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    細(xì)粒棘球蚴感染羊肝臟包囊纖維化形成的病理形態(tài)學(xué)觀察

    2021-03-02 10:21:08翟少華胡美荷李淑嫻劉來(lái)珍阿爾祖古麗阿卜力孜劉海燕
    關(guān)鍵詞:包囊細(xì)粒肝細(xì)胞

    翟少華,胡美荷,李淑嫻,劉來(lái)珍,阿爾祖古麗·阿卜力孜,王 楠,梁 天,劉海燕

    (新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,烏魯木齊830052)

    細(xì)粒棘球蚴?。òx病)是由細(xì)粒棘球蚴寄生于人或動(dòng)物體內(nèi)而感染的一種人獸共患寄生蟲病,俗稱“蟲癌”[1]。我國(guó)是世界上包蟲病最嚴(yán)重的國(guó)家之一,新疆是高發(fā)區(qū),在新疆家畜包蟲病感染情況調(diào)查中,肝臟棘球蚴平均感染率為50.24%;包蟲病感染率超過60%的有巴州、阿勒泰、伊犁和喀什4個(gè)地區(qū),其中伊犁的感染率最高,達(dá)78.15%[2]。在我國(guó)分布的主要是細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲[3]。前者的幼蟲會(huì)引起細(xì)粒棘球蚴病,又稱囊型包蟲病,病例數(shù)占所有病例的90%以上;后者的幼蟲會(huì)引起多房棘球蚴病,又稱泡型包蟲病[4]。

    囊型棘球蚴病對(duì)人體器官的損害中以對(duì)肝臟的損害居首位[5]。中間宿主食用被細(xì)粒棘球蚴蟲卵污染的食物或水后,在宿主消化液作用下發(fā)育成六鉤蚴經(jīng)腸壁進(jìn)入血液,主要在肝和肺中發(fā)育成包囊,若包囊破裂釋放出原頭節(jié)可再次感染[6]。細(xì)粒棘球蚴在感染宿主過程中,對(duì)宿主致病的機(jī)制十分復(fù)雜,包括對(duì)宿主組織器官造成壓迫性損傷、炎癥反應(yīng)、過敏反應(yīng)以及免疫逃避等多方面問題[7]。肝包蟲包囊纖維化早已被人熟知,但其炎癥細(xì)胞的變化和形成機(jī)制尚不明確。因此,本研究旨在運(yùn)用病理組織學(xué)、細(xì)胞化學(xué)和超微形態(tài)學(xué)的相關(guān)知識(shí),將病理組織切片觀察與細(xì)胞化學(xué)染色切片觀察結(jié)合起來(lái),共同探討細(xì)粒棘球蚴對(duì)羊肝臟的損傷性變化和肝臟包囊的形成過程,為闡釋細(xì)粒棘球蚴對(duì)機(jī)體的感染過程、肝臟纖維化以及肝細(xì)胞損傷的分子病理機(jī)制的形成提供研究基礎(chǔ),對(duì)該病的診斷、治療具有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 病料的采集 2019年8月至10月期間,收集于烏魯木齊市新市區(qū)華凌屠宰場(chǎng)所宰殺的阿勒泰羊中出現(xiàn)明顯包囊的完整羊肝臟,共10份。

    1.2 試劑 10%福爾馬林固定液、Bouin固定液、無(wú)水乙醇、二甲苯、蘇木素染液、1%伊紅染液均購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;蘇木紫、猩紅、復(fù)紅、磷鉬酸、磷鎢酸、淺綠染料購(gòu)自北京化工廠;冰醋酸溶液購(gòu)自天津市北方化玻購(gòu)銷中心。

    1.3 感染羊肝臟病變組織的采集與觀察 選取屠宰過程中出現(xiàn)包囊的羊肝臟,沿包囊周圍與正常組織交界處剪取1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm的病變組織,置于10%中性福爾馬林固定液中固定12 h,其包囊直徑范圍在2~6 cm。共10個(gè)樣品。

