糧為養(yǎng)殖場自配顆粒料，其組成及營養(yǎng)水平見表2。

表2 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.2 試驗動物與分組

試驗采用單因素隨機試驗設計，選取30日齡斷奶、體重接近的健康獺兔150只，隨機分為5組，每組3個重復，每個重復10只(公母各占1/2)，單籠飼養(yǎng)。其中對照組Ⅰ飼喂含維生素(100%營養(yǎng)標準)的顆粒料，飲水中不添加復合維生素納米乳；對照組Ⅱ飼喂含維生素(100%營養(yǎng)標準)的顆粒料，飲水中添加吐溫-80+丙三醇(與試驗組Ⅱ相同配比)；試驗組Ⅰ飼喂不含維生素的顆粒料，飲水中添加含營養(yǎng)標準80%的復合維生素納米乳；試驗組Ⅱ飼喂不含維生素的顆粒料，飲水中添加含營養(yǎng)標準100%的復合維生素納米乳；試驗組Ⅲ飼喂不含維生素的顆粒料，飲水中添加含營養(yǎng)標準120%的復合維生素納米乳。試驗期為61 d，其中預試期5 d，正試期56 d。試驗期間，在每日喂料前停止供水并清干飲水碗，添加稀釋至10 mL的復合維生素納米乳，然后喂料，確認飲水碗中水喝干凈后再打開水閥，自由飲水。根據(jù)前1天的采食量確定各組每日復合維生素納米乳的添加量，其計算公式為：

復合維生素納米乳添加量(mL)=前1天的采食量(kg)×含營養(yǎng)標準的百分比。

1.3 樣品采集

試驗結束后，從每個重復中隨機選取公、母兔各1只，共30只，空腹稱重后屠宰，分離胸腺、脾臟、肝臟、蚓突。用抗凝采血管心臟采血5 mL，液氮速凍后于-80 ℃保存，用于測定血液免疫指標和抗氧化指標測定；取回腸中段，載玻片刮取黏膜，裝于1.5 mL離心管中，液氮速凍后-80 ℃保存，用于測定回腸黏膜免疫指標?；啬c、蚓突組織各取3 cm，生理鹽水洗凈后用4%多聚甲醛固定24 h，用于腸道組織形態(tài)觀察；結扎盲腸兩端，取盲腸內容物10 mL，超低溫冰箱保存，用于分析盲腸菌群。

1.4 指標測定

1.4.1 生長性能測定

每天早上喂料前收集前1天剩余的飼糧，稱重計算各重復獺兔的總采食量和平均日采食量(ADFI)；正試期第1天至試驗結束，每2周早晨空腹稱重并記錄每只試驗兔重量，計算各重復獺兔的體增重和平均日增重(ADG)；根據(jù)平均日采食量和平均日增重，計算各重復獺兔的料重比(F/G)。每日記錄試驗兔腹瀉、死亡情況，計算腹瀉率和腹瀉死亡率。

腹瀉率(%)=(試驗期內腹瀉獺兔只次數(shù)/試驗獺兔只數(shù))×100；腹瀉死亡率(%)=(試驗期內腹瀉并死亡獺兔頭數(shù)/試驗獺兔頭數(shù))×100。

1.4.2 免疫器官指數(shù)和蚓突長度測定

用天平對胸腺、脾臟、肝臟進行稱重，計算免疫器官指數(shù)；用直尺測定蚓突長度。

免疫器官指數(shù)=免疫器官重/宰前活重。

1.4.3 免疫指標和抗氧化指標測定

免疫指標包括血液免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)和回腸黏膜分泌型免疫球蛋白(SIgA)含量，抗氧化指標包括血液丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、總抗氧化能力(T-AOC)。所有指標均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定，試劑盒購于上海優(yōu)選生物科技有限公司，具體測定步驟參照說明書進行。

