A549肺癌細(xì)胞條件培養(yǎng)液促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和遷移*

姜 楊 王璐璐 金海峰 姚立杰 張 嵩 劉丹陽(yáng) 李永濤 張善強(qiáng) 沈 雷△

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，1 解剖學(xué)教研室，2 細(xì)胞生物學(xué)教研室，3組織學(xué)胚胎學(xué)教研室，齊齊哈爾 161006）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）是促成肺癌發(fā)生的因素之一[1]。趨化因子濃度增高能夠誘使細(xì)胞歸巢[2]。趨化因子-8（C-X-C motif chemokine ligand-8，CXCL-8）除了促進(jìn)MSC運(yùn)動(dòng)[3]，還在結(jié)腸癌、膀胱癌等腫瘤組織高表達(dá)[4-5]，并是預(yù)測(cè)宮頸癌發(fā)生的重要指示[6]，再次證實(shí)CXCL-8 對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移具有關(guān)鍵作用。Akt 通路調(diào)節(jié)的肌動(dòng)蛋白收縮導(dǎo)致細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[7]，CXCL-8可活化血管內(nèi)皮細(xì)胞Akt-STAT3 通路[8]，促進(jìn)血管新生[9]。CXCL8 為促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移提供了新血管形成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等基礎(chǔ)條件[10]。雖然非小細(xì)胞肺癌高表達(dá)的CXCL-8 促進(jìn)了肺癌發(fā)展[11]，但是肺癌細(xì)胞通過(guò)CXCL8 招募MSC 歸巢的作用和機(jī)制仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平觀察A549細(xì)胞表達(dá)的CXCL-8 通過(guò)Akt 通路對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs）增殖或運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的影響，研究結(jié)果將為抑制肺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

hBMSCs 購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司。A549細(xì)胞和BEAS-2B 細(xì)胞均購(gòu)于美國(guó)菌種保存中心（American Type Culture Collection，ATCC）。人CXCL-8 重組蛋白和triciribine（美國(guó)Selleck 公司）；DMEM/F12 培養(yǎng)基、α-MEM 培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）；RIPA 細(xì)胞裂解液、BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒等試劑（上海碧云天生物科技公司）；人CXCL-8、Akt、P-Akt蛋白ELISA 試劑盒（美國(guó)Antibodies 公司）；MTT、L-谷氨酰胺、二甲基亞砜（美國(guó)Sigma 公司）；Annexin V-PI 細(xì)胞凋亡試劑盒（美國(guó)Hyclone 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞、BEAS-2B 細(xì)胞分別用含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基或DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。含10% 胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)hBMSCs。4.5×106個(gè)/mL A549細(xì)胞或BEAS-2B細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)12 h，800 r/min 離心5 min，分別提取A549細(xì)胞和BEAS-2B細(xì)胞上清液，0.22 μm 濾器抽濾，液氮保存。正常條件下，無(wú)任何刺激的hBMSCs 為對(duì)照組。以體積比1∶4 稀釋A549細(xì)胞或BEAS-2B 細(xì)胞上清液為條件培養(yǎng)基[12]，條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的hBMSCs 為A549組 或BEAS-2B組；3組均添加50 nmol/L CXCL-8則為A549 C組和BEAS-2B C組；若同時(shí)添加100 nmol/L triciribine則分別為A549 CT組 和BEAS-2B CT組。A549組加入100 nmol/L triciribine 則為A549 T組。

1.3 ELISA 檢測(cè)CXCL-8、Akt 或P-Akt蛋白含量

人ELISA試劑盒檢測(cè)A549細(xì)胞和BEAS-2B細(xì)胞上清液中CXCL-8蛋白含量。4℃，以RIPA細(xì)胞裂解緩沖液裂解密度為4.5×106個(gè)/mL各組hBMSCs，10 000 r/min離心5 min；BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度后，再以人ELISA試劑盒檢測(cè)各組hBMSCs中Akt或P-Akt蛋白的含量[8]。