    1.4 感染羊肝臟組織病理組織切片制備 取已固定的肝臟包囊病變組織,用流水沖洗2 h。將樣品放入自動(dòng)脫水機(jī)中按照70%乙醇(2 h)、80%乙醇(1.5 h)、90%乙醇(45 min)、95%乙醇Ⅰ(30 min)、95%乙醇Ⅱ(30 min)、100%乙醇Ⅰ(30 min)、100%乙醇Ⅱ(30 min)系列梯度逐級(jí)脫水;用二甲苯Ⅰ(二甲苯/無(wú)水乙醇1:1)、純二甲苯Ⅱ、純二甲苯Ⅲ,各透明8 min。最后用固體石蠟包埋組織、切片5 μm厚度。通過脫蠟、復(fù)水、蘇木素-伊紅染液染色各1 min,通過75%乙醇、80%乙醇、85%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇,逐級(jí)脫水各2 min。甲苯Ⅰ(二甲苯與無(wú)水乙醇1∶1)、二甲苯Ⅱ,各透明1 min,滴加中性樹脂膠封片,顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。

    1.5 感染羊肝臟細(xì)胞化學(xué)染色樣品制備 石蠟切片脫蠟后置于蒸餾水中,再置入Bouin氏固定液于56℃溫箱中固定1 h,冷卻10 min;清水沖洗約10 min至切片變透明,再置入蒸餾水中清洗;Weigert氏蘇木紫溶液染10 min,清水沖洗10 min,置入蒸餾水中清洗;猩紅-酸性復(fù)紅溶液染10 min,切片置入蒸餾水中清洗;以鉬酸-磷鎢酸溶液染10~15 min做分色。檢查膠質(zhì)纖維沒有被染成紅色;使用淺綠溶液做對(duì)比染色1 min;以5%磷鎢酸溶液分色15 min;以95%乙醇、絕對(duì)酒精及二甲苯脫水及透明封片。染色結(jié)果判定:肌肉、細(xì)胞質(zhì)及角質(zhì)呈紅色;細(xì)胞核呈黑色;膠質(zhì)纖維呈綠色。

    1.6 感染羊肝臟組織掃描電子顯微鏡樣品制備 從自然感染的綿羊肝臟細(xì)粒棘球蚴抽取包囊囊液和剪取包囊囊壁,分別將抽取的包囊液經(jīng)自然沉淀?xiàng)壢ド锨逡菏占^蚴,滴加至粘貼有碳導(dǎo)電膠的掃描電鏡樣品臺(tái)上;同時(shí)將剪取的1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm包囊囊壁粘貼于掃描電鏡樣品臺(tái)碳導(dǎo)電膠上,置于場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察蟲體特征和包囊囊壁結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。共7個(gè)樣品。

    2 結(jié)果

    2.1 感染羊肝臟病變組織的采集與觀察 感染羊肝臟表面可見大小不等的包囊凸出,包囊壁呈半透明狀,包囊液清亮,有的包囊體積較大向肝組織內(nèi)侵入生長(zhǎng),充滿囊液的棘球蚴均具有一定張力,富有彈性不易塌陷。在肝臟表面的包囊中可以透過角質(zhì)層清晰的看見顆粒狀的生發(fā)囊[8],切開后有大量包囊液流出,包囊空虛,包囊壁呈灰白色,質(zhì)地堅(jiān)韌。在凸起的包囊周圍可見散在的大范圍的壞死灶布滿整個(gè)肝臟,部分病灶相互融合形成較大范圍的不規(guī)則的融合性病灶。抽取包囊液滴在載玻片上于顯微鏡下觀察,可見大量原頭蚴,原頭蚴出現(xiàn)明顯伸縮蠕動(dòng),活力較好,多數(shù)頭節(jié)縮入蟲體內(nèi),少數(shù)頭節(jié)伸出。原頭蚴多呈橢圓形,表面層光滑、透明。部分原頭蚴頂突和4個(gè)吸盤完全翻出,高倍鏡下頂突小鉤結(jié)構(gòu)清晰可見,體節(jié)內(nèi)鈣顆粒明顯(圖1)[9]。

