光照應(yīng)激對(duì)雌性大鼠性激素水平和卵巢組織腫瘤壞死因子α、γ干擾素蛋白表達(dá)的影響*

周 知 黎業(yè)娟 陳 琳 王安國(guó) 阮海玲 馬 寧 周 璟 涂志華

（海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心生殖醫(yī)學(xué)中心，?？?570206）

各種應(yīng)激以及壓力影響始于大腦，隨后影響機(jī)體組織和靶器官。應(yīng)激反應(yīng)通過神經(jīng)、心血管、免疫和代謝系統(tǒng)的反應(yīng)促進(jìn)機(jī)體適應(yīng)和生存[1]。隨著現(xiàn)代工作時(shí)間的延長(zhǎng)，人們對(duì)于光照的依賴也隨之加強(qiáng)，尤其是晚上加班更是加強(qiáng)了光照對(duì)機(jī)體的影響，一定時(shí)長(zhǎng)的光照壓力引起大腦內(nèi)分泌失調(diào)，進(jìn)一步影響全身[2-3]。慢性應(yīng)激會(huì)引起機(jī)體行為的改變，機(jī)體表現(xiàn)出形態(tài)和生理變化，但目前尚不清楚持續(xù)數(shù)月的光照應(yīng)激是否會(huì)對(duì)機(jī)體尤其是生殖系統(tǒng)產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的影響[4-5]。卵巢早衰是一種原發(fā)性卵巢損傷，大約影響1%的女性[6]。其最嚴(yán)重的癥狀是青春期發(fā)育不全和原發(fā)性閉經(jīng)（大約50%是由于卵巢發(fā)育不全引起的），與生理性更年期的情況一樣，卵巢早衰的臨床特征是低水平的性腺激素（雌激素和抑制素）和高水平的促性腺激素促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH），可能導(dǎo)致不孕癥或嚴(yán)重的神經(jīng)、代謝、免疫或心血管機(jī)能紊亂，并導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的早期發(fā)病[8]。本研究通過給予雌性大鼠不同的光照強(qiáng)度，探究其對(duì)大鼠性激素水平、動(dòng)情周期變化以及卵巢組織中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）蛋白的表達(dá)的影響，以探討不同的光照強(qiáng)度對(duì)于雌性大鼠生殖腺的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型制備與分組

通過陰道涂片實(shí)驗(yàn)篩選出SPF級(jí)2月齡左右的性成熟雌性SD大鼠100只，隨機(jī)抽取20只作為對(duì)照組，其余80只為光照應(yīng)激干預(yù)組（光照組）。對(duì)照組放置于常規(guī)環(huán)境，模擬正常晝夜節(jié)律（光照時(shí)間：黑暗時(shí)間=12 h：12 h），每日隨機(jī)飲食水；光照組置于飼養(yǎng)室中飼養(yǎng)，每日為晚8點(diǎn)至早8點(diǎn)持續(xù)（2周）給予不同的強(qiáng)度光照，即20、40、60、100 W日光燈直射，距離約 2.5 m（20、40、60和100W對(duì)應(yīng)的照度為251、502、754 和1 256 Lux），分別設(shè)為20 W組、40 W組、60 W組、100 W組，早8點(diǎn)至晚8點(diǎn)避免一切光照，放置于黑暗環(huán)境。在飼養(yǎng)過程中，20 W組、40 W組、60 W組各組給予相同飲水（250 mL）和食物（500 g），于固定時(shí)間觀察檢測(cè)大鼠的生物學(xué)表征如體質(zhì)量、進(jìn)食量以及飲水量等。6個(gè)月光照應(yīng)激結(jié)束后，將各組大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈采血，離心取上清液以備用。取大鼠一側(cè)卵巢包埋用以做免疫組織化學(xué)檢測(cè)，另一側(cè)卵巢用錫紙包埋后迅速放入液氮中。

1.2 ELISA 法檢測(cè)各組大鼠血清中性激素水平

將大鼠血液3 000 r/min 離心 15 min，取上層血清置于潔凈的EP 管中，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書要求，測(cè)定大鼠血清FSH、雌二醇、LH 的水平，在酶標(biāo)儀上450 nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔吸光度（A450）值。

1.3 免疫組織化學(xué)顯色檢測(cè)卵巢組織TNF-α、IFN-γ蛋白的表達(dá)

