飼糧氮硫比對(duì)藏羔羊瘤胃發(fā)育及微生物菌群結(jié)構(gòu)和功能的影響

閆小蘭 李鵬翔 侯生珍 魏 濤 賈建磊*

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016；2.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016；3.山東省煙臺(tái)市蓬萊市畜牧獸醫(yī)站，煙臺(tái) 265600)

青海省有著全國(guó)45%的藏羊資源，藏羊肉作為優(yōu)質(zhì)的肉品具有蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低、礦物質(zhì)豐富、口感鮮嫩、膻味少等優(yōu)點(diǎn)。隨著我國(guó)居民生活水平的提高，對(duì)藏羊肉需求量增加，因此，探索提高藏羊生產(chǎn)性能的方法尤為重要。蛋氨酸是牛、羊等動(dòng)物的限制性氨基酸，在瘤胃微生物的作用下的凈降解高達(dá)60%[1]。硫作為蛋氨酸的合成元素，同時(shí)也是自然界中較豐富的礦物質(zhì)元素之一，與動(dòng)物體內(nèi)碳水物的化合合成、脂肪代謝及蛋白質(zhì)代謝等活動(dòng)密切相關(guān)[2]。動(dòng)物缺硫則出現(xiàn)食欲減退、毛品質(zhì)下降、體質(zhì)虛弱、甚至死亡；但硫過量也會(huì)降低動(dòng)物的采食量、飼糧轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)性能，并干擾其他礦物元素的吸收利用[3-5]。不同動(dòng)物在不同的生長(zhǎng)時(shí)期補(bǔ)充一定的硫能夠提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能[6-7]。當(dāng)硫不過量飼喂時(shí)，有機(jī)硫和無機(jī)硫的消化相似，有機(jī)硫還原成硫化物的可能性較小，更容易直接被瘤胃微生物利用轉(zhuǎn)化為微生物蛋白質(zhì)[8]。研究表明，反芻動(dòng)物硫需要量通常以氮硫比的形式表示。適宜的氮硫比可提高瘤胃纖維物質(zhì)的消化以及纖維消化酶的活性，促進(jìn)瘤胃微生物蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)氮的沉積，從而促進(jìn)反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)[9-10]。我國(guó)目前藏羊飼養(yǎng)仍以粗秸稈類主，其中含硫氨基酸缺乏、非蛋白氮比例大，因此，研究藏羊飼糧中適宜的氮硫比對(duì)促進(jìn)氮代謝以及提高飼糧利用率和藏羊生產(chǎn)水平具有重要意義。

NRC(1988)推薦反芻動(dòng)物氮硫比為10∶1；但根據(jù)目前研究發(fā)現(xiàn)該值無法滿足不同動(dòng)物在不同時(shí)期的需求[11]。前蘇聯(lián)標(biāo)準(zhǔn)[12]推薦毛肉兼用型綿羊飼糧適宜氮硫比為5∶1～6∶1，肉毛兼用型綿羊?yàn)?∶1～7∶1，生長(zhǎng)期綿羊?yàn)?∶1～9∶1。研究發(fā)現(xiàn)，安哥拉山羊產(chǎn)毛期的飼糧適宜氮硫比為7.2∶1.0[13]；內(nèi)蒙古白絨山羊在絨生長(zhǎng)旺盛期的飼糧適宜氮硫比為7.11∶1.00，在生長(zhǎng)緩慢期的飼糧適宜氮硫比為7.80∶1.00[14]。馮媛[10]通過體外模擬發(fā)現(xiàn)，飼糧氮硫比為7∶1～8∶1的綿羊的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率最佳。

瘤胃是反芻動(dòng)物特有的消化器官，其內(nèi)定居著大量的微生物，能將固體飼料消化分解生成揮發(fā)性脂肪酸(VFA)、甲烷和微生物蛋白質(zhì)，進(jìn)而被胃腸道所吸收。適宜氮硫比能改善瘤胃的發(fā)酵環(huán)境，進(jìn)而影響瘤胃上皮的發(fā)育和瘤胃微生物的活性。各國(guó)的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)反芻動(dòng)物飼糧的適宜氮硫比的規(guī)定存在差異。已有的研究結(jié)果也不盡一致，而且多集中在產(chǎn)毛動(dòng)物上，并且多以無機(jī)硫?yàn)樘砑釉矗形催M(jìn)行有機(jī)硫?yàn)樘砑釉捶矫娴难芯?。因此，本研究以青海省?dāng)?shù)氐奶厣锓N——藏羊?yàn)檠芯繉?duì)象，以生物學(xué)效率為100%的蛋氨酸為硫添加源，探究不同氮硫比對(duì)藏羔羊瘤胃組織形態(tài)、瘤胃液VFA含量以及微生物菌群結(jié)構(gòu)和功能的影響，以期為藏羊的高效養(yǎng)殖提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)飼糧