1.4 Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hBMSCs遷移數(shù)目

1.5×104個(gè)/mL hBMSCs置于Transwell細(xì)胞小室內(nèi)，下層腔室加入按實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置而添加的試劑或條件培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)12 h，擦除transwell細(xì)胞小室內(nèi)hBMSCs，0.01 mmol/L PBS 清洗3次，每次1 min；4%多聚甲醛溶液固定transwell細(xì)胞小室60 min，0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次1 min；1%結(jié)晶紫染色30 min。Image-Pro Plus 6.0.1（IPP 6.0.1）軟件計(jì)算單位面積下被結(jié)晶紫染色的hBMSCs遷移數(shù)目。

1.5 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖吸光度

0.6×104個(gè)/mL hBMSCs加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃，5%CO2培養(yǎng)12 h；按照實(shí)驗(yàn)分組分別加入各組條件培養(yǎng)基或試劑。37℃，5%CO2培養(yǎng)12 h；加入5 g/L MTT 溶液，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再添加二甲基亞砜，Emax Plus 酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)細(xì)胞增殖吸光度（absorbance value，A490值）。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

用1.25% Annexin V-FITC溶液重懸2×105個(gè)/mL各組hBMSCs，孵育20 min；10 000 r/min離心5 min；0.01 mmol/L PBS清 洗3次，每次1 min；加 入2%PI溶液，冰上孵育2 min，10 000 r/min離心5 min，0.01 mmol/L PBS重懸。FACSAria Ⅱ型流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hBMSCs 增殖

對(duì)照組、BEAS-2B組、A549組、BEAS-2B C組、A549 C組、A549 T組、A549 CT組 和BEAS-2B CT組的A490值分別為0.91±0.05、0.93±0.06、1.13±0.01、1.35±0.07、1.72±0.09、0.94±0.11、1.39±0.06、1.04±0.03，各組hBMSCs增殖的A490值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。相對(duì)于BEAS-2B組和對(duì)照組，A549組A490值升高；A549 C組hBMSCs細(xì)胞A490值最高；A549 CT組比A549 C組A490值降低。這提示CXCL-8能夠促進(jìn)hBMSCs增殖；A549細(xì)胞上清液含有促進(jìn)hBMSCs增殖的活性成分。

2.2 hBMSCs 凋亡

對(duì)照組（43.1%）、BEAS-2B組（40.9%）、A549組（31.2%）、BEAS-2B C組（26.1%）、A549 C組（10.3%）、A549 CT組（13.4%）、BEAS-2B CT組（29.0%）、A549 T組（37.2%），各組細(xì)胞凋亡率相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1）。A549組hBMSCs 凋亡率比BEAS-2B組和對(duì)照組顯著降低；A549 C組hBMSCs 凋亡率最低，添加了Akt抑制劑的各組hBMSCs 凋亡率比相應(yīng)各組hBMSCs凋亡率均呈升高趨勢(shì)。結(jié)合細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，共同提示A549細(xì)胞能夠促進(jìn)hBMSCs 增殖，抑制hBMSCs 凋亡，說(shuō)明A549細(xì)胞分泌的上清液中含有提高h(yuǎn)BMSCs 活性的有效因子（圖1）。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組hBMSCs 細(xì)胞凋亡

2.3 hBMSCs遷移

Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2），對(duì)照組、BEAS-2B組、A549組、BEAS-2B C組、A549 C組、A549 T組、A549 CT組 和BEAS-2B CT組 穿過(guò)transwell 細(xì)胞小室基膜的hBMSCs 數(shù)目分別為40.53±1.13、42.72±1.55、59.64±1.95、53.67±2.04、75.05±1.37、43.83±2.16、61.32±2.13、35.94±1.81，各組hBMSCs遷移數(shù)目差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。相對(duì)于BEAS-2B組和對(duì)照組，A549組hBMSCs遷移數(shù)目升高；A549 C組hBMSCs遷移數(shù)目最高；A549 CT組 比A549 C組遷移數(shù)目降低。提示CXCL-8 促進(jìn)hBMSCs遷移的作用可被Akt 抑制劑所抑制。

圖2 Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組hBMSCs 的12 h 細(xì)胞遷移，標(biāo)尺=100 μm

2.4 A549細(xì)胞和BEAS-2B細(xì)胞上清液中CXCL-8蛋白的含量

ELISA 驗(yàn)證A549細(xì)胞上清液中含有的活性因子顯示，A549上清液中CXCL-8含量是（13.108±0.120）ng/L，BEAS-2B上清液CXCL-8含量為（6.053±0.340）ng/L，2組數(shù)據(jù)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.5 hBMSCs 的Akt、P-Akt蛋白含量情況

