碳酸銨對柑橘酸腐病菌的抑制效果及作用機制

劉寒寒，楊書珍，李 哲，張美紅，彭麗桃

（華中農業(yè)大學食品科技學院，湖北 武漢 430070）

柑橘是我國重要的水果，2017年種植面積達到257萬 hm2，產量超過3 800萬 t[1]。柑橘在采后貯運環(huán)節(jié)易受多種病原菌侵染[2]，導致果實腐爛，造成嚴重的經濟損失[3]。由酸腐病菌引起的酸腐病，近年來被報道成為全球產區(qū)重要的采后病害，尤其是在潮濕多雨季節(jié)，發(fā)病更為嚴重[4]。目前在生產實踐中，主要采用化學殺菌劑如抑霉唑、咪鮮胺等，雖能有效控制柑橘青綠霉病菌，但對酸腐病菌抑制效果不佳[5]；并且病菌易產生抗藥性、使用濃度較高，造成環(huán)境污染、對人體健康產生危害[6]。因此，最近研究者們在探尋替代化學殺菌劑控制酸腐的方法。已經有報道表明，酸腐病菌可以通過合適的冷藏條件[7]，應用拮抗酵母[8]，以及揮發(fā)性精油來控制[9]，但這些處理不能完全有效降低酸腐病菌侵染。

采用通常認為安全（generally recognized as safe，GRAS）的藥劑處理，由于其低毒性，更易為消費者接受，可直接應用在有機水果蔬菜的保鮮，因而引起了研究者的關注[10]。包括碳酸鈉、碳酸氫鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉等幾種鹽類物質已經在柑橘上檢驗了其控制柑橘青綠霉腐爛的效果[11-12]，并且發(fā)現(xiàn)碳酸鈉結合熱處理，控制效果更佳，對果實無毒害作用[13]。Smilanick等[14]報道橙子在1%的山梨酸鉀或碳酸氫鈉溶液中50 ℃下處理30 s，能將酸腐病發(fā)生率由94.5%分別降低到37.0%和15.7%，顯示了潛在的應用前景。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，碳酸銨能有效抑制意大利青霉孢子萌發(fā)和菌絲生長，并能有效控制由意大利青霉引起的柑橘腐爛[15]。本研究將進一步分析碳酸銨對酸腐病菌的抑菌活性及其可能的作用機制，并評價其在果實上的效果，為開發(fā)控制柑橘酸腐病菌的高效、安全控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

酸腐病菌從發(fā)病柑橘上分離，并接種果實，形態(tài)學和分子手段鑒定為酸腐病菌，接種于PDA培養(yǎng)基上，26 ℃培養(yǎng)3～4 d后，繼續(xù)傳代培養(yǎng)4～5 代后置于4 ℃保存?zhèn)溆?，用PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d的酸腐病菌制備濃度為1×107個/ml孢子懸浮液，用血球計數(shù)板計數(shù)，備用。夏橙：購于湖北宜昌，采摘后經快遞運輸至實驗室。

碳酸銨、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、蔗糖、吐溫 國藥集團化學制劑有限公司；噻唑藍（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT） 廣州賽國生物科技有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）美國Sigma-Aldricch公司。

馬鈴薯蔗糖瓊脂（potato saccharose agar，PSA）培養(yǎng)基：200 g去皮馬鈴薯切丁加1 L水微波爐加熱20 min，4 層紗布過濾得煮出液，加蔗糖10 g、瓊脂20 g，定容至1 L?；旌暇鶆蚝?21 ℃，高壓蒸汽滅菌鍋滅菌30 min。PS培養(yǎng)液：PSA培養(yǎng)基不加瓊脂。