本試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇健康狀況良好、體重相近的60日齡斷奶藏羔羊150只，隨機(jī)分5組，每組30只。由于尿素不適用于在幼齡反芻動(dòng)物飼糧中應(yīng)用，因此本試驗(yàn)以蛋氨酸和賴氨酸替代精料補(bǔ)充料中的麩皮，以此調(diào)節(jié)各組飼糧的氮硫比分別為10.5∶1.0(A組)、9.0∶1.0(B組)、7.5∶1.0(C組)、6.0∶1.0(D組)、4.5∶1.0(E組)。據(jù)青海省當(dāng)?shù)仫暳显蠣I(yíng)養(yǎng)成分[10]配制能量和蛋白質(zhì)水平相似的5組飼糧，試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 飼養(yǎng)管理與樣品采集

各組分別以氮硫比不同的飼糧進(jìn)行限量飼喂。試驗(yàn)動(dòng)物采用全舍飼的飼養(yǎng)方式，按組分欄飼養(yǎng)，分別在每天08:00、16:00進(jìn)行飼喂，自由飲水。60日齡開始補(bǔ)飼(干物質(zhì)采食量為羔羊體重的3%，羔羊隨機(jī)采食)，預(yù)試期5 d，正試期120 d。羔羊飼養(yǎng)至180日齡后，每組隨機(jī)選擇6只羔羊早上空腹、頸動(dòng)脈放血屠宰后，解剖，采集瘤胃腹囊部位瘤胃組織用生理鹽水清洗后，放入4%的多聚甲醛中固定。另外采集瘤胃液50 mL，于4層滅菌紗布過濾后將濾液裝于5 mL凍存管中，放入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃冷凍保存，用于后期瘤胃微生物多樣性的測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 飼糧中營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

采用Foss半自動(dòng)凱氏定氮儀(Kjeltec 2100)測(cè)定粗蛋白質(zhì)(CP)含量，具體方法參考GB/T 6435—2006；粗脂肪(EE)含量使用SER148脂肪測(cè)定儀(索氏提取儀)進(jìn)行測(cè)定，具體方法參照GB/T 6433—2006；酸性洗滌纖維(ADF)、中性洗滌纖維(NDF)含量使用ANKOM A200i型半自動(dòng)纖維分析儀測(cè)定，具體方法參考袁翠林等[16]；粗灰分(Ash)含量采用茂福爐高溫灼燒法測(cè)定；鈣(Ca)、磷(P)、硫(S)含量的測(cè)定分別參考GB/T 6436—2002、GB/T 6437—2002、GB/T 17776—1999的方法測(cè)定。

1.3.2 瘤胃組織形態(tài)的測(cè)定

瘤胃組織在固定液中固定3 d，然后在不同濃度的葡萄糖下進(jìn)行梯度脫水，包埋劑冷凍包埋，切5～7 μm連續(xù)切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察瘤胃組織形態(tài)。使用Image-Pro Plus 5.1圖像分析系統(tǒng)測(cè)量瘤胃乳頭長(zhǎng)度、乳頭寬度、乳頭角化層厚度、黏膜層厚度、黏膜下層厚度及肌層厚度。每個(gè)樣本進(jìn)行3張非連續(xù)性切片的觀察，每張切片選取3個(gè)視野，每個(gè)視野中測(cè)定5組試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

瘤胃乳頭密度的測(cè)定：使用解剖顯微鏡對(duì)1 cm2的新鮮瘤胃組織樣品進(jìn)行直接計(jì)數(shù)，每只羊選取3個(gè)組織樣品計(jì)數(shù)，取平均值。

1.3.3 瘤胃液VFA含量測(cè)定

利用氣相色譜儀(Thermo Scientific，美國(guó))測(cè)定瘤胃液VFA含量。具體參考Liang等[17]方法。

1.3.4 微生物多樣性的測(cè)定

將采集的瘤胃液送到北京百邁客科技有限公司利用Illumina Hiseq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。主要操作流程：提取瘤胃液樣品中的總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量合格后，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)得到引物，在引物末端加上測(cè)序接頭，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一形成測(cè)序文庫(kù)，建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用Illumina Hiseq 2500進(jìn)行測(cè)序。

