N-myc下游調(diào)控基因1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性

郭晶晶，徐瀚峰，朱傳東，繆 祎，鄭 勤

0 引 言

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見(jiàn)的一種惡性腫瘤。在全球范圍內(nèi)，肝細(xì)胞癌是第六大最常見(jiàn)的癌癥和第四大癌癥死亡原因[1]。2018年，肝癌發(fā)病人數(shù)約為84.1萬(wàn)人，死亡人數(shù)為782 000人[1]。遺憾的是，由于早期發(fā)現(xiàn)困難，復(fù)發(fā)率高，目前對(duì)于大多數(shù)確診為中晚期的HCC患者尚無(wú)有效的治療方法。因此，探索可靠的HCC生物標(biāo)志物對(duì)早期診斷和預(yù)后尤為重要。N-myc下游調(diào)控基因1(N-myc downstream regulatory gene1，NDRG1)是NDRG家族的基因之一，在不同的腫瘤類型中表現(xiàn)出不同的抗腫瘤或致癌作用[2]。有研究表明，NDRG1作為抑癌基因在前列腺癌、胰腺癌和結(jié)直腸癌中低表達(dá)[3-5]。相反，有報(bào)道稱NDRG1在胃癌、宮頸癌、腎癌、鱗狀細(xì)胞癌等多種癌癥中過(guò)表達(dá)，提示其具有致瘤作用[6-10]。NDRG1在肝癌中的表達(dá)目前存在爭(zhēng)議。有研究認(rèn)為NDRG1在肝癌中高表達(dá)，NDRG1表達(dá)增加可促進(jìn)體外肝細(xì)胞癌和肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和血管生成，促進(jìn)了肝癌的發(fā)展[11-13]。但是其他一些研究人員認(rèn)為NDRG1作為抑癌基因在肝癌組織中低表達(dá)，抑制肝癌的發(fā)展[14-15]。本研究旨在探討NDRG1在肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá)，探討NDRG1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集從TCGA (The Cancer Genome Atlas) (https://portal.gdc.cancer.gov/repository)公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)(465例，包括58例正常肝組織標(biāo)本和407例肝癌標(biāo)本)及與之相應(yīng)的臨床信息。

1.2 NDRG1在正常肝組織和肝癌組織中的表達(dá)及其與臨床因素相關(guān)性分析407例肝癌患者的臨床資料，包括年齡、性別、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(TNM)分級(jí)、生存狀況和生存時(shí)間。使用R語(yǔ)言軟件(R 3.6.3)，采用Limma包檢測(cè)NDRG1在407例肝癌患者和58例正常肝組織中的表達(dá)。使用beeswarm包對(duì)407例肝癌患者和58例正常肝組織的NDRG1表達(dá)進(jìn)行了可視化。根據(jù)NDRG1表達(dá)的中位數(shù)，將所有患者分為NDRG1低表達(dá)組和NDRG1高表達(dá)組。使用survival包分析NDRG1低表達(dá)組和NDRG1高表達(dá)組的生存情況。使用logistic回歸分析NDRG1表達(dá)與臨床因素(年齡、性別、分期、分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移狀態(tài)、淋巴結(jié)狀態(tài)、組織學(xué)分級(jí))的相關(guān)性。

1.3 基因集富集分析(gene set enrichment analysis， GSEA)使用GSEA軟件，上傳407例肝癌組織中的NDRG1表達(dá)文件，比較NDRG1高表達(dá)和NDRG1低表達(dá)的數(shù)據(jù)集，依據(jù)功能基因集數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路，篩選HCC中潛在信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)可能的信號(hào)通路，探討NDRG1的生物學(xué)功能。富集結(jié)果必須滿足兩個(gè)條件:錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.05和P<0.05。

1.4 浸潤(rùn)免疫分析利用TIMER網(wǎng)站(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)在線研究NDRG1表達(dá)與肝癌免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的關(guān)系，得到NDRG1在HCC中的表達(dá)與CD4+T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的相關(guān)性。應(yīng)用CIBERSORT(http://cibersort.stanford.edu/)評(píng)估HCC中不同免疫浸潤(rùn)細(xì)胞與NDRG1表達(dá)的關(guān)系，并揭示免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性。將407例腫瘤標(biāo)本分為NDRG1高表達(dá)組和NDRG1低表達(dá)組，觀察2組免疫浸潤(rùn)細(xì)胞表達(dá)的差異。

1.5 使用Human Protein Atlas (HPA)數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證NDRG1蛋白表達(dá)為進(jìn)一步檢測(cè)NDRG1蛋白的表達(dá)，使用來(lái)自HPA公共數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.proteinatlas.org/)的免疫組織化學(xué)(IHC)數(shù)據(jù)，對(duì)HPA中NDRG1蛋白在肝正常組織切片和肝癌組織切片中的免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行檢索。比較NDRG1在正常肝組織和HCC組織中的蛋白表達(dá)。