    圖1 感染羊肝臟包囊與包囊中原頭蚴形態(tài)Fig.1 Morphology of protocephala in liver cysts and cysts in sheep infected

    2.2 細(xì)粒棘球蚴的超微形態(tài)學(xué)觀察 在場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡下,可見分離的原頭蚴呈長(zhǎng)梭形,蟲體長(zhǎng)度平均約120 μm,內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)、肌纖維清晰。原頭蚴上有小鉤、吸盤及微細(xì)的石灰顆粒,具有感染性。以及包囊壁上可見附著的原頭蚴蟲體。包囊壁組織結(jié)構(gòu)疏松,囊壁表面可見密集空隙結(jié)構(gòu)(圖2)。

    圖2 掃描電子顯微鏡下原頭蚴與包囊壁的超微結(jié)構(gòu)Fig.2 Ultrastructure of protocephala and cyst wall under scanning electron microscope

    2.3 感染羊肝臟血管病理組織學(xué)變化 通過感染綿羊的肝臟病理組織學(xué)觀察,可見肝臟呈局灶性壞死,在壞死組織內(nèi)血管管壁分解出芽,并向外側(cè)凸起延伸至炎癥區(qū)域。圍繞血管周圍有較多的纖維組織增生呈片層結(jié)構(gòu),增生的膠原纖維自外側(cè)血管壁向周圍炎癥區(qū)域輻射擴(kuò)散性生長(zhǎng)。在出芽的血管周圍肝細(xì)胞消失,血管內(nèi)外積聚大量的嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。嚴(yán)重病變血管壁纖維組織增生導(dǎo)致血管管腔狹窄,形態(tài)不規(guī)則(圖3)。

    圖3 感染羊肝臟組織血管病理組織變化Fig.3 Pathological changes of liver blood vessels in infected sheep

    2.4 感染羊肝臟組織細(xì)胞損傷與炎癥反應(yīng) 在肝臟病變區(qū)域內(nèi)可見沿血管周圍的肝細(xì)胞大范圍局灶性壞死,壞死組織融合成片,嗜伊紅性增強(qiáng),以及大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。在壞死組織周邊肝細(xì)胞索斷裂,細(xì)胞萎縮、形態(tài)不規(guī)則。肝細(xì)胞核消失,胞質(zhì)空泡化,壞死的炎癥區(qū)域可見纖維組織的增生(圖4)。

    圖4 感染羊肝臟組織細(xì)胞損傷與炎癥反應(yīng)Fig.4 Injury of liver cells and inflammation in infected sheep

    2.5 感染羊肝臟組織纖維化和包囊形成 在病變肝組織內(nèi)增生的纖維組織沿殘存的肝細(xì)胞周圍炎癥部位生長(zhǎng),將炎癥區(qū)域與周圍肝組織分離,纖維化包囊逐漸形成。在纖維化包囊形成過程中炎癥細(xì)胞逐漸減少,多核巨細(xì)胞增多,包囊內(nèi)壁纖維融合形成均質(zhì)的、強(qiáng)嗜伊紅的纖維瘢痕組織(圖5)。

    圖5 感染羊肝臟組織纖維化和包囊形成Fig.5 Liver tissue fibrosis and cyst formation in infected sheep

    2.6 細(xì)胞化學(xué)染色方法觀察感染羊肝臟纖維化形成通過Masson細(xì)胞化學(xué)染色方法對(duì)病變肝組織特殊染色可見,原頭蚴感染后肝臟的炎癥反應(yīng)、肝細(xì)胞壞死、組織纖維化形成均是以血管為中心所產(chǎn)生。隨著炎癥的發(fā)展,肝細(xì)胞壞死范圍增加,血管周圍纖維組織向炎癥區(qū)域伸長(zhǎng),所形成的纖維組織沿殘存肝細(xì)胞周圍生長(zhǎng),形成包囊(圖6)。