1.2 儀器與設備

YX-280高壓滅菌鍋 合肥華泰醫(yī)療設備有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；SPX-150BⅢ生化培養(yǎng)箱 北京鑫潤科諾儀器儀表有限公司；EX20顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司；SHZ-82A氣浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市宏華儀器廠；DM3000熒光顯微鏡 德國徠卡公司；DDS-11A電導率儀上海盛磁儀器有限公司；UV-1000紫外分光光度計上海美普達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 碳酸銨對病原菌孢子萌發(fā)及芽管伸長的影響

參考柳麗梅等[15]的方法，取碳酸銨溶液與培養(yǎng)基混勻，使培養(yǎng)基中碳酸銨的質量濃度為一定值，無菌水作為空白對照，將培養(yǎng)基涂于載玻片上，置于空培養(yǎng)皿內，在玻片兩端滴加5×106個/mL孢子懸浮液，合蓋后封口膠封口，置于26 ℃生化培養(yǎng)箱內恒溫培養(yǎng)，8 h后光學顯微鏡下觀察，借助TS-View 6.2.3.2照相機軟件統(tǒng)計孢子萌發(fā)率及芽管伸長長度。實驗重復3 次。按照公式（1）計算萌發(fā)率。

1.3.2 病原菌菌落直徑的測定

參考Yang Shuzhen等[16]的方法并稍作改良，取200 μL酸腐病菌孢子懸浮液均勻涂布于PSA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待長出白色幼嫩菌絲后，7 mm打孔器取菌餅，反貼于含有0、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L碳酸銨的PSA培養(yǎng)基上，封口，置于26 ℃條件下培養(yǎng)，每24 h采用十字交叉法測定病原菌的菌落直徑，實驗設置3 個平行，結果取平均值。

1.3.3 MTT法測定酸腐病菌孢子活力

參考Stockert等[17]的方法，略有修改。按前述方法收集酸腐病菌孢子，去離子水洗滌2 次，加入5 mL含100 μg/mL MTT的PS培養(yǎng)液，于同樣條件下振蕩培養(yǎng)4 h后。1 000×g離心10 min，收集沉淀，2 mL DMSO溶解，振蕩均勻后測定570 nm波長處吸光度，每個質量濃度下3 個平行，結果取平均值。

1.3.4 菌絲呼吸抑制率的測定

參考周潔等[18]采用Clark型氧電極法測定菌絲呼吸速率。將在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h的酸腐病菌菌液1 mL加入到反應杯中，再加入1 mL的碳酸銨溶液，控制其終質量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8 g/L，25 ℃下用氧呼吸儀測定呼吸耗氧速率。探究碳酸銨處理時間對病原菌呼吸的影響，將培養(yǎng)48 h的酸腐病菌進行離心收集，去離子水洗3 次后，20 mL去離子水重懸浮后，加入碳酸銨溶液至終質量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8 g/L，26 ℃處理12、24 h后再次離心，沉淀用去離子水洗后，再次重懸浮，吸取2 mL于反應杯中，按照上述方法測定呼吸速率。實驗重復3 次，取平均值。按公式（2）計算呼吸抑制率。

1.3.5 熒光顯微鏡觀察酸腐病菌菌絲細胞膜完整性

參考Yin Chunxiao等[19]的方法，略有修改。將酸腐病菌孢子懸浮液按1%接種100 mL PS培養(yǎng)液中，于（26±2）℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后，加入碳酸銨溶液至終質量濃度為0.8 g/L，對照組加入等量無菌水，再繼續(xù)培養(yǎng)12、24 h后，離心收集菌絲，在室溫下用10 μg/mL的PI避光染色15 min后，再次離心去上清液，沉淀用磷酸鹽緩沖液洗滌2 次后，于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.6 菌絲胞外電導率的測定

