單細(xì)胞拉曼光譜在環(huán)境解磷微生物中的應(yīng)用研究

林紹敏，李弘哲，崔 麗

（1. 中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所 中科院城市環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021；2. 福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350000）

0 引言

磷是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，是植物組織和細(xì)胞組成的重要元素，參與作物生長(zhǎng)過(guò)程中的一系列生理生化過(guò)程。磷素的缺乏會(huì)導(dǎo)致植株生長(zhǎng)緩慢，根系發(fā)育不全，降低作物的產(chǎn)量和品質(zhì)等問(wèn)題［1］。磷肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所需的三大肥料之一，生產(chǎn)磷肥的主要原料來(lái)自磷礦石，磷礦石是一種不可再生資源［2］。根據(jù)2017 年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，全球磷肥消耗量約為5 000 萬(wàn)t/a，預(yù)計(jì)2030 年將增至7 000萬(wàn)t/a，磷素正在快速“消逝”。施用磷肥是土壤磷的主要來(lái)源。然而，所施用磷肥會(huì)被土壤固定，難以被植物直接吸收利用，造成磷肥利用率低［3］。長(zhǎng)期施用磷肥使土壤形成一個(gè)巨大的累積態(tài)“磷庫(kù)”，亟須一把合適的“鑰匙”開(kāi)啟這個(gè)“磷庫(kù)”，緩解磷資源短缺問(wèn)題，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。

解磷微生物可以通過(guò)分泌有機(jī)酸（包括葡萄糖酸、草酸、蘋果酸、檸檬酸等）降低土壤pH，促進(jìn)礦質(zhì)磷的溶解，同時(shí)能與Fe3+、Al3+、Ca2+等陽(yáng)離子螯合，通過(guò)與磷酸根離子競(jìng)爭(zhēng)土壤中相同的吸附位點(diǎn)，釋放磷酸根離子［4］。除此以外，解磷微生物還可以通過(guò)釋放磷酸酶活化土壤有機(jī)磷，使固定態(tài)磷向生物有效態(tài)磷轉(zhuǎn)變［5］。在實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，施用解磷菌劑可以降低磷肥施用量，促進(jìn)土壤磷循環(huán)。因此，解磷微生物對(duì)于土壤磷的生物地球化學(xué)循環(huán)起著重要作用，對(duì)維持土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義［6］。目前，對(duì)解磷微生物的獲取往往依賴于純培養(yǎng)技術(shù)。然而，超過(guò)99%的微生物不可分離純培養(yǎng)，大量解磷微生物資源未被挖掘和利用［4］。開(kāi)發(fā)一種不依賴純培養(yǎng)的解磷微生物及其活性檢測(cè)技術(shù)，對(duì)解析環(huán)境中解磷微生物的群落、功能、活性和代謝通路等具有重要意義。

1 單細(xì)胞拉曼光譜解析高活性解磷菌的原理和應(yīng)用

為了克服純培養(yǎng)的限制，筆者所在團(tuán)隊(duì)近期研發(fā)了單細(xì)胞拉曼光譜結(jié)合重水同位素標(biāo)記的新技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了土壤中高活性解磷微生物（包括未培養(yǎng)部分）的原位研究［7］。單細(xì)胞拉曼光譜可對(duì)單個(gè)微生物細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)須培養(yǎng)。它可以快速無(wú)損地獲取細(xì)胞內(nèi)不同生物分子的振動(dòng)光譜，包括核酸、蛋白質(zhì)、脂類、色素（如細(xì)胞色素c 和類胡蘿卜素）和聚合物等［8］。通過(guò)這些譜圖的變化鑒別微生物細(xì)胞的生理性狀和應(yīng)激響應(yīng)等信息。更重要的是，拉曼光譜還可與13C、15N或2D等穩(wěn)定同位素標(biāo)記（SIP）結(jié)合，提供真實(shí)的微生物功能和代謝活性等信息。它利用活性細(xì)胞同化同位素標(biāo)記底物后，新合成生物分子化學(xué)鍵中的輕原子被重同位素取代，造成化學(xué)鍵振動(dòng)頻率下降，拉曼峰發(fā)生偏移。該拉曼峰偏移，可作為微生物功能或活性的標(biāo)志峰［9］。例如，利用重水同位素標(biāo)記時(shí)，活性微生物同化氘并代替氫進(jìn)行合成代謝，使得構(gòu)成生命體的重要生物分子，如脂類、蛋白質(zhì)、DNA 等被氘化，所產(chǎn)生的新的C—D 鍵可被拉曼光譜靈敏檢測(cè)到，并且C—D 峰強(qiáng)度還可反映微生物的新陳代謝活性［10-11］。

