苗藥阿銳布對四氯化碳致小鼠急性腎損傷的保護(hù)作用

覃建鋒 王恒 梁子聰

【摘要】目的：初步探討苗藥阿銳布對四氯化碳致腎損傷的保護(hù)作用。方法：50只小鼠被隨機(jī)分為空白組、模型組及阿銳布低、中、高劑量組，2周后處死小鼠，腎石蠟切片，HE染色，檢測腎組織勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）含量，計(jì)算腎臟指數(shù)，光鏡下觀察腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果：一定劑量的阿銳布水提物能提高腎組織勻漿中SOD水平（P<0.01或P<0.05），降低腎組織勻漿中MDA水平（P<0.01）。結(jié)論：苗藥阿銳布對四氯化碳所致小鼠腎損傷有較好的防治作用，作用機(jī)制可能與其所含活性物質(zhì)的抗氧化作用有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】苗藥阿銳布;腎損傷;抗氧化

【中圖分類號(hào)】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）8-0017-03

Abstract：ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectoftheVeronicastrumaxillareoncarbontetrachloride-inducedrenalinjuryinmice.Method50micewererandomlydividedintonormalgroup，modelgroupandthelow、middleandhighdosegroup，miceweresacrificedatthe2thweek，Afterthekidneyparaffinweresected，andstainedwithHE，detectionSODactivitiesandMDAlevelinrenaltissuehomogenate，calculationkidneyindex，themorphologicalchangesinrenaltissuewereobservedundermicroscope.ResultAcertaindoseoftheVeronicastrumaxillarewaterextractcanincreaseSODlevelinrenaltissuehomogenate（P<0.01orP<0.05）anddecreaseMDAlevelinrenaltissuehomogenate（P<0.01）.ConclusionMiaomedicinetheVeronicastrumaxillarehavebetterprotectioneffectoncarbontetrachloride-inducedmicerenalinjury.Themechanismmayberelatedtotheantioxidanteffectoftheactivesubstance.

Keywords：MiaoMedicinetheVeronicastrumaxillare;KidneyInjury;Antioxidant

四氯化碳在生產(chǎn)和使用環(huán)節(jié)中易引起環(huán)境污染，中毒時(shí)有發(fā)生，腎中毒時(shí)主要表現(xiàn)為急性壞死性腎病。貴州苗藥阿銳布為玄參科腹水草屬寬葉腹水草Veronicastrumlatifolium（Hemsl.）Yamazaki的全草，具有清熱解毒、行水散瘀、活血化瘀的功效[1]，治療急慢性腎炎療效顯著[2]，在苗族民間主要用于治療肝炎、水腫、肝硬化腹水、急性腎炎、跌打損傷等[3]，但未見其對腎損傷的保護(hù)作用研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用皮下注射四氯化碳構(gòu)建小鼠腎損傷模型，初步探討苗族藥阿銳布對小鼠腎臟的保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料50只昆明種小鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（渝）2017-0002，雌雄各半，體重（20.2±2.1）g。樣本藥材購置貴州省益康中藥堂，經(jīng)本校中藥教研室李香副教授鑒定為玄參科腹水草屬Veronicastrum.latifolium（Hemsl.）yamazaki。稱取500g阿銳布的干燥全草粉碎，加蒸餾水2500mL煎煮3h，濾過;再加蒸餾水2000mL煎煮2h，濾過，合并兩次濾液，濃縮至一定程度后，加蒸餾水定容至1000mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.2g·mL-1（按原藥材量計(jì)）的阿銳布水提液，冷藏備用。CCl4購自北京化工廠，批號(hào)20131029;ALT、AST、MDA、SOD等試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20180520、20180522、20180517、20180518;聯(lián)苯雙酯購自廣州白云山星群藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)H44023176。

1.2分組與給藥將50只小鼠按每組10只隨機(jī)平均分為正常組、模型組、及阿銳布低、中、高劑量組。各組每天灌胃給藥1次，連續(xù)14d。阿銳布低、中、高劑量組分別灌胃100mg·kg-1、200mg·kg-1、400mg·kg-1，正常組和模型組以0.9%生理鹽水灌胃。除正常組外，余各組小鼠末次給藥后2h，以0.02mL·g-1腹腔注射0.4%CCl4花生油溶液，16h后稱體重，摘眼球取血;后處死小鼠，取出腎臟，肉眼觀察顏色及形態(tài)變化。

1.3儀器SM-3型酶標(biāo)儀（北京天石科技有限責(zé)任公司），7070型全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）;FA2004型電子天平（上海津平科學(xué)儀器有限公司）;7230G型可見分光光度計(jì)（上海精密儀器儀表有限公司）;LDZ-52型離心機(jī)（北京離心機(jī)廠）;生物組織切片機(jī)（LEICARM2235，LEICA公司，德國）;光學(xué)顯微鏡（OLYMPUSBX50，OLYM-PUS公司，日本）。

1.4觀察指標(biāo)及測定

1.4.1腎系數(shù)的測定處死小鼠后，取兩側(cè)全腎，濾紙吸干腎表面血液后稱重。計(jì)算腎系數(shù)。

腎系數(shù)=兩側(cè)腎質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（kg）×100%。

1.4.2脂質(zhì)過氧化指標(biāo)的測定取部分腎皮質(zhì)，每樣本加1mL預(yù)冷的生理鹽水，冰水浴中勻漿，于4℃，3000/min離心15min，取上清檢測。按照試劑盒提供的方法測定MDA含量及SOD活性。