1.4.4 腸道組織形態(tài)觀察

回腸、蚓突組織經(jīng)生理鹽水洗凈后用4%多聚甲醛固定24 h后，沖水、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋等處理后制作石蠟切片，以6 μm的厚度切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色后于顯微鏡下測定回腸絨毛高度和隱窩深度，計算絨毛高度/隱窩深度(V/C)。在高倍顯微鏡下觀察回腸、蚓突，計算100個單層柱狀上皮細胞中淋巴細胞和杯狀細胞數(shù)目，即單層柱狀上皮中淋巴細胞和杯狀細胞比例。

1.4.5 盲腸菌群DNA提取與多樣性分析

盲腸菌群DNA提取和多樣性分析由諾禾致源公司操作完成。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，并采用Duncan氏法對各組數(shù)據(jù)進行多重比較，結果用平均值±標準差表示。

2 結 果

2.1 飲水中添加復合維生素納米乳對生長獺兔生長性能的影響

由表3可知，第1～28天，試驗組Ⅰ的料重比最低，顯著低于試驗組Ⅱ(P<0.05)，與其他組差異不顯著(P>0.05)；對照組Ⅱ和試驗組Ⅰ的腹瀉率和腹瀉死亡率顯著低于對照組Ⅰ(P<0.05)。第29～56天，試驗組Ⅱ、Ⅲ的平均日采食量顯著低于對照組Ⅰ(P<0.05)。整個試驗期間(第1～56天)，試驗組Ⅰ的平均日增重最高，為19.27 g/d，顯著高于試驗組Ⅱ(P<0.05)，其他指標各組間差異均不顯著(P>0.05)。

表3 復合維生素納米乳對生長獺兔生長性能的影響

2.2 飲水中添加復合維生素納米乳對生長獺兔免疫指標的影響

復合維生素納米乳對生長獺兔免疫器官指數(shù)和蚓突長度的影響見表4。對照組Ⅰ的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和蚓突長度均高于對照組Ⅱ和各試驗組，其中胸腺指數(shù)與試驗組Ⅰ、Ⅱ差異顯著(P<0.05)，蚓突長度與對照組Ⅱ和試驗組Ⅱ差異顯著(P<0.05)。此外，對照組Ⅰ的肝臟指數(shù)顯著低于試驗組Ⅰ、Ⅲ(P<0.05)。

表4 復合維生素納米乳對生長獺兔免疫器官指數(shù)和蚓突長度的影響

復合維生素納米乳對生長獺兔血液及回腸黏膜免疫球蛋白含量的影響見表5。對照組Ⅰ的血液IgG含量極顯著低于其他組(P<0.01)，同時對照組Ⅱ血液IgG含量顯著低于試驗組Ⅰ(P<0.05)。對照組Ⅰ的回腸黏膜SIgA含量顯著高于試驗組Ⅱ(P<0.05)。

表5 復合維生素納米乳對生長獺兔血液及回腸黏膜免疫球蛋白含量的影響

2.3 飲水中添加復合維生素納米乳對生長獺兔血液抗氧化指標的影響

復合維生素納米乳對生長獺兔血液抗氧化指標的影響見表6。試驗組Ⅱ的血液MDA含量顯著高于對照組Ⅰ(P<0.05)，高于試驗組Ⅲ、Ⅰ和對照組Ⅱ(P>0.05)。對照組Ⅱ的血液SOD活性顯著高于對照組Ⅰ(P<0.05)，對照組Ⅰ、對照組Ⅱ與各試驗組間的差異均不顯著(P>0.05)。試驗組Ⅱ的血液T-AOC顯著高于對照組Ⅰ、Ⅱ和試驗組Ⅰ(P<0.05)。試驗組Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ之間血液MDA含量、SOD活性和T-AOC這3個指標的差異均不顯著(P>0.05)。