1.4 生物信息分析

將測(cè)序后得到的原始測(cè)序序列經(jīng)過PE reads拼接、Tags過濾、去除嵌合體等最終得到的有效序列，使用QIIME軟件對(duì)Tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類劃分操作分類單元(OTU)。將OTU的代表序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)可得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，進(jìn)而在各水平統(tǒng)計(jì)各樣品群落組成，利用QIIME軟件生成不同分類水平上的物種分類表，再利用R語(yǔ)言工具繪制成樣品各分類水平下的群落結(jié)構(gòu)圖。使用Mothur軟件對(duì)樣品α多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估；采用Binary-Jaccard距離算法在OTU水平上比較各樣品間微生物類群的組成差異；使用PICRUSt軟件通過比對(duì)16SRNA測(cè)序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，推測(cè)樣本中的功能基因組成，從而分析不同分組之間在功能上的差異。

1.5 數(shù)據(jù)分析

通過Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，應(yīng)用SAS 9.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧氮硫比對(duì)藏羔羊瘤胃組織形態(tài)的影響

由表2可知，B組瘤胃乳頭長(zhǎng)度、黏膜下層厚度以及肌層厚度顯著高于其他4組(P<0.05)，C、D、E組瘤胃乳頭長(zhǎng)度顯著高于A組(P<0.05)；B、C、D組瘤胃乳頭寬度顯著高于A、E組(P<0.05)；B、E組瘤胃乳頭密度顯著高于其他3組(P<0.05)；C組瘤胃角化層厚度顯著高于其他4組(P<0.05)，其他4組間差異不顯著(P>0.05)。

表2 飼糧氮硫比對(duì)藏羔羊瘤胃組織形態(tài)的影響

2.2 飼糧氮硫比對(duì)藏羔羊瘤胃液VFA含量的影響

由表3可知，B組瘤胃液總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸含量顯著高于其他4組(P<0.05)。

表3 飼糧不同氮硫比對(duì)藏羔羊瘤胃液VFA含量的影響

2.3 飼糧氮硫比對(duì)藏羔羊瘤胃微生物多樣性的影響

對(duì)30只藏羔羊瘤胃液樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，將得到的原始序列雙端Read拼接、過濾后共產(chǎn)生3 433 220條優(yōu)質(zhì)序列，基于相似度大于97%的原則，每個(gè)樣品至少產(chǎn)生87 770條優(yōu)質(zhì)序列，將測(cè)序獲得的有效序列進(jìn)行聚類，共獲得1 022個(gè)OTU，其中B組OTU數(shù)量顯著高于其他組(P<0.05)。由圖1可知，5組間共有632個(gè)OTU，A、B、C、D和E組的獨(dú)有OTU數(shù)量分別為13、23、22、8、8個(gè)。

圖1 藏羔羊瘤胃微生物Venn圖

應(yīng)用Binary-Jaccard算法在OTU水平上對(duì)所有樣品進(jìn)行主成分分析(PCoA)，由圖1可知，PC1軸的可信度為34.20%，PC2軸的可信度為10.06%，飼喂同一飼糧的藏羔羊瘤胃樣點(diǎn)相對(duì)聚集，飼喂不同飼糧的藏羔羊瘤胃樣點(diǎn)相對(duì)分散。

圖2 主成分分析圖

α多樣性指數(shù)可以反映瘤胃微生物的豐富度和均勻度。在同一測(cè)序深度下，比較5組的α多樣性指數(shù)，由表4可知，B、C組Shannon指數(shù)顯著高于A組(P<0.05)，其余各組間差異不顯著(P>0.05)；A組Simpson指數(shù)顯著高于其他4組(P<0.05)；B組Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)顯著高于其他4組(P<0.05)；基因文庫(kù)覆蓋率均大于99%，各組之間差異不顯著(P>0.05)。

表4 α多樣性指數(shù)

2.4 飼糧氮硫比對(duì)藏羔羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響

各樣本進(jìn)行I11uminaHiSeq測(cè)序平臺(tái)雙末端測(cè)序，所得有效序列在不同分類水平上進(jìn)行物種注釋和統(tǒng)計(jì)共得到19個(gè)門、94個(gè)科、228個(gè)屬。由圖3和表5可知，在門水平下相對(duì)豐度大于0.1%的前10個(gè)菌門中厚壁菌門(Firmicutes)為5組的優(yōu)勢(shì)菌門，A組厚壁菌門相對(duì)豐度顯著高于C組(P<0.05)。