切片脫蠟，PBS 洗 3次，微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，加H2O2處理，滴加封閉液，PBS 洗3次后滴加稀釋好的TNF-α、IFN-γ 抗體（1∶100）孵育30 min，4℃過夜。滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃ 孵育 15 min。滴加適量的辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃ 孵育 20 min。給予辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育 25 min，顯色劑顯色 3～15 min，自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察染色結(jié)果。卵巢組織標(biāo)本中細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)淡黃色或黃色顆粒狀著色為陽性表達(dá)，采用 IPP 6.0 軟件在同等條件下檢測(cè)每張TNF-α 或IFN-γ組織切片中的 IFN-γ表達(dá)的積分光密度（A450）值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），進(jìn)一步兩兩比較用q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠動(dòng)情周期變化

與對(duì)照組相比，光照組大鼠動(dòng)情周期顯著延長(zhǎng)，且隨著光照強(qiáng)度以及時(shí)間的推移動(dòng)情周期延長(zhǎng)更為顯著，其中動(dòng)情間期、動(dòng)情前期、動(dòng)情期持續(xù)時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但動(dòng)情后期顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）（表1）。

2.2 各組大鼠血清中性激素的含量變化

與對(duì)照組比較，40 W組、60 W組、100 W組大鼠血清中雌二醇含量顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)SH、LH 的含量顯著升高（P＜0.05）（表2）。

表1 各組大鼠動(dòng)情周期比較（±s，d）

表1 各組大鼠動(dòng)情周期比較（±s，d）

*P＜0.05 vs 對(duì)照組

組別 動(dòng)情周期 動(dòng)情間期 動(dòng)情前期 動(dòng)情期持續(xù)時(shí)間 動(dòng)情后期對(duì)照組 5.24±0.87 1.29±0.35 1.32±0.39 1.52±0.35 1.89±1.12 25 W組 6.54±1.74 1.53±0.48 1.51±0.63 1.84±0.47 2.64±1.90 40 W組 6.89±1.85 1.76±0.37 1.75±0.59 2.12±0.34 3.01±1.14 60 W組 8.14±1.27* 2.04±0.48 2.08±0.76 2.72±0.52 3.15±1.57*100 W組 10.89±1.84* 2.24±0.48 2.42±0.63 2.84±0.39 6.64±1.90*

2.3 TNF-α、IFN -γ在各組大鼠卵巢組織中的表達(dá)

TNF-α 蛋白主要在對(duì)照組大鼠卵巢細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，少量在間質(zhì)和黃體中表達(dá)；在不同光照組大鼠細(xì)胞質(zhì)、黃體及間質(zhì)中高表達(dá)，且隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)，各光照組大鼠卵巢中TNF-α 蛋白表達(dá)均上升（圖1，表3），其中60 W組、100 W組大鼠與對(duì)照組大鼠比較，卵巢中TNF-α 蛋白表達(dá)較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而25 W組、40 W組大鼠與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠激素水平的變化（±s）Tab2 Changes of hormone level in each group（±s）

表2 各組大鼠激素水平的變化（±s）Tab2 Changes of hormone level in each group（±s）

*P＜0.05 vs 對(duì)照組

組別 雌二醇（pg/mL）卵泡刺激素（mlU/mL）促黃體生成素（mlU/mL）對(duì)照組 48.21±4.85 2.34±0.67 3.72±1.13 25 W組 42.58±7.51 3.57±0.89 4.15±1.51 40 W組 38.42±6.11 4.14±0.35 4.75±0.45 60 W組 30.51±5.34* 7.19±0.59* 6.84±0.87*100 W組 21.36±4.24* 8.14±0.76* 8.72±1.17*

IFN-γ 蛋白主要在對(duì)照組大鼠卵巢細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，少量在間質(zhì)和黃體中表達(dá)；在不同光照組大鼠細(xì)胞質(zhì)、黃體及間質(zhì)中高表達(dá)，且隨著光照增強(qiáng)而增多。與對(duì)照組比較，60 W組、100 W組卵巢中IFN-γ 蛋白的表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而25 W組、40 W組與對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2，表3）。

表3 各組大鼠卵巢組織TNF-α、IFN-γ 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組大鼠卵巢組織TNF-α、IFN-γ 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

*P＜0.05 vs 對(duì)照組

組別 n TNF-α IFN-γ對(duì)照組 20 4.26±0.49 3.48±0.61 25 W組 19 5.14±0.53 4.56±0.43 40 W組 19 5.85±0.41 4.95±0.36 60 W組 18 8.78±0.58* 7.90±0.46*100 W組 19 9.68±0.84* 9.14±0.29*