對(duì)于解磷微生物，也可以利用拉曼光譜結(jié)合重水同位素標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行研究。基本原理是：磷素對(duì)微生物的活性起著關(guān)鍵作用。僅固定態(tài)磷存在條件下，解磷菌可以分解利用難溶性磷，同化重水中氘進(jìn)行新陳代謝，因此仍具有代謝活性，產(chǎn)生C—D鍵（特征鍵）拉曼峰，而非解磷菌無(wú)法進(jìn)行正常的新陳代謝，難以同化氘。因此，通過(guò)拉曼光譜中C—D 鍵拉曼峰的強(qiáng)弱，可快速區(qū)別解磷菌和非解磷菌，并根據(jù)解磷微生物的代謝活性（即C—D 鍵拉曼峰強(qiáng)度），反映其解磷能力。另外，由于重水標(biāo)記不會(huì)改變環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)底物庫(kù)，因此，可以在不影響微生物生存環(huán)境條件下，真實(shí)反映土壤微生物的解磷能力。單細(xì)胞水平檢測(cè)，也能克服純培養(yǎng)的限制，識(shí)別土壤中未培養(yǎng)的解磷微生物。

利用單細(xì)胞拉曼光譜分別檢測(cè)微生物在含有可溶性磷和不含磷培養(yǎng)液中的代謝活性，發(fā)現(xiàn)在含磷培養(yǎng)液中，微生物具有明顯的C—D 峰；而在不含磷培養(yǎng)液中的微生物沒(méi)有C—D 峰（見(jiàn)圖1），說(shuō)明磷對(duì)微生物活性具有決定性作用。進(jìn)一步利用難溶磷酸鈣（無(wú)機(jī)磷）和卵磷脂（有機(jī)磷）作為唯一的無(wú)機(jī)或有機(jī)磷源，將4 種不同的解磷菌進(jìn)行孵育。研究結(jié)果表明，4種解磷菌的C—D峰強(qiáng)度具有顯著差異，且C—D 峰強(qiáng)度與傳統(tǒng)方法檢測(cè)的可溶性磷濃度或酸性磷酸酶活性基本一致（見(jiàn)圖2 和圖3），說(shuō)明了單細(xì)胞拉曼光譜和重水標(biāo)記方法研究不同細(xì)菌解磷能力的準(zhǔn)確性。

圖1 4種菌劑在含磷和不含磷的50%重水培養(yǎng)液中孵育24 h后的拉曼光譜

圖2 以卵磷脂作為唯一有機(jī)固定態(tài)磷源培養(yǎng)后磷酸酶活性與C—D峰強(qiáng)度

圖3 以磷酸鈣為唯一無(wú)機(jī)固定態(tài)磷源培養(yǎng)后可溶性磷濃度與C—D峰強(qiáng)度比值

在此基礎(chǔ)上，將該方法從純菌拓展至復(fù)雜的土壤環(huán)境。在已去除可溶性磷的土壤中添加重水進(jìn)行原位孵育，并利用拉曼光譜在單細(xì)胞水平檢測(cè)土壤提取微生物的C—D 峰（見(jiàn)圖4）。研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物拉曼光譜中存在不同強(qiáng)度的C—D 峰，說(shuō)明復(fù)雜多樣的土壤中的微生物具有不同的解磷活性。進(jìn)一步結(jié)合拉曼成像，實(shí)現(xiàn)在不依賴純培養(yǎng)的條件下，識(shí)別土壤中的高效解磷微生物（見(jiàn)圖5）。I和II分別是利用C—H和C—D拉曼峰進(jìn)行成像，C—H區(qū)分生物和非生物質(zhì)，C—D 區(qū)分解磷菌?？梢?jiàn)，含C—H 的微生物明顯多于含C—D 的微生物，說(shuō)明土壤中僅部分菌具有解磷活性。

圖4 在無(wú)可溶性磷土壤中加入重水孵育24 h后土壤微生物的單細(xì)胞拉曼光譜

圖5 土壤中提取微生物和少許土壤殘留拉曼成像

單細(xì)胞拉曼光譜解析土壤高活性解磷菌的關(guān)鍵步驟：首先，受試土壤須去除其中的有效磷，如利用水和NaHCO3進(jìn)行孵育和離心清洗；其次，在洗去有效磷的土壤中加入一定量的D2O，該同位素標(biāo)記物是檢測(cè)微生物解磷能力的必要試劑；再次，利用密度梯度離心法將土壤微生物從土壤中提取分離出來(lái)，避免檢測(cè)時(shí)土壤顆粒對(duì)微生物的干擾；最后，利用共焦顯微拉曼光譜儀對(duì)提取的土壤微生物進(jìn)行單細(xì)胞水平檢測(cè)，并利用拉曼光譜中C—D 峰強(qiáng)度評(píng)價(jià)解磷能力或活性。