參考Wang Wenjun等[20]測電導率的方法，略有修改。將PS培養(yǎng)液恒溫振蕩培養(yǎng)48 h的酸腐病菌離心收集，去離子水清洗3 次，然后用25 mL去離子水重懸浮，再取5 mL重懸浮液于含碳酸銨的去離子水中，控制碳酸銨的終質量濃度為0.4、0.8 g/L，不含碳酸銨的去離子水為對照，于各時間點測定溶液中的電導率，即處理相對時間電導率。以碳酸銨處理0 h測定的電導率為起始電導率。最后將其煮沸10 min，冷卻后再次測定溶液中的電導率，即殺死電導率。設置3 次重復。根據(jù)公式（3）計算膜相對滲透率。

1.3.7 碳酸銨處理對細胞組分釋放的影響

參考Liu Sha等[21]的方法，略有修改。將恒溫振蕩培養(yǎng)2 d的酸腐病菌絲離心收集，去離子水清洗3 次后，然后用25 mL去離子水重懸浮，再取5 mL重懸浮液于含碳酸銨的去離子水中，控制其終質量濃度為0、0.4、0.8 g/L，于各個時間點取2 mL離心，取上清液，用紫外-可見分光光度計測260 nm和280 nm波長處的吸光度，設置3 個重復，實驗取平均值。

1.3.8 菌絲體內總H2O2含量的測定

參考Sagisaka[22]的方法測定菌絲體內總H2O2含量。將培養(yǎng)24 h的菌絲于100 mL PS培養(yǎng)液中中，加入碳酸銨溶液使培養(yǎng)基終質量濃度為0.8 g/L，對照為等量的無菌水。分別于0、24、48 h時取樣，取1 g菌絲，4 mL磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.5）研磨后，加2.8 mL 5%三氯乙酸，于10 000×g離心10 min。取上清液1.6 mL與0.4 mL 50%三氯乙酸、0.4 mL 10 mmol/L的硫酸亞鐵銨和0.2 mL 2.5 mol/L的硫氰酸鉀混合，于480 nm波長處測定上清液的吸光度。以H2O2作標準曲線，計算菌絲H2O2含量。實驗設置3 個平行，取平均值。

1.3.9 夏橙病斑直徑的測定

參考Zhou Yahan等[23]方法，略有修改。選擇大小、色澤、成熟度一致的健康果實用0.2% NaClO溶液消毒2 min，去離子水沖洗2 次后超凈工作臺中晾干，在果實赤道部位造3 個傷口（0.5 cm×0.5 cm），每個傷口接20 μL不同質量濃度的碳酸銨溶液，以無菌水為對照。4 h后再接種20 μL病原菌孢子懸浮液，孢子濃度為1×106個/mL。將處理果實置于保鮮盒內，并用保鮮袋封口，置于26 ℃培養(yǎng)箱中，相對濕度為90%～95%。每天觀察病斑變化情況并用十字交叉法測定每個病斑直徑。每15 個果實為一組，實驗重復3 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理并作圖，結果以平均值±標準偏差表示。分析用SPSS 21.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，應用最小顯著數(shù)法檢驗差異顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 碳酸銨處理對病原菌孢子萌發(fā)及芽管伸長的影響

圖1 碳酸銨處理對酸腐病菌孢子萌發(fā)及芽管伸長的影響Fig.1 Effect of ammonium carbonate treatment on spore germination and germ tube elongation

如圖1所示，低質量濃度碳酸銨處理對酸腐病菌孢子萌發(fā)率影響較小，在質量濃度達到0.6 g/L時，萌發(fā)率仍然達到88.86%，而在質量濃度0.8 g/L時，病菌孢子萌發(fā)完全受到抑制。在低質量濃度下，碳酸銨處理對芽管伸長有顯著影響，在0.1 g/L時，平均芽管長度為63.95 μm，顯著低于對照88.75 μm；在0.6 g/L時，芽管長度僅為對照的26%。

2.2 碳酸銨處理對病原菌菌絲生長的影響

碳酸銨顯著影響酸腐病菌菌絲生長（圖2），隨培養(yǎng)時間延長，未處理組菌落直徑逐漸增加，第5天達到83.08 mm；0.4 g/L碳酸銨處理組為對照組的56%，0.8 g/L碳酸銨處理培養(yǎng)5 d，菌落直徑沒有增加，表明在該質量濃度條件下菌絲生長完全抑制。