表6 復合維生素納米乳對生長獺兔血液抗氧化指標的影響

2.4 飲水中添加復合維生素納米乳對生長獺兔回腸和蚓突形態(tài)結構的影響

復合維生素納米乳對獺兔回腸和蚓突形態(tài)結構的影響見表7。對照組Ⅱ的回腸絨毛高度最高，極顯著高于對照組Ⅰ(P<0.01)；對照組Ⅰ、Ⅱ的回腸隱窩深度顯著高于試驗組Ⅰ(P<0.05)；對照組Ⅰ的回腸V/C極顯著低于其他4組(P<0.01)。對照組Ⅰ的蚓突隱窩深度顯著高于試驗組Ⅲ(P<0.05)，腸壁厚度極顯著高于3個試驗組(P<0.01)。

表7 復合維生素納米乳對生長獺兔回腸和蚓突形態(tài)結構的影響

復合維生素納米乳對生長獺兔回腸和蚓突單層柱狀上皮中免疫細胞比例的影響見表8。對照組Ⅱ回腸單層柱狀上皮中淋巴細胞比例顯著高于試驗組Ⅰ、Ⅱ和對照組Ⅰ(P<0.05)；試驗組Ⅰ回腸單層柱狀上皮中杯狀細胞比例最高，對照組Ⅰ最低，但各組之間差異不顯著(P>0.05)。試驗組Ⅰ蚓突單層柱狀上皮中淋巴細胞和杯狀細胞比例最高，試驗組Ⅲ最低，但各組之間差異不顯著(P>0.05)。

表8 復合維生素納米乳對生長獺兔回腸和蚓突單層柱狀上皮中免疫細胞比例的影響

2.5 操作分類單元(OTU)聚類及物種注釋結果

本試驗樣本數(shù)為30，測序得到的總Tags數(shù)目為2 215 419個，能夠被聚類的Tags數(shù)目為2 042 831個，總OTU數(shù)目為34 618個。

由表9可知，各組獺兔盲腸內的菌群均是以厚壁菌門為主，其中試驗組Ⅱ厚壁菌門的相對豐度顯著高于對照組Ⅰ(P<0.05)；對照組Ⅱ的擬桿菌門、擬桿菌科的相對豐度顯著高于試驗組Ⅱ(P<0.05)；試驗組Ⅱ疣微菌科的相對豐度顯著高于其他各組(P<0.05)，疣微菌科UCG-014的相對豐度顯著高于對照組Ⅰ(P<0.05)。

表9 復合維生素納米乳對生長獺兔盲腸菌群相對豐度的影響

生長獺兔盲腸菌群α多樣性分析結果見表10。分析可知，試驗組Ⅱ的Shannon指數(shù)最低，顯著高于其他各組(P<0.05)；試驗組Ⅰ、試驗組Ⅲ和對照組Ⅰ的Simpson指數(shù)顯著高于試驗組Ⅱ和對照組Ⅱ(P<0.05)；對照組Ⅰ的Chao1指數(shù)顯著高于試驗組Ⅱ、Ⅲ(P<0.05)；對照組Ⅰ的ACE指數(shù)顯著高于試驗組Ⅱ(P<0.05)。

表10 生長獺兔盲腸菌群α多樣性分析

3 討 論

3.1 飲水中添加復合維生素納米乳對生長獺兔生長性能、免疫功能及抗氧化能力的影響

維生素A、維生素D、維生素E、維生素B1、維生素B6、煙酸、膽堿等對動物的生長性能均有重要影響。為探討飼糧中添加維生素與飲水添加復合維生素納米乳在獺兔生長性能方面的差異，本試驗測定了各種獺兔的平均采食量、平均日增重和料重比，從試驗全期的結果看，飼糧中添加維生素與飲水中添加復合維生素納米乳，其生長性能無顯著差異。