ELISA結(jié)果顯示各組hBMSCs的Akt和P-Akt蛋白含量分別為：對(duì)照組（7.54±1.04）mg/L和（6.93±1.13）mg/L ；BEAS-2B組（7.60±1.69）mg/L和（6.82±1.07）mg/L；A549組（14.27±1.53）mg/L 和（11.92±1.18）mg/L ；BEAS-2B C組（19.03±1.45）mg/L和（16.69±1.02）mg/L；A549 C組（31.52±1.78）mg/L和（29.08±1.93）mg/L；A549 T組（26.31±1.59）mg/L 和（18.42±1.63）mg/L ；A549 CT組（13.23±1.31）mg/L 和（12.90±1.77）mg/L和BEAS-2B CT組（9.24±1.55）mg/L和（6.22±1.43）mg/L。各組hBMSCs的Akt蛋白含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），P-Akt蛋白含量差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。相對(duì)于BEAS-2B組和對(duì)照組，A549組Akt 和P-Akt蛋白含量明顯升高；A549 C組Akt和P-Akt蛋白含量明顯最高；添加了Akt 抑制劑的各組細(xì)胞Akt 和P-Akt蛋白含量比相應(yīng)各組呈降低趨勢(shì)。以上結(jié)果證明：A549細(xì)胞上清液含有的CXCL-8 通過(guò)激活hBMSCs 內(nèi)Akt信號(hào)通路，促進(jìn)hBMSCs 增殖和運(yùn)動(dòng)。

3 討論

3.1 A549細(xì)胞表達(dá)CXCL-8提高h(yuǎn)BMSCs增殖或遷移能力

轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞通常不能用傳統(tǒng)的外科或放化療策略根除，治療后疾病復(fù)發(fā)極為常見(jiàn)，清除腫瘤干細(xì)胞是抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[13]。干細(xì)胞治療方法在癌癥治療中顯示出越來(lái)越大的希望。干細(xì)胞通過(guò)歸巢能到達(dá)原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤病灶，并以載體的形式穩(wěn)定表達(dá)靶向抗腫瘤藥物，可減小腫瘤體積，延長(zhǎng)存活時(shí)間，減輕治療副作用[14]。闡明MSC等干細(xì)胞歸巢到惡性腫瘤微環(huán)境的機(jī)制，提高M(jìn)SC歸巢率是開(kāi)展MSC在惡性腫瘤治療的前提。

MSC 廣泛分布在骨髓、脂肪、臍帶血等多種組織，容易分離和體外培養(yǎng)。MSC 可多向分化為骨、軟骨、脂肪、血管等組織，還能分泌SDF-1α、VEGF、EGF 等大量趨化因子、生長(zhǎng)因子等生物活性分子，對(duì)維持MSC 干性起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[15]。研究表明，與腫瘤細(xì)胞活性相類(lèi)似，MSC也具有易遷移、向組織歸巢運(yùn)動(dòng)能力[16]。肺癌細(xì)胞與MSC 相互影響，相互促進(jìn)，MSC 在肺癌等惡性腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中扮演關(guān)鍵作用[17]。目前發(fā)現(xiàn)MSC 具有定向遷移到腫瘤組織，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的能力，與胃癌、乳腺癌等多種癌癥進(jìn)展有關(guān)，表現(xiàn)出較好地維持腫瘤生長(zhǎng)的能力[18]。但是從趨化因子角度闡明肺癌組織招募MSC 的機(jī)制還不清楚。