表5 飼糧氮硫比飼糧對(duì)藏羔羊瘤胃細(xì)菌門水平相對(duì)豐度的影響

Others：其他；Cyanobacteria：藍(lán)藻菌門；Chloroflexi：綠彎菌門；Proteobacteria：變形菌門；Actinobacteria：放線菌門；Synergistetes：互養(yǎng)菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Firmicutes厚壁菌門。

由圖4和表6可知，在科水平下，5組中的優(yōu)勢(shì)菌科均為毛螺菌科(Lachnospiraceae)、克里斯滕森氏菌科(Christensenellaceae)、韋榮氏球菌科(Veillonellaceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)；D組毛螺菌科相對(duì)豐度顯著高于A、B、E組(P<0.05)；A組韋榮氏球菌科相對(duì)豐度顯著高于C、D組(P<0.05)，其他各組間無顯著差異(P>0.05)；各組克里斯滕森氏菌科(Christensenellaceae)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)相對(duì)豐度差異不顯著(P>0.05)。

表6 飼糧氮硫比飼糧對(duì)藏羔羊瘤胃細(xì)菌科水平相對(duì)豐度的影響

Unclassified：未分類；Others：其他；Prevotellaceae：普雷沃氏菌科；Rikenellaceae：理研菌科；Synergistaceae：互養(yǎng)菌科；Ruminococcaceae：瘤胃球菌科；Veillonellaceae：韋榮氏球菌科；Christensenellacea：克里斯滕森菌科；Lachnospiraceae：毛螺菌科。

2.5 功能預(yù)測(cè)分析

利用PICRUSt軟件對(duì)已測(cè)得的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，將得到的功能基因中的信息參考KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)2級(jí)功能層基因類別劃分歸類，5組藏羔羊瘤胃細(xì)菌在二級(jí)功能層共包含39種基因功能家族，其中碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、輔酶和維生素代謝以及核苷酸代謝的功能基因相對(duì)豐度在5組中較高。

3 討 論

反芻動(dòng)物瘤胃組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化可以反映其消化功能，瘤胃上皮組織與瘤胃內(nèi)容物直接接觸，其組織形態(tài)可依據(jù)不同的發(fā)酵水平及外部環(huán)境變化發(fā)生相應(yīng)形態(tài)學(xué)變化以滿足機(jī)體正常生理代謝需要。瘤胃乳頭增加了瘤胃上皮與內(nèi)容物的接觸面積，有利于瘤胃上皮對(duì)養(yǎng)分的吸收和離子轉(zhuǎn)運(yùn)[18]。瘤胃乳頭長(zhǎng)度、寬度和瘤胃壁的厚度是評(píng)價(jià)瘤胃發(fā)育的重要指標(biāo)[19]。刺激瘤胃乳頭發(fā)育的主要原因是有機(jī)酸的存在，尤其是VFA，其刺激強(qiáng)度順序?yàn)槎∷?丙酸>乙酸，這一順序與VFA被瘤胃壁組織的代謝程度相一致[20]。反芻動(dòng)物對(duì)飼料中碳水化合物的消化吸收是以在瘤胃內(nèi)生成VFA為主，VFA是反芻動(dòng)物主要的能量來源，主要由乙酸、丙酸和丁酸組成，能促進(jìn)反芻動(dòng)物腸胃運(yùn)動(dòng)，抑制腸胃中病原微生物的生長(zhǎng)[21]。飼糧中的纖維在纖維分解菌的作用下生成乙酸，淀粉分解菌能夠促進(jìn)丙酸的沉積，厚壁菌門是瘤胃內(nèi)重要的纖維消化菌[22]。張桂國(guó)等[23]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧氮硫比7.2∶1.0可提高丙酸在TVFA中的比例，降低乙酸/丙酸。殷云浩等[24]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧氮硫比為7.5∶1.0和9.0∶1.0可顯著降低氨態(tài)氮及乙酸、丙酸的比例。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧氮硫比為9.0∶1.0組的瘤胃內(nèi)的乙酸、丙酸、丁酸以及TVFA含量顯著高于其他各組，且乙酸/丙酸最低。乙酸/丙酸常作為評(píng)價(jià)瘤胃發(fā)酵類型的標(biāo)志，一般認(rèn)為乙酸/丙酸小于3屬于丙酸發(fā)酵類型，而大于3為乙酸發(fā)酵類型[25]。本試驗(yàn)瘤胃的乙酸/丙酸均在3以上，說明不同氮硫比沒有改變瘤胃發(fā)酵類型。飼糧氮硫比為9.0∶1.0時(shí)瘤胃乳頭長(zhǎng)度、寬度、密度及肌層厚度較高，這與瘤胃液VFA含量的變化相吻合。由于研究對(duì)象與前人不同，因此藏羊飼糧適宜氮硫比與前人研究結(jié)果不一致。