1.6 使用基因型組織表達(dá)(GTEx)數(shù)據(jù)庫(kù)顯示NDRG1在人類肝組織中的表達(dá)GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)是一種包含人體各種器官遺傳信息的工具。GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)包含了來(lái)自44個(gè)組織的7000多份尸檢樣本的基因表達(dá)。使用GTEX數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.gtexportal.org/home/)，以發(fā)現(xiàn)NDRG1在正常人體組織中的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0和R 3.6.3進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用R軟件對(duì)NDRG1在TCGA數(shù)據(jù)集中的表達(dá)采用單因素Cox分析和多因素Cox分析。使用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)和logistic回歸比較TCGA數(shù)據(jù)集中肝癌樣本的臨床特征和NDRG1的表達(dá)的相關(guān)性?？傮w生存分析采用Kaplan-Meier法進(jìn)行雙側(cè)對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NDRG1在肝癌中的表達(dá)及臨床病理因素與正常組織相比，肝癌組織中NDRG1表達(dá)增加(P<0.001)。NDRG1表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)(G)(P<0.001)、臨床S分期(P=0.03)、臨床T分期(P=0.018)呈正相關(guān)。采用logistic回歸分析顯示NDRG1表達(dá)與臨床病理不良預(yù)后相關(guān)。NDRG1在肝細(xì)胞癌的高表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)(G)顯著相關(guān)(G3vsG1：OR=2.072，95%CI=1.091～3.992，P=0.027；G4vsG1：OR=6.957，95%CI=1.640～48.134，P=0.018)、臨床分期(S)顯著相關(guān)(ⅢvsⅠ：OR=1.832，95%CI=1.095～3.095，P=0.0221)和臨床T分期顯著相關(guān)(T3vsT1：OR=1.908，95%CI=1.142～3.224，P=0.0145)。見(jiàn)表1，圖1。提示NDRG1高表達(dá)對(duì)應(yīng)臨床分期較差，預(yù)后較差。HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索發(fā)現(xiàn)在正常肝組織中，NDRG1蛋白低表達(dá)，而在HCC組織中NDRG1蛋白高表達(dá)。

表1 肝細(xì)胞癌中NDRG1表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性

a:在正常肝組織和肝癌組織的表達(dá)；b:在正常肝組織及其相對(duì)應(yīng)肝癌組織的表達(dá)；c:年齡；d:性別；e:G分級(jí)；f:S分期；g:T分期；h:M分期；i:N分期圖1 NDRG1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)與臨床因素相關(guān)性

2.2 NDRG1在正常肝組織中的表達(dá)使用GTEx數(shù)據(jù)資料，發(fā)現(xiàn)NDRG1在不同組織中的表達(dá)不同，相比較其他正常組織，正常肝組織中NDRG1表達(dá)較低。

2.3 NDRG1表達(dá)與生存結(jié)果相關(guān)性及其單因素、多因素分析NDRG1的高表達(dá)與較差的總生存率顯著相關(guān)(P=0.005)，見(jiàn)圖2。單因素Cox分析顯示，NDRG1高表達(dá)與較差的總生存率顯著相關(guān)(HR=1.012，95%CI=1.008～1.015，P<0.001)。不良生存相關(guān)的臨床病理的特點(diǎn)包括S分期(HR=1.865，95%CI=1.456～2.388，P<0.001)，T分期(HR=3.850,95%CI=1.207～12.281,P=0.0228)和M分期(HR=3.850，95%CI=1.207～12.281，P=0.0228)。多因素Cox分析表明,高NDRG1表達(dá)是獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與肝細(xì)胞癌患者的總生存期密切相關(guān)(HR=1.010,95%CI=1.006～1.014，P<0.001)。見(jiàn)表2。

圖2 NDRG1在肝細(xì)胞癌患者中的表達(dá)與總生存率

2.4 GSEA識(shí)別NDRG1相關(guān)的信號(hào)通路GSEA顯示了在豐富MSigDB集合方面的顯著差異(h.all.v6.2.symbols.gmt)，F(xiàn)DR-q<0.25和P<0.05的基因組顯著富集。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的富集分?jǐn)?shù)，確定最顯著的富集信號(hào)通路。NDRG1高表達(dá)與DNA修復(fù)、E2F、G2M檢查點(diǎn)、MYC-V1、P53通路、TGF-β通路等相關(guān)。見(jiàn)圖3。

表2 NDRG1表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者生存結(jié)果的單因素Cox分析和多因素Cox分析

2.5 NDRG1表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的關(guān)系NDRG1表達(dá)與B細(xì)胞(P=2.33×10-9)、CD4+T細(xì)胞(P=2.68×10-5)、巨噬細(xì)胞(P=3.95×10-12)和樹(shù)突狀細(xì)胞(P=1.98×10-9)相關(guān)。與NDRG1低表達(dá)組相比，高表達(dá)組單核細(xì)胞和M0巨噬細(xì)胞升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

a:DNA修復(fù)；b:E2F通路；c:G2M檢查點(diǎn)；d:MYC-V1通路；e:P53通路；f:TGF-β通路圖3 基因集富集分析

a：與免疫細(xì)胞的相關(guān)性；b：NDRG1高、低表達(dá)組的免疫細(xì)胞水平圖4 肝細(xì)胞癌中NDRG1表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的關(guān)系