圖2 碳酸銨處理對酸腐病菌菌絲生長的影響Fig.2 Effect of ammonium carbonate treatment on hyphal growth

2.3 碳酸銨處理對病原菌的孢子活力和菌絲呼吸速率的影響

圖3 不同質量濃度的碳酸銨對酸腐病菌孢子活力的影響Fig.3 Effects of different concentrations of ammonium carbonate on spore activity

為了進一步分析碳酸銨的抑菌作用，采用M T T 法評價碳酸銨對酸腐病菌孢子活力的影響。圖3 結果表明，不同質量濃度碳酸銨處理4 h，低質量濃度下對孢子活力并無抑制作用，而0.4 g/L 和0.8 g/L 的碳酸銨處理下，均對孢子活力產生了抑制作用。當碳酸銨的質量濃度為0.8 g/L時，吸光度為0.183±0.012，僅為對照組的38%。這說明病原菌經過一定質量濃度的碳酸銨處理后，它們的孢子活力顯著受到了影響。

圖4 碳酸銨處理對酸腐病菌菌絲呼吸速率的影響Fig.4 Effect of ammonium carbonate treatment on respiration rate of G.citri-aurantii

碳酸銨也影響酸腐病菌的菌絲呼吸作用（圖4），在0.1 g/L質量濃度下，0 h組的呼吸抑制率為15.0%，而質量濃度為0.4、0.8 g/L時，菌絲的呼吸抑制率分別達到了54.6%和66.6%，表明碳酸銨直接抑制了菌絲的呼吸。當0.1 g/L碳酸銨處理菌絲12 h后，對菌絲的呼吸抑制率達到了23.5%，而處理24 h后，呼吸抑制率達到29.8%；而質量濃度為0.8 g/L，作用12 h時，呼吸抑制率為78.8%；作用24 h后達到89.8%，說明隨著碳酸銨處理時間的延長，對菌絲的呼吸影響加劇。

2.4 碳酸銨處理對酸腐病菌細胞膜完整性的影響

圖5 PI染色觀察碳酸銨對酸腐病菌細胞膜完整性的影響Fig.5 Effect of ammonium carbonate treatment on cell membrane integrity observed by PI staining

PI染色酸腐菌菌絲結構完整性表明（圖5），對照菌絲暗場中幾乎沒有紅色熒光，而0.8 g/L碳酸銨處理菌絲12 h后，暗場下有微弱的紅色熒光，而處理24 h后在暗場下表現(xiàn)出了強烈的紅色熒光。這表明隨著碳酸銨的處理時間延長，酸腐病菌菌絲細胞膜完整性受損程度也在增加。

圖6 碳酸銨處理對酸腐病菌菌絲膜滲透性的影響Fig.6 Effect of ammonium carbonate on mycelial cell membrane permeability of G.citri-aurantii

進一步用電導率檢測膜通透性的改變（圖6），結果表明，對照在6 h的相對滲透率維持在10%以下，48 h后相對滲透率為18.81%，碳酸銨處理的前1 h病原菌的膜相對滲透率急劇上升，且與對照相比具有顯著性差異，而后幾乎保持平穩(wěn)至6 h，說明菌絲體內的離子發(fā)生一定程度的泄漏，但仍然維持較強的膜穩(wěn)定性；而處理12、24 h后，膜相對滲透率進一步顯著增大，0.8 g/L碳酸銨處理24 h，相對滲透率增大到45.86%，48 h則達到53.36%。表明病原菌菌絲受碳酸銨處理時間的延長，膜受損更加嚴重。