圖1 TNF-α（A1～E1）和IFN-γ（A2～E2）在各組大鼠卵巢組織中的表達(dá)，免疫組織化學(xué)，×200

3 討論

應(yīng)激在一定程度下會(huì)干擾機(jī)體正常的平衡狀態(tài)，機(jī)體會(huì)通過應(yīng)激應(yīng)答機(jī)制處理應(yīng)激源（stressor）產(chǎn)生的刺激，以維護(hù)機(jī)體體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡穩(wěn)態(tài)[2]。長(zhǎng)期的光照應(yīng)激會(huì)在一定程度上影響大腦調(diào)控機(jī)體激素的功能，導(dǎo)致分泌激素水平下降，使得性腺軸（下丘腦-垂體-卵巢）負(fù)反饋調(diào)節(jié)受阻，導(dǎo)致垂體分泌的FSH和LH激素水平上升，其中以FSH的上升更為顯著[9]。不同強(qiáng)度的光照強(qiáng)度均可引起大鼠性激素水平的改變，且隨著光照強(qiáng)度以及時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)大鼠的影響也日益明顯。不同光照強(qiáng)度干預(yù)組大鼠的外周血中雌二醇激素水平相比于對(duì)照組顯著降低，可能的原因是不同光照強(qiáng)度影響下丘腦的分泌功能，從而影響垂體功能，進(jìn)一步影響卵巢，造成機(jī)體性激素紊亂，影響大鼠卵池中各級(jí)卵泡的數(shù)量以及功能，造成卵巢儲(chǔ)備功能低下，影響大鼠卵巢功能[10]。不同光照強(qiáng)度干預(yù)組大鼠血清FSH、LH激素水平顯著高于對(duì)照組，一方面可能的原因是大鼠晚上長(zhǎng)時(shí)間處于強(qiáng)光環(huán)境使性腺軸的正常分泌功能受到影響，另一方面可能是卵巢-垂體-下丘腦之間相互影響，通過負(fù)反饋機(jī)制作用，相互作用，造成大鼠體內(nèi)激素（雌二醇、FSH、LH）的改變。激素FSH和LH會(huì)相互作用，并有助于卵泡的成熟及排卵、參加雌性激素的合成與分泌[11]。因此以上各個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常均可導(dǎo)致卵巢功能的失調(diào)。

有研究證實(shí)如果下調(diào)TNF-α 在大鼠血清含量及卵巢組織中的表達(dá)，有助于對(duì)卵巢起保護(hù)作用，減緩卵巢功能的下降[12]。IFN-γ 是具有多種免疫調(diào)節(jié)功能的免疫調(diào)節(jié)因子，其在生殖腺的主要研究集中在對(duì)卵巢衰老功能的作用上[13]。IFN-γ 在機(jī)體各級(jí)卵泡從卵池中發(fā)育到成熟卵泡、排卵以及閉鎖整個(gè)過程中均參與調(diào)節(jié)。Russell 等[15]報(bào)道卵泡閉鎖引起卵巢功能下降，IFN-γ 參與調(diào)節(jié)一系列與卵泡閉鎖有關(guān)的細(xì)胞因子。IFN-γ 蛋白在卵巢中表達(dá)的水平與FSH/LH值呈正相關(guān)，提示隨著卵巢組織中IFN-γ 蛋白表達(dá)的升高，卵巢儲(chǔ)備功能下降。另外，IFN-γ 蛋白可能與卵巢顆粒細(xì)胞損傷或凋亡有關(guān)，其會(huì)造成卵巢顆粒細(xì)胞的過度衰老及凋亡，進(jìn)一步加快卵池中卵泡的閉鎖，從而造成機(jī)體的排卵障礙，引起機(jī)體卵巢早衰[14]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，不同光照強(qiáng)度干預(yù)組TNF-α、IFN-γ 蛋白表達(dá)明顯升高，其中60 W 光照組、100 W 光照組TNF-α、IFN-γ 蛋白表達(dá)水平最高，提示隨著光照強(qiáng)度以及時(shí)間延長(zhǎng)，TNF-α、IFN-γ 蛋白表達(dá)的升高可加快大鼠體內(nèi)卵泡閉鎖甚至凋亡。

綜上所述，長(zhǎng)期的慢性光照應(yīng)激不僅能影響大鼠內(nèi)分泌功能，引起大鼠內(nèi)分泌紊亂，從而造成性激素水平的紊亂，而且能升高卵巢中的TNF-α、IFN-γ 蛋白表達(dá)，使其與性激素相互影響，引起卵巢功能下降，造成卵巢早衰。