張春燕 文登鑫 姚文祥 李小勤 吳世林 冷向軍*
(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,水產(chǎn)科學(xué)國家級教學(xué)示范中心,上海 201306;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,農(nóng)業(yè)部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心,上海 201306;3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 201306;4.廣州智特奇生物科技有限公司,廣州 510663)
近年來,虹鱒(Oncorhynchusmykiss)在我國的養(yǎng)殖發(fā)展迅猛,至2019年養(yǎng)殖產(chǎn)量已達(dá)到3.937萬t,是我國重要的冷水性經(jīng)濟魚類。虹鱒的肌肉紅度值是市場評價其品質(zhì)的一個重要標(biāo)準(zhǔn),生產(chǎn)中往往會通過外源添加蝦青素的方式改善虹鱒肌肉色澤。目前,生產(chǎn)上使用的蝦青素主要為合成蝦青素(Ast),其成本占飼料總成本的10%~20%[1]。Ast由于存在不同立體異構(gòu)性以及可能的合成中間體的殘留,故其安全性問題一直存在爭論。天然來源的蝦青素有雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)[2]、紅法夫酵母(Phaffiarhodozyma)[3]、鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)[4]、小球藻(Chlorellazofingiensis)[5]等,天然來源蝦青素較為穩(wěn)定,使用安全,但存在提取工藝復(fù)雜、價格高等問題。
夏側(cè)金盞花(AdonisaestivalisL.),又名福壽花,屬毛茛科(Ranunculaceae),側(cè)金盞花屬(AdonisL.),其花瓣中含有豐富的類胡蘿卜素,其中蝦青素含量占類胡蘿卜素總量的80%以上,約為花瓣干重的1%,是一種優(yōu)質(zhì)的天然蝦青素源[6]。然而,目前有關(guān)夏側(cè)金盞花的研究主要側(cè)重于其中富含的強心甙方面[7],有關(guān)其作為著色劑的研究很少。Kamata等[8]用添加5.05%福壽花花瓣(AF)和0.01%福壽花提取物(AE)(折算成蝦青素含量均為100 mg/kg)的飼料飼喂虹鱒3個月,結(jié)果AF組產(chǎn)生了高死亡率(30%),AE組雖增加了肌肉紅度值,但肌肉中蝦青素沉積量很低,僅為1.17 mg/kg,達(dá)不到市場要求(6 mg/kg)。
雨生紅球藻,屬綠藻門(Chlorophyta),團藻目(Volvocales),紅球藻屬(Haematococcus),是目前所有已知天然蝦青素積累量最高的生物,其蝦青素積累量可達(dá)干重的5%[9]。雨生紅球藻中的蝦青素通常以酯的形式存在,構(gòu)型為純左旋結(jié)構(gòu)(3S,3’S),是抗氧化活性最強的一種構(gòu)型[10]。然而,雨生紅球藻具有較厚的細(xì)胞壁,會阻礙魚類對類胡蘿卜素的吸收利用[11],降低了藻粉直接作為餌料的利用率。因此,雨生紅球藻作為蝦青素源添加到飼料中,應(yīng)選用適當(dāng)?shù)钠票诜椒?,若破壁方法不?dāng),破壁不完全,會影響蝦青素的活性和利用率。雨生紅球藻藻粉在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的報道已見于虹鱒[12]、大西洋鮭(Salmosalar)[13]、赤鯛(Pagruspagrus)[14]、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[15]、歐鯰(Silurusglanis)[16]等,這些研究表明雨生紅球藻具有良好的著色和抗氧化作用,并能改善生長性能,提高魚體免疫力。目前在雨生紅球藻上的研究多基于藻粉,而雨生紅球藻提取物(HE)的研究相對較少[2,17],尤其是在鮭鱒魚類著色方面。