本實(shí)驗(yàn)采取A549 為研究對(duì)象，觀察A549 肺癌細(xì)胞上清液對(duì)hBMSCs 增殖、凋亡和遷移作用效果和機(jī)制。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示A549細(xì)胞上清液中可能具有活化hBMSCs 的活性物質(zhì)。袁哲等[19]將A549細(xì)胞條件培養(yǎng)基按照體積濃度分為高濃度（100%）和低濃度（50%）2組，使用MTT 和transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)分別觀察對(duì)人臍帶血MSC增殖和遷移的影響，顯示低或高濃度A549 條件培養(yǎng)基均明顯促進(jìn)人臍帶血MSC 增殖和遷移率，尤以高濃度組實(shí)驗(yàn)結(jié)果為甚。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與該研究相符。但是袁哲等[19]并未對(duì)A549細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)人臍帶血MSC 凋亡效果或招募人臍帶血MSC歸巢的機(jī)制進(jìn)行分析。本研究深入開(kāi)展了Annexin V-PI 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，觀察到A549細(xì)胞上清液還可以降低hBMSCs 的細(xì)胞凋亡率，推測(cè)A549 上清液中可能含有某些激活hBMSCs 的活性因子。

張鵬等[20]報(bào)道CXCL-8 對(duì)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有較好的促進(jìn)運(yùn)動(dòng)能力。趨化因子對(duì)多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展具有較好調(diào)控能力。食管癌表達(dá)的CXCL-8（又稱(chēng)IL-8）通過(guò)激活STAT3信號(hào)通路，抑制NK 細(xì)胞定向趨化到癌組織，進(jìn)而促進(jìn)食管癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[21]。本研究采用ELISA 實(shí)驗(yàn)顯示A549上清液中CXCL-8表達(dá)明顯升高，與CXCL-8 在惡性腫瘤組織較高表達(dá)的結(jié)果相一致[21]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CXCL-8在A549細(xì)胞對(duì)hBMSCs的影響，實(shí)驗(yàn)又設(shè)立了陽(yáng)性對(duì)照組，即向BEAS-2B組或A549組添加了CXCL-8重組蛋白。結(jié)果顯示，BEAS-2B C組hBMSCs增殖或遷移率明顯比BEAS-2B組升高，A549 C組的增殖或遷移率呈現(xiàn)最高，進(jìn)一步說(shuō)明CXCL-8在A549細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)hBMSCs增殖和遷移能力方面發(fā)揮了重要作用。

胰腺癌、胃癌等腫瘤表達(dá)CXCL-8 會(huì)促進(jìn)血管新生[22-23]。CXCL-8除了對(duì)MSC等細(xì)胞具有較強(qiáng)招募作用外[8，20]，還能夠促進(jìn)MSC分泌VEGF，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，加速血管新生等作用[8，22-23]。本實(shí)驗(yàn)只檢測(cè)了CXCL-8一種趨化因子含量，A549細(xì)胞分泌的上清液可能還含有其他炎癥因子或趨化因子，這些活性成分的檢測(cè)還需要借助高效液相色譜技術(shù)或基因芯片等手段進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2 A549細(xì)胞表達(dá)CXCL-8激活hBMSCs內(nèi)Akt信號(hào)通路

添加triciribine 的A549 CT組hBMSCs增殖和細(xì)胞遷移率降低，細(xì)胞凋亡率升高，更說(shuō)明A549細(xì)胞上清液通過(guò)Akt信號(hào)通路發(fā)揮作用。A549組hBMSCs 的Akt 和P-Akt蛋白表達(dá)均明顯增加；A549 CT組hBMSCs 的Akt 和P-Akt蛋白表達(dá)均明顯降低。這說(shuō)明A549細(xì)胞上清液中的CXCL-8與hBMSCs 表面的CXCR1/2 受體結(jié)合[24]，能夠激活hBMSCs 內(nèi)Akt信號(hào)通路。結(jié)合使用Akt 抑制劑的A549 CT組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，再次證明A549 能夠表達(dá)CXCL-8 趨化因子，通過(guò)Akt信號(hào)通路發(fā)揮了招募MSC 歸巢的作用。如果阻斷Akt信號(hào)通路或其下游的mTOR等相關(guān)蛋白，CXCL-8會(huì)降低MSC歸巢效率，更說(shuō)明CXCL-8 通過(guò)PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路使更多的MSC歸巢。

綜上所述，A549細(xì)胞微環(huán)境表達(dá)的CXCL-8激活hBMSCs 內(nèi)Akt信號(hào)通路，促進(jìn)hBMSCs 增殖或遷移，對(duì)闡明腫瘤微環(huán)境與MSC相互作用，揭示肺癌干細(xì)胞來(lái)源，尋找抑制肺癌發(fā)生發(fā)展的方法具有非常重要的意義。