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    仙茅多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響

    2019-07-08 02:58楊翠萍蔡琨宣錦
    關(guān)鍵詞:仙茅原代腹腔

    楊翠萍 蔡琨 宣錦

    【摘要】目的:探討仙茅多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響。方法:采用不同濃度的仙茅多糖(500,250,125,62.5,31.25μg/mL)分別處理小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞,36h后加入熒光標(biāo)記的大腸桿菌,室溫避光孵育1.5h,熒光顯微鏡下觀察不同劑量的仙茅多糖對(duì)兩類細(xì)胞吞噬大腸桿菌活性的影響。結(jié)論:仙茅多糖呈劑量依賴性增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

    【關(guān)鍵詞】仙茅多糖;巨噬細(xì)胞;RAW264.7細(xì)胞;吞噬活性

    【中圖分類號(hào)】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1007-8517(2019)8-0020-04

    Abstract:ObjectiveTodiscusstheeffectsofcurculigoorchioidespolysaccharide(COP)onphagocyticactivityofmousemacrophages.MethodsTheprimaryperitonealmacrophagesofmiceandRAW264.7cellsofmousemacrophagecelllineweretreatedwithdifferentconcentrationsofFestucaarundinaceapolysaccharides(500,250,125,62.5,31.25μg/mL)respectively.After36hours,fluorescentlabeledEscherichiacoliwasaddedandincubatedatroomtemperaturewithoutlightfor1.5hours.Theeffectsofdifferentdosesofcitronellapolysaccharideonthephagocyticactivityoftwokindsofcellswereobservedunderfluorescencemicroscope.ConclusionCurculigoorchioidespolysaccharideenhancedthephagocyticfunctionofmousemacrophagesinadose-dependentmanner.

    Keywords:CurculigoOrchioidesPolysaccharide;Macrophage;RAW264.7Cell;PhagocyticActivity

    多糖是一類存在于動(dòng)植物和微生物中的天然高分子化合物,具有重要的生物功能和寶貴的藥用價(jià)值[1]。研究認(rèn)為植物多糖普遍具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的活性,尤其對(duì)機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)效應(yīng)比較顯著[2-4]。仙茅(CurculigoorchioidesGaertn)是石蒜科多年生草本植物,其藥用部位為根莖,其性溫,入腎,肝經(jīng),主要功效有補(bǔ)腎助陽(yáng)、益精血、強(qiáng)筋骨和行血消腫,主要用于腎陽(yáng)不足、虛勞內(nèi)傷和筋骨疼痛等病癥[5],仙茅多糖(Curculigoorchioidespolysaccharide,COP)是仙茅的水提醇沉部分,課題組前期研究發(fā)現(xiàn)仙茅多糖能調(diào)節(jié)小鼠免疫功能,也能通過(guò)增加小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7分泌活性因子TNF-α和NO,促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化[6-7]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的非特異性免疫細(xì)胞,具有吞噬、清除病原體的,同時(shí)巨噬細(xì)胞也是許多多糖的主要作用靶細(xì)胞[8-9]。因此本實(shí)驗(yàn)擬將仙茅多糖分別作用于小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7和小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,探討仙茅多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響。

    1材料與儀器

    1.1動(dòng)物SPF級(jí)昆明種小鼠,雌性(雌性小鼠與雄性小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的非特異性免疫功能沒(méi)有差異),2月齡,體質(zhì)量為18~22g,購(gòu)自長(zhǎng)沙天勤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,合格證號(hào):SCXK(湘)2014-001,飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立送風(fēng)飼養(yǎng)籠具中。

    1.2細(xì)胞株小鼠單核巨噬細(xì)胞株RAW264.7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫(kù)(編號(hào):KCB200603YJ)。

    1.3試劑仙茅藥材購(gòu)買于貴陽(yáng)市萬(wàn)東橋藥材市場(chǎng),經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定為仙茅CurculigoorchioidesGaertn的根;熒光標(biāo)記大腸桿菌(V6694)購(gòu)買于美國(guó)BD公司;DAPI溶液(C0065)、抗熒光衰減封片劑(S2100)購(gòu)買自北京索萊寶科技有限公司。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(070912)購(gòu)買于上海中科昆蟲(chóng)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

    1.4儀器CO2培養(yǎng)箱(NewBrunswickGalaxy170s),熒光倒置顯微鏡(OLYMPUSU-RFL-T),生物安全柜(HaierHR60-HA2)。

    2方法

    2.1仙茅多糖的制備及濃度配置參照文獻(xiàn)[10]制備仙茅多糖,仙茅根塊曬干粉碎后用75%~80%的乙醇脫脂處理后風(fēng)干打粉。稱取5g干粉溶解于175mL蒸餾水中,于95℃水浴加熱提取150min。抽濾并收集濾液,殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄖ貜?fù)提取2次。濾液合并,減壓濃縮至一定體積后,加入終體積分?jǐn)?shù)不低于80%食用酒精沉淀。抽濾后沉淀物分別用90%酒精和丙酮洗滌,真空干燥后采用苯酚法測(cè)定其中多糖的含量為50%。仙茅多糖用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中配制成濃度為500μg/mL的母液,濾菌后4℃保存,實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMEM培養(yǎng)基稀釋即得。