作為天然蝦青素源,AF、AE、HE在改善虹鱒肉色和機體抗氧化性能方面的作用效果如何?與Ast相比,其效果如何?尚未有明確報道。因此,本試驗以虹鱒為研究對象,在飼料中分別添加Ast、AF及AE和HE,考察其對虹鱒生長性能、色素沉積和抗氧化能力的影響,為天然蝦青素源在水產(chǎn)飼料中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。
Ast、AF、AE和HE(正丁烷浸提法)均由廣州某生物科技股份有限公司提供,蝦青素含量分別為10.30%、1.54%、2.90%和2.26%。
試驗配制5種等氮等能的飼料,分別為基礎(chǔ)飼料和在基礎(chǔ)飼料中分別添加1.0 g/kg Ast、6.5 g/kg AF、3.4 g/kg AE、4.4 g/kg HE的試驗飼料,折算成蝦青素添加量均為100 mg/kg。各種飼料原料粉碎后過60目篩,按飼料配方(表1)逐級混勻,用單螺桿擠壓機制粒成直徑為2.0 mm的硬顆粒沉性飼料[制粒溫度為(85±5)℃],用鼓風(fēng)干燥箱40 ℃烘干至水分含量低于10%,密封保存?zhèn)溆?。?jīng)檢測,這5種飼料中蝦青素含量分別為11.00、95.23、101.32、104.25和93.52 mg/kg。
表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))
試驗用虹鱒購自四川省眉山市東坡區(qū)天貴水產(chǎn)養(yǎng)殖場。試驗開始前,將虹鱒暫養(yǎng)2周以適應(yīng)試驗環(huán)境。正式試驗前停止投喂24 h,選取體質(zhì)健壯、大小均勻的虹鱒375尾[平均體重為(6.28±0.07)g],隨機分配到15個自動充氣循環(huán)玻璃缸內(nèi)(0.60 m×0.60 m×0.50 m),每缸25尾魚,共5組,每組3個重復(fù)。養(yǎng)殖試驗開始前,取20尾虹鱒于-20 ℃保存,用于初始全魚常規(guī)成分分析。養(yǎng)殖期間,每天投喂2次(09:00、16:00),日投喂量為體重的2%~3%,根據(jù)魚的攝食情況和天氣情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整,各組投喂水平基本保持一致,以每次投喂無殘餌為宜。養(yǎng)殖期間水溫為13~18 ℃,溶氧含量為6~7 mg/L,pH為7.24~7.78,氨氮含量≤0.2 mg/L,亞硝酸鹽含量≤0.1 mg/L。每天在上午攝食1~2 h后采用虹吸法吸走缸底糞便,每周換水2次,換水量為缸體水量的1/3。養(yǎng)殖試驗在上海海洋大學(xué)魚類營養(yǎng)實驗室進(jìn)行,共持續(xù)6周。
樣品采集參照Zhao等[18]方法,在養(yǎng)殖第2、4和6周末,魚體饑餓24 h后,每缸隨機取3尾魚,用100 mg/L MS-222麻醉。于尾靜脈處采血,8 000 r/min離心10 min,取血清-80 ℃保存,用于測定血清類胡蘿卜素含量。取血后,剝離兩側(cè)背部皮膚,取側(cè)線與背鰭之間的肌肉,測定色差值后,與皮膚和尾鰭于-20 ℃保存,用于測定組織蝦青素含量。6周養(yǎng)殖試驗結(jié)束后,魚體饑餓24 h,對所有缸中虹鱒進(jìn)行稱重,記錄重量及尾數(shù),從中取3尾魚麻醉后于-20 ℃保存,用于測定全魚常規(guī)成分和蝦青素含量。另取6尾魚,3尾采用上述方法采集肌肉、肝臟和血清用于抗氧化能力的測定;另外3尾魚,采集背部兩側(cè)肌肉各1.5 g,分別用于滴水損失和冷凍損失的測定。