反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)聚集著大量依靠發(fā)酵來消化飼料的微生物，瘤胃微生物的組成與結(jié)構(gòu)是影響瘤胃發(fā)酵功能的重要因素。諸多要素影響瘤胃微生物區(qū)系的結(jié)構(gòu)，飼糧中的各元素也是其中的重要一項(xiàng)。硫作為動(dòng)物體內(nèi)常量礦物質(zhì)元素之一，是瘤胃微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分或作為酶、輔酶的成分，能夠影響瘤胃微生物的活性。礦物元素缺乏會(huì)降低瘤胃微生物的生長(zhǎng)效率，降低飼料消化率，使微生物群體數(shù)量減少，最終也會(huì)降低動(dòng)物對(duì)飼料的采食量[26]。分析瘤胃液樣品的OTU數(shù)量和α多樣性，其結(jié)果可以反映微生物群落的豐度和多樣性。本研究通過HiSeq測(cè)序發(fā)現(xiàn)氮硫比為9.0∶1.0組的瘤胃OTU數(shù)量及ACE、Chao1、Shannon指數(shù)高于其他各組，表明該氮硫比下藏羊瘤胃微生物種類較豐富。另外，本試驗(yàn)中各組覆蓋率均高于99%，覆蓋率高于97%說明測(cè)序樣品取樣充分[27]，因此，本次測(cè)序結(jié)果能真實(shí)地反映藏羔羊瘤胃細(xì)菌群落種類和結(jié)構(gòu)。

Amino acid metabolism：氨基酸代謝；Biosynthesis of other secondary metabolites；其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成；Cancers: Overview：癌癥：概述；Cancers: Specifictypes：癌癥：特定類型；Carbohydrate metabolism：碳水化合物代謝；Cardiovascular diseases：心血管疾病；Cell growth and death：細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡；Cell motility：細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；Cellular community：細(xì)胞群落；Circulatory system：循環(huán)系統(tǒng)；Development：發(fā)育成長(zhǎng)；Digestive system：消化系統(tǒng)；Drug resistance：耐藥性；Endocrine and metabolic diseases：內(nèi)分泌代謝疾?。籈ndocrine system：內(nèi)分泌系統(tǒng)；Energy metabolism：能量代謝；Environmental adaptation：環(huán)境適應(yīng)；Excretory system：排泄系統(tǒng)；Folding, sorting and degradation：折疊、分類和降解；Global and overview maps：全球和概覽地圖；Glycan biosynthesis and metabolism：聚糖生物合成與代謝；Immune diseases：免疫性疾??；Immune system：免疫系統(tǒng)；Infectious diseases: Bacterial：傳染?。杭?xì)菌性；Infectious diseases: Parasitic：傳染?。杭纳x??；Infectious diseases: Viral：傳染?。翰《拘?；Lipid metabolism：脂質(zhì)代謝；Membrane transport：膜傳輸；Metabolism of cofactors and vitamins：輔酶和維生素代謝；Metabolism of other amino acids：其他氨基酸代謝；Metabolism of terpenoids and polyketides：萜類化合物和聚酮類化合物的代謝；Nervous system：神經(jīng)系統(tǒng)；Neurodegenerative diseases：神經(jīng)變性疾??；Nucleotide metabolism：核苷酸代謝；Replication and repair：復(fù)制和修復(fù)；Sensory system：感覺系統(tǒng)；Signal transduction：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；Signaling molecules and interaction：信號(hào)分子與相互作用；Substance dependence物質(zhì)依賴性：Transcription轉(zhuǎn)錄；Translation：翻譯；Transport and catabolism：運(yùn)輸和分解代謝；Xenobiotics biodegradation and metabolism：外源生物降解與代謝。