    圖6 細(xì)胞化學(xué)染色觀察感染羊肝臟纖維化形成Fig.6 Cytochemical staining to observe liver fibrosis in infected sheep

    3 討論

    細(xì)粒棘球蚴?。òx?。┦俏覈?guó)畜牧地區(qū)重要的人畜共患病,嚴(yán)重危害人類健康及畜牧業(yè)的發(fā)展[1]。其感染途徑是由犬科動(dòng)物(犬、狼)等終末宿主將細(xì)粒棘球蚴的蟲卵和孕節(jié)隨糞便排至體外,牛、羊等中間宿主吞食蟲卵后而受感染。進(jìn)入消化道的六鉤蚴鉆入腸壁,在消化液的作用下囊壁溶解,原頭蚴附著在小腸壁上并開始發(fā)育。經(jīng)血流或淋巴散布到體內(nèi)各處,以肝臟、肺臟兩處最多[3]。其中Eg95基因在細(xì)粒棘球絳蟲六鉤蚴侵入小腸絨毛上皮的過程中起重要作用[10]。

    細(xì)粒棘球蚴對(duì)機(jī)體的損害可以局限在寄居部位,也可以擴(kuò)展到機(jī)體的其他部位,其損害方式包括:機(jī)械損傷、奪取營(yíng)養(yǎng)、毒素作用及引起的免疫反應(yīng)。各種損害方式對(duì)機(jī)體的作用常導(dǎo)致細(xì)胞損害,表現(xiàn)為肝細(xì)胞的萎縮、凋亡和壞死等[11]。彭心宇等[12]在外科實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)囊型包蟲寄生人體肝臟后致部分肝細(xì)胞“消失”的現(xiàn)象,尤以細(xì)粒棘球蚴寄生于肝左葉時(shí)此現(xiàn)象更明顯,甚至肝左葉實(shí)質(zhì)幾乎完全“消失”,實(shí)驗(yàn)顯示肝纖維化與“外膜”的形成相關(guān),包囊可能是宿主對(duì)棘球蚴的免疫而發(fā)生異物反應(yīng)形成肉芽腫樣組織并不斷纖維化增生的結(jié)果[13-14]。

    目前對(duì)肝包蟲囊腫周圍纖維囊壁形成機(jī)制的認(rèn)識(shí)觀點(diǎn)略有差異。昊少廷等[15]研究發(fā)現(xiàn),細(xì)粒棘球蚴寄生定位于肝臟后發(fā)育成囊腫,并不斷增大擠壓周圍肝實(shí)質(zhì)致成纖維細(xì)胞不斷增生逐漸形成膠原纖維和纖維包膜即囊,外囊是肝實(shí)質(zhì)纖維化的結(jié)果。Farrokh等[16]研究發(fā)現(xiàn),外囊是一層被擠壓的非上皮細(xì)胞化的纖維組織,與周圍肝實(shí)質(zhì)之間無(wú)解剖性分離間隙。顧樹南等[17]提出,細(xì)粒棘球蚴寄生定位于肝臟后,由于人體免疫功能及肝臟的屏蔽作用,在棘球蚴周圍的局部組織首先發(fā)生異物反應(yīng),炎性細(xì)胞包括嗜酸性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞及多核巨細(xì)胞浸潤(rùn)滲出,由新生的成纖維細(xì)胞形成纖維結(jié)締組織包膜包裹在棘球蚴周圍形成外囊,這種纖維性的外囊與所寄生的肝臟組織無(wú)明顯的分界不能分開。外囊壁并非蟲體而是機(jī)體臟器組織發(fā)生局部纖維化所形成的屏壁。Milicevic等[18]研究發(fā)現(xiàn),肝包蟲囊腫的外囊來(lái)源于宿主器官組織內(nèi)部包裹著血管及一些小的膽管外層被擠壓萎縮的肝細(xì)胞,其與周圍肝實(shí)質(zhì)之間無(wú)明確界線,故外囊切除是非常困難的。