1.5.1 生長性能
根據(jù)虹鱒初重、末重、尾數(shù)和投喂量,計算成活率、增重率和飼料系數(shù),計算公式如下:
增重率(%)=100×[末重(g)-初重(g)]/初重(g);成活率(%)=100×試驗?zāi)~尾數(shù)(尾)/試驗初魚尾數(shù)(尾);飼料系數(shù)=總攝食量(g)/[末重(g)-初重(g)]。
1.5.2 飼料和全魚組成
末全魚、初始全魚和飼料粉碎后,參照AOAC(2000)進(jìn)行常規(guī)成分分析,方法如下:水分含量采用105 ℃烘干法測定;粗蛋白質(zhì)含量采用自動凱氏定氮儀(2300-Auto-Analyzer,Fosstecator,瑞典)測定;粗脂肪含量采用氯仿甲醇浸提法測定;粗灰分含量采用550 ℃馬弗爐(SXL-1008馬弗爐,上海精宏實驗設(shè)備有限公司)灼燒法測定。
1.5.3 肌肉色差值
虹鱒抽血剝皮后,取側(cè)線與背鰭之間的肌肉,用吸水紙將表面水分吸干,再將WSC-S色差計(WSC-S colorimeter,o/d光源,帶光澤,穩(wěn)定性ΔY≤0.6,上海精密科學(xué)儀器有限公司物理光學(xué)儀器廠)探頭緊貼于肌肉朝向背脊的一面測量,記錄亮度、紅度和黃度值。
1.5.4 蝦青素含量
肌肉和全魚蝦青素含量參考Zhang等[19]方法,采用氯仿-乙醇(1∶1)萃取法測定;皮膚和鰭條蝦青素含量參考Song等[20]方法,采用二氯甲烷-甲醇溶液(1∶3)萃取法測定。測得吸光度(OD)值后根據(jù)蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蝦青素含量(蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品購于上海吉至生化科技有限公司,產(chǎn)品編號A18781)。蝦青素沉積率計算公式如下:
蝦青素沉積率(%)=100×[末全魚蝦青素含量(mg/kg)×末重(kg)-初始全魚蝦青素含量(mg/kg)×初重(kg)]/[投飼量(kg)×飼料蝦青素含量(mg/kg)]。
1.5.5 血清總類胡蘿卜素含量
取0.2 mL血清加入0.4 mL 95%乙醇斡旋混合后,加入1 mL正己烷斡旋混合,1 000 r/min離心5 min,取上清液在470 nm下測定OD值,根據(jù)全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總類胡蘿卜素含量。全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參考Tolasa等[13]。
血清類胡蘿卜素含量(μg/mL)=OD值×10 000/消旋系數(shù)E。
1.5.6 肌肉持水力
取虹鱒一側(cè)背部肌肉(1.5 g),稱重(W1)后用細(xì)鐵絲懸掛于4 ℃冰箱中,分別于2、4、6 h取出,用吸水紙輕輕拭去表面水分后稱重,記錄重量(W2)。取另一側(cè)背部肌肉(1.5 g),稱重(W3)后裝袋密封,置于-20 ℃冰箱,24 h后取出,室溫解凍10 min,用吸水紙輕輕拭去表面水分后稱重,記錄重量(W4)。滴水損失和冷凍損失計算公式如下:
滴水損失(%)=100×[(W1-W2)/W1];冷凍損失(%)=100×[(W3-W4)/W3]。
1.5.7 血清、肌肉和肝臟的抗氧化能力