獺兔斷奶時由于消化道未發(fā)育完全，在奶料更替的過程中對飼糧的消化率較低，營養(yǎng)物質在消化道內滯留，難以消化。加之仔兔斷奶后不能從母乳中獲得抗菌物質，導致致病微生物大量增殖，從而引起斷奶仔兔出現(xiàn)腹脹、腹瀉等消化道疾病[5]。本試驗中，由于基礎飼糧為養(yǎng)殖場自配顆粒料，存在玉米含量高、纖維水平低的缺陷，導致斷奶后1～28 d時大量獺兔出現(xiàn)腹瀉癥狀，且正常飲水的獺兔腹瀉率顯著高于飲水中添加復合維生素納米乳及其空白組方(吐溫-80+丙三醇)的獺兔。而飲水中含有吐溫-80+丙三醇的試驗組，由于吐溫-80為表面活性劑，使油、淀粉和水在腸道內一定程度上形成較穩(wěn)定的乳濁液結構，從而減少由植物性飼料中具有抗原性的大分子物質(以蛋白質和碳水化合物為主)引起的短暫性過敏反應，可在斷乳早期降低斷奶獺兔的腹瀉率和死亡率，但后期效果不明顯。

IgG是動物機體抗感染免疫的主力，可作為血液學診斷和疫苗免疫后監(jiān)測的主要抗體。在動物機體內IgG不僅含量高，而且持續(xù)時間長，可發(fā)揮抗菌、中和病毒和毒素等免疫學活性[6]。本試驗中，正常飲水的獺兔血液IgG含量極顯著低于其他組，說明給獺兔添加適宜水平的乳化劑能有效促進免疫球蛋白合成，進而增加機體免疫力和對外界不良環(huán)境的抵抗力。劉兆陽等[7]的試驗同樣證明乳化劑對肉雞血清IgA和IgM含量有顯著的提高作用。

多種維生素如維生素A、維生素D、維生素C等均具有抗氧化的作用。SOD作為抗氧化系統(tǒng)中的重要酶系，其活性與機體清除自由基的能力成正比，而MDA是細胞膜脂質過氧化的產(chǎn)物，其含量可間接反映細胞損傷程度。本試驗中，對照組Ⅰ的血液MDA含量最低，顯著低于對照組Ⅱ，但與各試驗組間不存在顯著性差異，說明各組獺兔不存在明顯的氧化損傷；而對照組Ⅰ血液SOD活性和T-AOC也相對較低，推測飲水中添加的吐溫-80+丙三醇能一定程度上提高機體清除自由基的能力，可做進一步研究。此外，試驗組Ⅱ的血液MDA含量和T-AOC均顯著高于試驗組Ⅲ和試驗組Ⅰ，隨復合維生素納米乳添加量的增加呈先增加后降低的趨勢。李萬佳[8]在飼糧中添加不同水平的維生素D，結果發(fā)現(xiàn)，隨著飼糧維生素D含量的增加，生長獺兔血液SOD活性、MDA含量和T-AOC均呈先增加后降低的趨勢。陳倩等[9]在遼寧絨山羊種公羊飼糧中添加不同水平的維生素E，其血液中抗氧化指標同樣呈先增加后降低的趨勢。上述結果說明適量的維生素能提高機體的抗氧化能力，維生素不足或過量均會降低抗氧化能力。

3.2 飲水中添加復合維生素對生長獺兔腸道組織結構和盲腸微生態(tài)的影響

小腸的形態(tài)結構與營養(yǎng)物質的消化吸收密切相關。V/C綜合反映了腸道的功能狀態(tài)，該比值下降表明動物腸道受損，消化吸收功能下降，同時動物可能表現(xiàn)出生長受阻等現(xiàn)象；該比值上升則表明腸道黏膜功能得到改善，吸收功能增強[10]。腸上皮淋巴細胞(iIEL)定位于消化道黏膜上皮細胞間，與腸上皮細胞緊密接觸并相互作用，介導黏膜局部免疫防御和維持腸黏膜組織穩(wěn)定性。

小腸分十二指腸、空腸、回腸3個腸段，其中十二指腸、空腸的皺襞和絨毛相對發(fā)達、濃密，為淀粉、脂肪和蛋白質消化吸收的主要場所，而回腸的杯狀細胞及淋巴組織則相對發(fā)達。獺兔為草食性動物，其飼糧結構以草食纖維為主，而盲腸是獺兔消化纖維飼料的主要場所?；啬c是連接小腸與盲腸的重要過渡腸段，因此研究回腸的組織結構對獺兔的消化吸收及免疫有著重要作用。