2 傳統(tǒng)解磷微生物研究方法與單細(xì)胞拉曼光譜方法對(duì)比

不同解磷微生物的研究方法均存在優(yōu)缺點(diǎn)，具體見(jiàn)表1。傳統(tǒng)解磷微生物的研究方法，主要是從復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境中分離、純化、培養(yǎng)出解磷微生物，通過(guò)研究溶磷量和生長(zhǎng)速率表征微生物的解磷能力［12］。另外，由于解磷菌在無(wú)機(jī)磷溶解過(guò)程中會(huì)釋放無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸，酸化細(xì)菌培養(yǎng)基。因此，測(cè)定培養(yǎng)基的pH 也可反映微生物的解磷能力［13］。然而，這種依賴分離、純化、培養(yǎng)解磷微生物進(jìn)行微生物特征分析的方法受多種因素干擾，部分微生物因?yàn)槿狈线m的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度不適宜、自身生長(zhǎng)弊端和缺乏共生體等原因無(wú)法在培養(yǎng)基中進(jìn)行純培養(yǎng)。即使是從復(fù)雜環(huán)境中提取培養(yǎng)的解磷微生物，也不能全面真實(shí)地反映它們?cè)诃h(huán)境中的活動(dòng)［14］。此外，解磷菌能夠釋放非特異性酸性磷酸酶和植酸酶，促進(jìn)有機(jī)磷活化，且研究發(fā)現(xiàn)各形態(tài)磷含量與酶活性顯著正相關(guān)，尤其是酸性磷酸酶。因此，微生物酶活性也是表征解磷微生物解磷能力的手段之一［15］。但是，由于植物也分泌磷酸酶，干擾微生物解磷活性的測(cè)定，且其僅反映有機(jī)解磷菌的活性，無(wú)法判斷無(wú)機(jī)解磷菌的活性，造成方法具有局限性。除此以外，總碳、總氮等土壤特征與酸性磷酸酶的活性密切相關(guān)，也可間接反應(yīng)微生物的解磷能力［16］。

表1 解磷微生物研究方法對(duì)比

不依賴培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性研究［17］。土壤宏基因組測(cè)序可揭示微生物解磷相關(guān)的功能基因，功能基因定量PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）技術(shù)可定量微生物解磷相關(guān)功能基因豐度［18］。然而，上述技術(shù)僅從基因型角度表征解磷微生物的解磷潛力，不能反映微生物真實(shí)具有的解磷能力。除此以外，這些方法還具有科研材料費(fèi)用昂貴、測(cè)序和檢測(cè)過(guò)程過(guò)于煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題。

相比于解磷菌培養(yǎng)和分子生物學(xué)技術(shù)，單細(xì)胞拉曼光譜-重水同位素標(biāo)記聯(lián)用技術(shù)克服了解磷微生物純培養(yǎng)的限制，可直接從土壤環(huán)境中尋找解磷菌，并且是具有真實(shí)解磷（包括對(duì)無(wú)機(jī)磷與有機(jī)磷的溶解）能力的微生物。

3 展望

目前單細(xì)胞拉曼光譜結(jié)合重水技術(shù)已被應(yīng)用于復(fù)雜土壤環(huán)境中檢測(cè)高效解磷菌的研究。在未來(lái)工作中，該技術(shù)還能夠用于評(píng)價(jià)不同土壤微生物的解磷能力，并逐步發(fā)展成衡量土壤健康這一重要指標(biāo)的依據(jù)。同時(shí)，單細(xì)胞拉曼光譜結(jié)合分子生物學(xué)手段，還可促進(jìn)對(duì)“以碳促磷”等重要微生物學(xué)機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)；結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和蛋白組等多組學(xué)手段，可深入探究解磷微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中響應(yīng)多級(jí)磷素轉(zhuǎn)化的分子調(diào)控機(jī)制；結(jié)合色譜分析，有望更直觀探究有機(jī)磷農(nóng)藥在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的遷移和轉(zhuǎn)化。另外，由于拉曼光譜近乎無(wú)損檢測(cè)，結(jié)合單細(xì)胞分選，還可對(duì)拉曼光譜檢測(cè)的高效解磷菌進(jìn)行分選、測(cè)序，甚至培養(yǎng)，促進(jìn)新型解磷菌種和新型功能基因的挖掘，以及解磷微生物資源的實(shí)際農(nóng)業(yè)利用。

然而，單細(xì)胞拉曼光譜目前還無(wú)法實(shí)現(xiàn)大樣本的高通量檢測(cè)以及便攜式的實(shí)時(shí)快速檢測(cè)。今后還需發(fā)展針對(duì)土壤微生物的快速和高通量樣品處理方法。另外，由于微生物之間交互飼喂（cross-feeding）對(duì)重水標(biāo)記復(fù)雜微生物群落中的解磷微生物的干擾，還需發(fā)展合適的重水孵育方式和裝置，降低該干擾。此外，還需發(fā)展可對(duì)微生物進(jìn)行快速在線檢測(cè)的便攜式拉曼光譜儀，以促進(jìn)拉曼光譜方法的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。