微生物主要可分為細(xì)菌、原蟲和真菌三大類[28]。其中細(xì)菌是瘤胃中多樣化最高的群體，能夠利用纖維、淀粉、蛋白質(zhì)和糖，在動(dòng)物健康和生產(chǎn)性能中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門和擬桿菌門是反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌門[29-20]。本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)飼喂不同氮硫比飼糧的藏羔羊瘤胃液進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)各組的優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門，其他菌門的相對(duì)豐度較少。曾燕等[31]報(bào)道，綿羊瘤胃內(nèi)相對(duì)豐度最高的為厚壁菌門(44.37%)，蒙古羊瘤胃內(nèi)相對(duì)豐度最高的為擬桿菌門(67.00%)。韓旭峰[32]研究發(fā)現(xiàn)，80～110日齡陜北絨山羊瘤胃微生物以厚壁菌門為主。以上結(jié)果表明，瘤胃細(xì)菌菌體結(jié)構(gòu)受反芻動(dòng)物品種、日齡等因素的影響，其群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[33]。厚壁菌門中包含的瘤胃球菌屬、假丁酸弧菌屬、丁酸弧菌屬、顫螺旋菌屬以及真桿菌屬等菌屬主要參與纖維物質(zhì)的分解[34]。本研究中，各組厚壁菌門的相對(duì)豐度均高達(dá)84%以上，氮硫比為10.5∶1.0時(shí)厚壁菌門的豐度最高(93.96%)，顯著高于氮硫比為6.0∶1.0時(shí)，而在非纖維物質(zhì)的降解中發(fā)揮重要作用的擬桿菌門相對(duì)豐度最低(0.38%)，不利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化。研究表明，有機(jī)硫制劑能選擇性的刺激瘤胃纖維分解菌和真菌[35]。因此，氮硫比為10.5∶1.0時(shí)比較適于厚壁菌門的繁殖，不利于擬桿菌門的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)進(jìn)一步在科水平上的研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門下的毛螺菌科、克里斯滕森氏菌科、韋榮氏球菌科、瘤胃球菌科為各組的優(yōu)勢(shì)菌科。毛螺菌在消化纖維過程中與產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌具有協(xié)同作用，并且對(duì)病原菌具有拮抗作用[36-37]。韋榮氏球菌科與氨基酸、輔酶、能量和維生素的代謝，糖苷鍵代謝以次級(jí)代謝產(chǎn)物呈正相關(guān)[38]。本試驗(yàn)中，氮硫比為6.0∶1.0時(shí)毛螺菌科相對(duì)豐度顯著高于氮硫比為10.5∶1.0、9.0∶1.0、4.5∶1.0時(shí)，氮硫水平為10.5∶1.0時(shí)韋榮氏球菌科相對(duì)豐度顯著高于氮硫比為7.5∶1.0和6.0∶1.0時(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌種類對(duì)底物的偏好不同，由于毛螺菌科不易體外分離培養(yǎng)，對(duì)毛螺菌的生理特性理解不夠深入[39]。因此，這一變化機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

瘤胃微生物菌群發(fā)酵飼料為反芻動(dòng)物提供蛋白質(zhì)和能量，是一個(gè)龐大的生物資源庫(kù)，因此積極挖掘一些與營(yíng)養(yǎng)生理功能密切相關(guān)的瘤胃菌群功能基因是非常重要的，如碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、氨基酸運(yùn)輸和代謝、VFA的生成等[40]。Abhauer等[41]研究結(jié)果證實(shí)蛋白質(zhì)和碳水化合物的代謝是微生物生存必需的一項(xiàng)基本功能。本試驗(yàn)通過利用PICRUSt軟件對(duì)藏羔羊瘤胃細(xì)菌測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析后發(fā)現(xiàn)，碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、輔酶和維生素代謝以及核苷酸代謝的功能基因相對(duì)豐度在5組中較高。由此可知，藏羔羊瘤胃細(xì)菌在提高宿主纖維與蛋白質(zhì)的利用率至關(guān)重要。

4 結(jié) 論

① 飼糧氮硫比為9.0∶1.0時(shí)瘤胃組織形態(tài)發(fā)育較好，瘤胃液中VFA含量較高，瘤胃微生物的相對(duì)豐度及多樣性較高。

② 通過KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，羔羊瘤胃細(xì)菌基因功能主要集中在碳水化合物代謝和氨基酸代謝。

③ 飼糧氮硫比為9.0∶1.0更能經(jīng)濟(jì)有效地促進(jìn)瘤胃發(fā)育和改善羔羊瘤胃微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)。