    本研究在細(xì)粒棘球蚴感染肝臟包囊周圍的肝實(shí)質(zhì)組織呈現(xiàn)肝臟大范圍局灶性壞死,肝細(xì)胞明顯萎縮,體積顯著縮小,散在肝細(xì)胞壞死,細(xì)胞核消失,細(xì)胞質(zhì)空泡化,小血管(動(dòng)脈、靜脈)管壁纖維化、玻璃樣變以及血管出芽。其原因可能是由于局部血管及膽管的纖維化引起的局部營(yíng)養(yǎng)不良、淤血,原頭蚴不斷生長(zhǎng)對(duì)肝組織的機(jī)械性壓迫造成肝細(xì)胞萎縮(壓迫性、營(yíng)養(yǎng)不良性萎縮)[19]。本研究通過Masson細(xì)胞化學(xué)染色方法對(duì)病變肝組織特殊染色發(fā)現(xiàn),原頭蚴感染后肝臟的炎癥反應(yīng)、肝細(xì)胞壞死,組織纖維化形成均是以血管為中心所形成。隨著炎癥的發(fā)展,肝細(xì)胞壞死范圍增加,成纖維細(xì)胞向炎癥區(qū)域伸長(zhǎng),所形成的纖維組織沿殘存肝細(xì)胞周圍生長(zhǎng)而形成包囊。

    通過本研究結(jié)果分析,細(xì)粒棘球蚴感染肝臟包囊形成是機(jī)體受到蟲體刺激后形成的纖維組織。隨著包囊的不斷增大,對(duì)機(jī)體的損傷越來(lái)越嚴(yán)重,病灶中心區(qū)域肝細(xì)胞大量壞死,炎癥細(xì)胞滲出聚集,形成明顯的炎癥反應(yīng)界限,成纖維細(xì)胞大量增生,炎癥反應(yīng)外周肝組織纖維化形成。包囊組織發(fā)生液化性壞死,包囊液形成,包囊開始發(fā)育。同時(shí)發(fā)現(xiàn)肝臟組織局灶性壞死,肝細(xì)胞萎縮、壞死、纖維化囊壁的形成都是圍繞在血管周圍,說明血管是原頭蚴進(jìn)入肝臟的主要途徑而不是簡(jiǎn)單的附著在肝臟表面。上述研究尚屬初步,血管病理及纖維化囊壁的形成是其生長(zhǎng)過程中一種較普遍的病理現(xiàn)象,是與肝蟲病診斷、治療、愈后密切相關(guān)的一個(gè)病理學(xué)表現(xiàn)[20]。細(xì)粒棘球蚴對(duì)肝臟的致病機(jī)制還需通過建造小鼠模型進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)血管病理,纖維囊壁形成的時(shí)間節(jié)點(diǎn),組織局灶壞死過程以及通過分子病理分析肝臟纖維化形成相關(guān)因子的作用等。

    本研究通過對(duì)感染原頭蚴綿羊肝臟包囊形成和肝細(xì)胞壞死的病理組織學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、超微結(jié)構(gòu)觀察,發(fā)現(xiàn)原頭蚴感染后病變產(chǎn)生于感染組織的血管周圍,血管壁纖維組織分解、管壁出芽,分解并增生的纖維組織伸向周圍炎癥區(qū)域內(nèi),血管管腔及炎區(qū)大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),肝細(xì)胞萎縮、變性、壞死,增生的膠原纖維沿殘存的肝細(xì)胞周圍圍繞病變組織包囊壁形成。

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