肝臟和背部肌肉于4 ℃解凍后,用0.9%生理鹽水制成20%的組織勻漿液,2 500 r/min離心10 min,取上清備用。血清、肌肉和肝臟的抗氧化性能指標(biāo)包括:肌肉和肝臟總蛋白(TP)含量,血清、肌肉和肝臟的丙二醛含量(MDA)含量、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性以及抑制羥自由基能力。以上指標(biāo)的測定均按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書操作,其中蛋白質(zhì)總量采用考馬斯亮藍(lán)法測定,MDA含量采用硫代巴比妥酸(TAB)法測定,抑制羥自由基能力根據(jù)Fenton反應(yīng)測定。
血清和組織T-SOD活性單位定義(U/mL):每毫升反應(yīng)液中和每毫克組織蛋白質(zhì)在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD量為1個SOD活性單位(U)。
試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),結(jié)合Tukey’s法進(jìn)行多重比較,差異顯著水平為P<0.05。
由表2可知,養(yǎng)殖6周后,Con、Ast、AE和HE組在增重率、飼料系數(shù)和成活率上均無顯著差異(P>0.05);AF組在增重率上顯著低于其他組(P<0.05),飼料系數(shù)顯著高于其他組(P<0.05),與對照組相比,AF組增重率降低13.5%,飼料系數(shù)增加0.10(P<0.05)。
表2 不同來源蝦青素對虹鱒生長性能的影響
由表3可知,各組間虹鱒全魚常規(guī)成分組成,包括水分、粗蛋白質(zhì)、粗灰分和粗脂肪含量,均無顯著差異(P>0.05)。
表3 不同來源蝦青素對虹鱒全魚常規(guī)成分的影響
由圖1可知,隨著養(yǎng)殖時間的延長,各組虹鱒肌肉亮度值減小,肌肉紅度值增大;Ast、AF、AE和HE組的肌肉亮度值在各時間點上均顯著低于對照組(P<0.05),紅度和黃度值顯著高于對照組(P<0.05);在第6周時,各蝦青素添加組間的肌肉亮度、紅度值無顯著差異(P>0.05),AE和HE組的肌肉黃度值顯著高于Ast和AF組(P<0.05)。
數(shù)據(jù)點標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。
由表4可知,各蝦青素添加組的不同組織中蝦青素含量均隨養(yǎng)殖時間的增加而升高。在第2、4、6周時,Ast、AF、AE和HE組的肌肉、皮膚和尾鰭蝦青素含量均顯著高于對照組(P<0.05);第6周時,HE組的肌肉蝦青素含量最高,AF組的皮膚和尾鰭蝦青素含量最高;在全魚蝦青素含量和蝦青素沉積率方面,Ast、AF、AE和HE組均無顯著差異(P>0.05),全魚蝦青素含量均顯著高于對照組(P<0.05),蝦青素沉積率均顯著低于對照組(P<0.05)。
表4 不同來源蝦青素對虹鱒各組織蝦青素含量和沉積率的影響
由表5可知,各組血清類胡蘿卜素含量隨養(yǎng)殖時間的增加而增加,Ast、AF(除第2周外)、AE和HE組血清類胡蘿卜素含量在第2、4、6周時均顯著高于對照組(P<0.05),且在第4、6周時相互之間無顯著差異(P>0.05)。
表5 不同來源蝦青素對虹鱒血清類胡蘿卜素含量的影響
由表6可知,各蝦青素添加組肌肉和血清的T-SOD活性和MDA含量均顯著低于對照組(P<0.05),Ast、AF、AE和HE組各組織的抑制羥自由基能力均顯著高于對照組(P<0.05);AF組的肌肉抗氧化指標(biāo)與AE組無顯著差異(P>0.05),但肝臟抑制羥自由基能力顯著低于AE組(P<0.05),血清T-SOD活性顯著高于AE組(P<0.05);AE和HE組的肌肉、肝臟和血清抗氧化指標(biāo)與Ast組均無顯著差異(P>0.05)。