    2.2RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基(含青霉素1×105U/L、鏈霉素1×105U/L,pH7.2~7.4)置于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。細(xì)胞傳至第3代,通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察,3~6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    2.3小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞提取參照文獻(xiàn)[11-12]提取小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)前3天給小鼠腹腔注射5%淀粉營(yíng)養(yǎng)肉湯,每只小鼠注射1mL、每天注射1次。干預(yù)結(jié)束后,小鼠脫頸處死并用75%酒精消毒,在無(wú)菌條件下,充分暴露小鼠腹部肌層,腹腔注入10mL含雙抗的DMEM培養(yǎng)基,輕揉腹部5min,然后吸取小鼠腹腔細(xì)胞懸液,移入離心管中,離心3000r/min,5min,用預(yù)冷PBS洗2次;得到細(xì)胞接種于24孔板,每孔接種細(xì)胞106個(gè),共18孔,培養(yǎng)4h細(xì)胞貼壁,用預(yù)冷PBS洗2次,即得小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞。

    2.4細(xì)胞培養(yǎng)及處理將RAW264.7細(xì)胞和小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞接種于24孔板中,待細(xì)胞貼壁后,吸棄上清,分別加入含不同濃度仙茅多糖的DMEM培養(yǎng)基,使仙茅多糖濃度為500,250,125,62.5,31.25,0μg/mL,每組設(shè)3個(gè)平行孔,分別刺激36h。

    2.5巨噬細(xì)胞吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌培養(yǎng)結(jié)束后,吸棄上清,預(yù)冷PBS洗2次,加入以雙蒸水200倍稀釋的熒光標(biāo)記大腸桿菌溶液(1mL/孔),室溫避光孵育1.5h。干預(yù)結(jié)束后,吸棄上清,臺(tái)盼藍(lán)染色5min,PBS洗5次,每次3min,加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞。最后以DAPI染核5Smin,取出爬片蓋于載玻片上,滴加抗熒光衰減封片劑并封片,于熒光倒置顯微鏡下觀察。

    2.6巨噬細(xì)胞吞噬百分率玻片于熒光倒置顯微鏡下觀察200個(gè)細(xì)胞,記錄吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌的巨噬細(xì)胞數(shù)量;吞噬百分率(PP%)=200個(gè)巨噬細(xì)胞內(nèi)吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌的巨噬細(xì)胞數(shù)量/200個(gè)細(xì)胞巨噬細(xì)胞總數(shù)×100%。

    2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3結(jié)果

    3.1仙茅多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬作用的影響如圖1所示,各組RAW264.7細(xì)胞吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌后,細(xì)胞形態(tài)輪廓清晰,形狀呈圓形或橢圓形。正常對(duì)照組明顯可見(jiàn)RAW264.7細(xì)胞有吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌;與正常對(duì)照組比較,仙茅多糖組細(xì)胞吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌明顯較多。表1所示,仙茅多糖組細(xì)胞吞噬百分率都比正常對(duì)照組細(xì)胞吞噬百分率顯著性增高(P<0.01),仙茅多糖在濃度為31.25~500μg/mL范圍內(nèi)能增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力,且呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。提示仙茅多糖能增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的吞噬功能。

    3.2仙茅多糖對(duì)小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響如圖2所示,小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌后,細(xì)胞形態(tài)輪廓清晰,形狀呈圓形或橢圓形。正常對(duì)照組明顯可見(jiàn)小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞有吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌;與正常對(duì)照組比較,仙茅多糖組細(xì)胞吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌明顯較多。表2所示,仙茅多糖125~500μg/mL組細(xì)胞吞噬百分率都比正常對(duì)照組吞噬百分率顯著性增高(P<0.05或P<0.01),仙茅多糖在濃度為125~500μg/mL范圍內(nèi)可以增強(qiáng)小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌的能力,且呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。提示仙茅多糖能增強(qiáng)小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

    4討論

    巨噬細(xì)胞在正常機(jī)體的免疫防御過(guò)程中扮演著重要的角色,參與機(jī)體抗感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程,是機(jī)體非特異性免疫防御的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于小鼠和人具有同源性,許多學(xué)者以小鼠來(lái)源的巨噬細(xì)胞作為細(xì)胞模型研究人類巨噬細(xì)胞生理、病理免疫反應(yīng)。研究表明不同來(lái)源的巨噬細(xì)胞在復(fù)雜微環(huán)境中,其細(xì)胞形態(tài)、功能、表型會(huì)產(chǎn)生一系列復(fù)雜的變化[10]。所以,體外研究不同來(lái)源的小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)了解人體巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)(如吞噬、細(xì)胞因子分泌)具有重要意義。小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞是通過(guò)無(wú)菌性炎癥刺激獲取的,此細(xì)胞很好地保留了外周巨噬細(xì)胞的許多生理學(xué)特性,是比較接近生理狀態(tài)的巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞源自Abelson鼠科的腹腔巨噬細(xì)胞,是一種白血病病毒誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞,其生理狀態(tài)、某些基因或細(xì)胞因子表達(dá)(其sIg-,Ia-、Thy1.2-表面抗原陰性)發(fā)生了改變,采用此細(xì)胞不可避免的會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此,本實(shí)驗(yàn)采用不同來(lái)源的小鼠巨噬細(xì)胞,以求更準(zhǔn)確的探討仙茅多糖對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響。結(jié)果表明,仙茅多糖能增強(qiáng)這兩種不同來(lái)源的小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能,并且呈劑量依賴性增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

    參考文獻(xiàn)

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    (收稿日期:2019-03-01編輯:劉斌)

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