本試驗結果顯示，3個試驗組之間獺兔回腸、蚓突單層柱狀上皮中淋巴細胞和杯狀細胞比例均無顯著差異，與對照組Ⅰ之間也沒有顯著差異，說明不同維生素水平對腸道免疫功能沒有顯著影響。對照組Ⅰ的回腸V/C極顯著低于其他4組，而回腸單層柱狀上皮中淋巴細胞比例也顯著低于對照組Ⅱ，說明其他4組飲水中所含的吐溫-80和丙三醇能一定程度提高腸道免疫功能，其原因可能是吐溫-80和丙三醇能維持獺兔腸道內環(huán)境，改善腸道菌群結構，從而影響腸黏膜中淋巴細胞數(shù)量。

HiSeq測序結果顯示，對照組Ⅰ的盲腸菌群多樣性顯著高于試驗組Ⅱ和對照組Ⅱ，而厚壁菌門的相對豐度顯著低于試驗組Ⅱ，說明適量的吐溫-80和丙三醇增加了厚壁菌門中某種微生物的競爭優(yōu)勢，提高了其在盲腸中的數(shù)量，從而降低了獺兔盲腸內菌群的多樣性。黃英等[11]試驗證明瘤胃細菌細胞膜存在大量脂類，當表面活性劑與細菌作用時，可改變細菌細胞表面的親疏水性，從而改變細菌的黏附性，這可能是導致盲腸菌群多樣性和相對豐度發(fā)生變化的重要原因之一。張慧玲等[12]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加吐溫-20和吐溫-80后，高劑量的吐溫-20使綿羊瘤胃中優(yōu)勢菌種類增加，吐溫-80和低劑量的吐溫-20使優(yōu)勢菌種類下降，這與本試驗的結果相一致。

獺兔盲腸菌群相對豐度分析結果顯示，各試驗組獺兔盲腸菌群以厚壁菌門為主，其中試驗組Ⅱ厚壁菌門的相對豐度顯著高于對照組Ⅰ和Ⅱ。門水平上各組盲腸菌群相對豐度排序為厚壁菌門>擬桿菌門>變形菌門>柔膜菌門，與朱巖麗[13]的試驗結果一致，Monteils等[14]的報道也證實了該結果。單胃動物盲腸菌群的多樣性較高，以厚壁菌門中的梭菌Ⅳ群、梭菌ⅩⅣ群和擬桿菌門為最優(yōu)勢菌群，細菌數(shù)量為1012～1013CFU/g內容物。目前發(fā)現(xiàn)人體腸道中與肥胖有關的細菌主要有厚壁菌門和擬桿菌門，其中梭菌屬是厚壁菌門中非常重要而且數(shù)量龐大的一類菌。對嚙齒動物和人的研究發(fā)現(xiàn)，相對于正常體態(tài)，肥胖機體的腸道菌群多樣性、細菌基因的表現(xiàn)形式和代謝途徑包括營養(yǎng)素的攝入等均發(fā)生了變化[15]。其中，肥胖機體的腸道厚壁菌數(shù)量增加，擬桿菌數(shù)量減少，這種結構特點使腸道菌群能從飲食中特異地增加營養(yǎng)的吸收，并為宿主提供額外的能量，導致機體能量攝入過多引起肥胖[16]。由此說明，適當?shù)耐聹?80和丙三醇能明顯改變獺兔盲腸內厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度，從而改變獺兔盲腸菌群結構，繼而提高獺兔的生長性能。

4 結 論

飲水中添加含獺兔生長階段需要量100%的復合維生素納米乳能夠在一定程度上提高生長獺兔的免疫功能和抗氧化能力，并改善其腸道組織結構和盲腸微生態(tài)環(huán)境。