表6 不同來源蝦青素對虹鱒肌肉、肝臟和血清抗氧化能力的影響
由表7可知,各組的滴水損失隨時間的延長而增加,Ast、AE和HE組的滴水損失(除Ast組2 h的滴水損失外)和冷凍損失均顯著低于對照組(P<0.05);此外,AF組4、6 h的滴水損失也顯著低于對照組(P<0.05),冷凍損失與對照組無顯著差異(P>0.05)。
表7 不同來源蝦青素對虹鱒肌肉持水力的影響
關(guān)于Ast和HP對魚類生長的影響均存在不同報道。Christiansen等[21]和王磊等[22]分別在大西洋鮭魚種(1.75 g)和七彩神仙魚飼料中添加Ast和HP,兩者的生長性能均得到了顯著提高。然而,Page等[23]、Yanar等[24]和Amar等[25]分別在飼料中添加50、70和100 mg/kg Ast,對虹鱒的生長性能均無顯著影響。Pham等[2]在飼料中添加2.0 g/kg HE(折算成蝦青素含量為100 mg/kg),對牙鲆幼魚增重率、特定生長率和存活率也無顯著影響。本試驗中,Ast和HE的添加,對虹鱒的生長性能也無顯著影響,盡管兩者的飼料系數(shù)略高于對照組,但無顯著差異,可能是由試驗誤差引起。蝦青素對魚類生長性能的作用效果,可能與魚的種類、性別、生長階段、飼料組成、養(yǎng)殖條件等因素有關(guān)。
本試驗中,AF的添加雖然對虹鱒存活率沒有產(chǎn)生影響(為100%),卻降低了魚體生長性能,這在一定程度上反映了花瓣中所含的生物堿、強心甙等有毒有害物質(zhì)對攝食和飼料利用產(chǎn)生了負(fù)面影響,表明AF不宜直接添加到虹鱒飼料中。為減輕或消除AF中有毒有害物的影響,對其中的蝦青素進(jìn)行提取是一條有效的途徑。強心甙是水溶性物質(zhì),而蝦青素的提取是一個有機溶劑萃取的過程,故AE中已基本不含強心甙物質(zhì)。有研究表明,飼料中添加0.01%的AE(折算成蝦青素添加量為100 mg/kg)對虹鱒生長性能無顯著影響[8],本試驗在飼料中添加3.4 g/kg AE,對虹鱒的生長性能也沒有產(chǎn)生不利影響。今后,福壽花資源的開發(fā)利用應(yīng)走活性物質(zhì)提取這條道路。
虹鱒的肌肉紅度值是其品質(zhì)的一個重要評價標(biāo)準(zhǔn),主要取決于體內(nèi)蝦青素的沉積。Rahman等[26]以添加100 mg/kg Ast的飼料飼喂體重18.5 g的虹鱒10周,顯著增加了肌肉紅度值,肌肉蝦青素含量達(dá)到6.1 mg/kg。Zhang等[19]用添加了100 mg/kg的Ast飼料飼喂101 g的虹鱒60 d,肌肉紅度值顯著增加,蝦青素含量達(dá)到8.03 mg/kg;De La Mora等[27]在飼料中添加80 mg/kg Ast,飼喂體重161 g的虹鱒6周后,肌肉蝦青素含量可達(dá)8.8 mg/kg。本試驗虹鱒養(yǎng)殖6周后,HE和AE組的肌肉紅度值、蝦青素含量均顯著增加,達(dá)到和Ast一致的水平,但肌肉蝦青素含量偏低,僅為4.96~5.26 mg/kg,可能與養(yǎng)殖時間較短(6周)以及試驗魚的規(guī)格較小有關(guān)(初重為6.28 g)。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中,通常是在上市前一段時間對虹鱒肌肉進(jìn)行著色,本試驗采用的虹鱒規(guī)格較小,主要是考慮到小規(guī)格魚種在實驗室條件下易于開展養(yǎng)殖,可在更大范圍內(nèi)進(jìn)行蝦青素源的篩選,從而為虹鱒成魚著色試驗的開展奠定基礎(chǔ)。