1.5病理切片分析取一小塊（10mm×5mm）腎臟組織，經(jīng)固定，脫水，石蠟包埋，切片，HE法染色，鏡下觀察各組腎臟組織病理變化。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般情況正常組大鼠皮毛光滑密澤，大便正常，進(jìn)食無異常;模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、食量減少、血尿等;而阿銳布各組組小鼠的精神狀況明顯好轉(zhuǎn)，血尿情況很大程度得以減輕。

2.2各組小鼠腎系數(shù)測定結(jié)果與模型組比較，空白組及高劑量組腎臟指數(shù)明顯升高（P﹤0.05或P﹤0.01）。見表1。

2.3各組小鼠脂質(zhì)過氧化指標(biāo)的測定與模型組比較，阿銳布中、高劑量組MDA含量明顯降低（P﹤0.01）;阿銳布中、劑量高組SOD含量升高明顯（P<0.05或<0.01），表明中、高劑量的阿銳布具有較強(qiáng)的抗氧化作用。見表2。

2.4腎組織形態(tài)學(xué)觀察正常組腎小球及腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)無異常（A）;模型組（B）腎組織間質(zhì)血管擴(kuò)張，充血，水腫，部分近端小管管壁上皮細(xì)胞濁腫明顯伴空泡變性，管腔狹小，部分近端小管管壁上皮細(xì)胞萎縮，管腔擴(kuò)張，腔內(nèi)見紅細(xì)胞管型尿，腎小球出血、少數(shù)壞死;阿銳布低劑量組（C）與模型組比較，病變稍有減輕，但無明顯變化;阿銳布中劑量組（D）腎小球結(jié)構(gòu)清晰，大小、數(shù)量正常，間質(zhì)輕度水腫及少量小管管壁上皮細(xì)胞空泡變性;阿銳布高劑量組（E）腎小球及腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)接近正常。如圖1所示。

3討論

已有研究表明，CCl4在體內(nèi)代謝后能夠形成自由基，引起脂質(zhì)過氧化并導(dǎo)致組織器官結(jié)構(gòu)和功能的破壞[4]。貴州苗藥阿銳布為玄參科腹水草屬寬葉腹水草的全草，具有清熱解毒，行水散瘀，活血化瘀的功效[1]，治療急慢性腎炎療效顯著[2];但未見其對腎損傷的保護(hù)作用研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)參照KOICHIROSUZUKI等的實(shí)驗(yàn)方法建立CCl4誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷模[5]，初步探討苗族藥阿銳布對實(shí)驗(yàn)小鼠腎臟的保護(hù)作用。

腎的近端小管上皮細(xì)胞含有高濃度的微粒體酶，具有氧化外來化合物的作用[6]，而且機(jī)體大部分有機(jī)物質(zhì)的清除在近端小管完成，因此該部位細(xì)胞易受外界因素的影響;CCl4作用于肝臟中產(chǎn)生的自由基，通過血液進(jìn)入腎臟，并攻擊腎小管、腎小球細(xì)胞膜上的磷脂分子，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)生急性腎損傷[7]，并產(chǎn)生大量的MDA，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，致細(xì)胞腫脹、壞死[8];實(shí)驗(yàn)中，模型組腎組織間質(zhì)血管擴(kuò)張，充血，水腫，部分近端小管管壁上皮細(xì)胞濁腫明顯伴空泡變性，管腔狹小，部分近端小管管壁上皮細(xì)胞萎縮，管腔擴(kuò)張，腔內(nèi)見紅細(xì)胞管型尿，腎小球出血、少數(shù)壞死，以上觀察到的病理改變與CCl4致腎臟結(jié)構(gòu)破壞表現(xiàn)相一致，且模型組較空白組腎臟指數(shù)明顯降低（P<0.01），提示注射四氯化碳構(gòu)建小鼠腎損傷模型造模成功;SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，能起到清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的作用，還能夠反應(yīng)機(jī)體的抗氧化能力[9];周伯旭等[10]從腹水草中分離出3-4二甲異阿魏酸。阿魏酸具有清除氧自由基、過氧化亞基、亞硝酸鹽、增加免疫功能、抗血小板凝集、抗菌消炎、抗腫瘤、抗突變等廣泛的藥理作用[11]。本研究中，模型組與正常組比較，MDA含量明顯升高（P﹤0.01），SOD含量明顯降低（P﹤0.01），提示模型組細(xì)胞內(nèi)活性氧成分積累過度，細(xì)胞嚴(yán)重受損。給予不同劑量阿銳布后，MDA表達(dá)水平下降，SOD含量明顯升高（P﹤0.01），同時(shí)鏡下腎組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)逐步好轉(zhuǎn)，提示不同劑量阿銳布可能通過清除實(shí)驗(yàn)小鼠氧自由基和過氧化亞基，通過抗氧化作用保護(hù)腎損傷。尤其阿銳布高劑量組腎臟指數(shù)（P<0.05）明顯升高及高劑量組光鏡下形態(tài)學(xué)改變較模型組明顯得到改善，表明高劑量的阿銳布對四氯化碳致小鼠腎損傷有較好的保護(hù)作用。

綜上所述，苗藥阿銳布對腎損傷具有治療性作用，可能與其所含阿魏酸的異構(gòu)體3-4二甲異阿魏酸能清除氧自由基和過氧化亞基而產(chǎn)生的抗氧化作用機(jī)制有關(guān)。但關(guān)于阿銳布減輕腎損傷的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2019-02-11編輯：劉斌）