3 討 論

NDRG1是一個(gè)與細(xì)胞分化相關(guān)的基因，屬于NDRG家族。該基因編碼的蛋白質(zhì)是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白，參與應(yīng)激反應(yīng)、激素反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化[16]。在前列腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌等惡性腫瘤中下調(diào)表達(dá)是一種轉(zhuǎn)移抑制劑，可以抑制血管生成、細(xì)胞增殖和侵襲[17-19]。在肺癌、胃癌等惡性腫瘤中，表達(dá)上調(diào)并有致瘤作用[20-21]。NDRG1對(duì)癌癥患者的預(yù)后影響也不一致[22-23]。大多數(shù)關(guān)于NDRG1與肝癌關(guān)系的研究?jī)A向于該基因在肝癌組織中的表達(dá)增加，在正常肝組織中的表達(dá)降低。該基因參與腫瘤的發(fā)展，但它抑制或促進(jìn)腫瘤的發(fā)展仍存在爭(zhēng)議。

本研究結(jié)果顯示，NDRG1在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于正常肝組織，且NDRG1的表達(dá)水平在臨床病理分級(jí)、TNM臨床分期、肝癌患者生存時(shí)間等方面均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)的正常人類數(shù)據(jù)顯示，NDRG1在肝中低表達(dá)。HPA數(shù)據(jù)顯示NDRG1蛋白在肝癌組織中表達(dá)量高，在正常肝組織中表達(dá)量低。兩者都表明NDRG1可能在肝細(xì)胞癌的發(fā)展中發(fā)揮潛在的癌基因作用。目前NDRG1可能的致癌信號(hào)機(jī)制主要包括AKT、EGF、ErbB、Wnt/β-catenin、MAPK、jak-stat等途徑[24-27]。本研究通過(guò)GSEA富集分析發(fā)現(xiàn)其主要信號(hào)通路為E2F、MYC、G2M、pik-Akt、P53、TGF-β。本研究驗(yàn)證了NDRG1在肝癌中的高表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展的作用，與多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道相一致。提示NDRG1可作為肝癌診斷和預(yù)后的潛在預(yù)后標(biāo)志物。但本研究局限于利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)于其致癌信號(hào)通路研究只限于生物信息學(xué)研究，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室研究。

肝細(xì)胞癌是原發(fā)性肝癌的主要組織學(xué)類型，對(duì)于不能手術(shù)的中晚期患者，放化療及介入治療為可選的治療方法，但預(yù)后較差。腫瘤免疫治療是新的治療手段，張南征等[28]采用細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞(cytokine induced killer cells,CIK)聯(lián)合介入治療中晚期肝細(xì)胞肝癌，有效率優(yōu)于單純介入治療，延長(zhǎng)了患者的生存期。

腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的組成與預(yù)后有關(guān)。腫瘤新抗原在抗腫瘤免疫反應(yīng)和預(yù)測(cè)免疫治療的臨床反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[29]。M2巨噬細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞與腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散以及免疫抑制微環(huán)境的形成有關(guān)[30-31]。有研究表明，在結(jié)腸癌組織中，M0巨噬細(xì)胞，M1巨噬細(xì)胞和CD4記憶激活的T細(xì)胞浸潤(rùn)明顯更多。M0巨噬細(xì)胞在N1期腫瘤中最高，提示M0巨噬細(xì)胞可能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)發(fā)展[32]。另一項(xiàng)對(duì)于865例HCC患者的研究表明，生存率較差的高危組中巨噬細(xì)胞M0的比例高于低風(fēng)險(xiǎn)組，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)、程序性死亡受體-1(programmed cell death-1,PD-1)和T細(xì)胞免疫球蛋白黏連蛋白-3(T cell immunoglobulin mucin molecule 3,TIM-3)的表達(dá)也高于低風(fēng)險(xiǎn)組[33]。本研究發(fā)現(xiàn)NDRG1與M0巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)，在腫瘤組織中高表達(dá)，與M0巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用相一致，提示其可能通過(guò)M0巨噬細(xì)胞參與腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。目前對(duì)于M0巨噬細(xì)胞在肝癌微環(huán)境中的作用相關(guān)研究很少，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究推測(cè)M0巨噬細(xì)胞可能成為未來(lái)肝癌免疫治療的新靶點(diǎn)。是否可以通過(guò)調(diào)控NDRG1表達(dá)進(jìn)而影響M0巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的比例，從而達(dá)到抑制肝癌發(fā)展的作用，需要進(jìn)一步研究。