此外,本試驗在飼料中分別添加Ast、AF和AE均顯著提高了虹鱒的肌肉紅度和黃度值;其中Ast和AE組在養(yǎng)殖6周末,肌肉紅度值和蝦青素含量均無顯著差異,這與Kamata等[28]在虹鱒上的研究結(jié)果一致。然而,Kamata等[8]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加5.05% AF(折算成蝦青素添加量為100 mg/kg)對虹鱒的肉色無顯著影響,其原因可能是試驗飼料在制作5~6 d后出現(xiàn)了輕微變味,對虹鱒的攝食量產(chǎn)生了較大影響,從而導(dǎo)致色素沉積效果較差。
AF和HP中的蝦青素多數(shù)以酯的形式存在[29],而人工Ast為游離態(tài)[9]。有研究表明,酯化蝦青素更有利于動物體吸收,這可能與蝦青素酯極性小,在消化道中的溶解性好有關(guān)[30-31];而Henmi等[32]認(rèn)為,在同等蝦青素添加量下,游離蝦青素的著色效果優(yōu)于酯化蝦青素,這可能是因為游離蝦青素與肌動球蛋白結(jié)合緊密,單酯化的蝦青素與肌動球蛋白結(jié)合弱,而二酯則完全不結(jié)合[32],由此導(dǎo)致酯化蝦青素的沉積效果差。然而,在本試驗中,AF、AE和HE組的蝦青素沉積與Ast組無顯著差異,與Bowen等[33]用添加單酯、雙酯和Ast的飼料飼喂虹鱒的研究結(jié)果一致。Schiedt[34]和周慶新等[35]研究認(rèn)為,蝦青素酯進(jìn)入動物體后需要進(jìn)行水解才能被吸收利用。蘇芳[36]的研究也發(fā)現(xiàn),雨生紅球藻源蝦青素在虹鱒體內(nèi)傳遞的過程中發(fā)生了脫酯化。這些研究均表明,蝦青素的酯化并不影響虹鱒對其的吸收利用。
Rahman等[26]和Zhang等[19]分別在飼料中添加50和100 mg/kg蝦青素投喂虹鱒,顯著降低了血清SOD活性;虹鱒攝食添加紅法夫酵母[37]和Ast[18-19]的飼料后,肌肉MDA含量顯著降低。此外,在馬脂鯉(HyphessobryconequesSteindachner)、艷脂鯉(Hyphessobryconcallistus)和斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)飼料中添加Ast也顯著提高了機體抗氧化能力[38-40]。同時,飼料中添加蝦青素還能增強虹鱒血清、肌肉和肝臟抑制羥自由基的能力[18,26]。本試驗在飼料中分別添加AE和HE,虹鱒肌肉、肝臟和血清中的抑制羥自由基能力顯著提高,T-SOD活性和MDA含量顯著降低,達(dá)到與Ast一致水平。蝦青素的抗氧化性能與其兩端的紫羅蘭酮環(huán)上的不飽和酮基和羥基有關(guān),這些結(jié)構(gòu)均具有較活潑的電子效應(yīng),可以吸引自由基或者向自由基提供電子,最終達(dá)到清除自由基,提高抗氧化的目的[41]。
系水力是指當(dāng)肌肉受到加壓、冷凍等外力作用時仍保持原有水分的能力,是反映肌肉品質(zhì)的一個重要指標(biāo),當(dāng)肌肉暴露于空氣中,會受到一定程度的氧化,致使肌肉表面水分揮發(fā),使得滴水損失增加;當(dāng)肌肉中存在如蝦青素、維生素E等抗氧化物質(zhì)時,可以減輕細(xì)胞膜的氧化程度,增強肌肉系水力[19,42]。在本試驗中,Ast、AE和HE組的滴水損失和冷凍損失較對照組均有顯著降低(Ast組2 h滴水損失除外)。可見,在飼料中添加Ast、AE和HE均能延長虹鱒肌肉的貨架壽命。本試驗還發(fā)現(xiàn),AE組在6 h的肌肉滴水損失低于Ast和HE組,這意味著AE改善肌肉貨架壽命的能力可能強于Ast和HE,這是否與AE中的其他抗氧化物質(zhì)有關(guān),有待于進(jìn)一步研究。
飼料中添加AE、HE能有效改善虹鱒肌肉顏色,增強機體抗氧化能力,達(dá)到和添加Ast一致的效果,但AF不宜直接用作虹鱒的著色劑。