2.5 碳酸銨處理對大分子細胞組分釋放的影響

圖7 碳酸銨處理對酸腐病菌細胞大分子釋放的影響Fig.7 Effect of ammonium carbonate on the release of intracellular constituents from the mycelia of G.citri-aurantii

A260nm、A280nm分別與胞外核酸、蛋白含量呈正相關。由圖7可知，經過碳酸銨處理的菌絲，其A260nm和A280nm均大于對照組，尤其是從6 h開始，A260nm與A280nm快速升高，說明此時胞內核酸和蛋白開始發(fā)生大規(guī)模的泄漏。當0.8 g/L的碳酸銨處理48 h時，酸腐病菌的A260nm和A280nm分別是對照組的2.3、1.51 倍，顯著高于對照組。表明隨膜損傷加劇，大分子細胞組分迅速丟失，從而嚴重影響了細胞功能。

2.6 碳酸銨處理對菌絲活性氧積累的影響

圖8 碳酸銨處理對酸腐病菌菌絲H2O2積累的影響Fig.8 Effect of ammonium carbonate on hydrogen peroxide accumulation in the mycelia of G.citri-aurantii

對菌絲活性氧積累進一步分析表明（圖8），0.8 g/L碳酸銨處理在24 h內對菌絲H2O2的積累影響不明顯，只有在處理48 h后，處理組為對照組含量的1.54 倍。提示活性氧積累可能不是碳酸銨發(fā)揮抑菌作用的主要途徑。

2.7 碳酸銨處理對人工接種病原菌夏橙果實腐爛的影響

圖9 碳酸銨處理對人工接種酸腐病菌夏橙果實腐爛的影響Fig.9 Effect of ammonium carbonate on lesion size in Valencia oranges inoculated with G.citri-aurantii

采用人工接種的方法研究碳酸銨對夏橙酸腐病的抑制作用（圖9）。結果顯示，接種酸腐病菌后2 d，夏橙果實表現(xiàn)明顯的發(fā)病，菌斑直徑達到9 mm，接種后5 d，菌斑直徑擴大到47 mm；20 g/L碳酸銨處理的果實，菌斑直徑顯著低于對照，而40 g/L碳酸銨處理果實，常溫下貯藏5 d，均未表現(xiàn)發(fā)病，表明該質量濃度條件下碳酸銨處理可有效控制夏橙酸腐病的發(fā)生。

3 討 論

由于缺少控制柑橘酸腐的殺菌劑，研究人員研究了各種替代物質，如揮發(fā)性精油和生防酵母等，盡管有些表現(xiàn)很強的抑菌活性，但過高的成本和嚴格的環(huán)境條件限制了其應用[8-9]。本實驗結果表明，碳酸銨有很強的抑制酸腐病菌作用，在0.8 g/L時可以完全抑制酸腐病菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長（圖1、2），使用濃度與抑制意大利青霉菌濃度相似[15]。有報道表明，碳酸銨對蘋果霉心病的主要病原真菌粉紅單端孢（Trichothecium roseum）和互隔交聯(lián)孢（Alternaria alternata）菌絲生長具有抑制作用，且最小抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）分別為48.14、33.61 mmol/L[24]；碳酸氫銨對葡萄采后灰霉菌（Botrytis cinerea）的MIC為0.25%[25]，優(yōu)于其他碳酸鹽作用，其抑菌濃度與本實驗結果相似。碳酸銨處理還能有效降低番茄采后黑霉病和灰霉病的發(fā)生[26]，碳酸銨與可食性涂膜可控制李子褐腐病[27]。本實驗結果表明，碳酸銨質量濃度在40 g/L時，能完全抑制接種病菌夏橙的酸腐發(fā)生（圖9）。這些結果表明，碳酸銨是一種有潛在應用價值的采后病害的控制方法，值得深入研究。

細胞膜對于維持真菌菌絲活性起關鍵作用[28]，也是多種藥物處理的作用位點。前人研究發(fā)現(xiàn)許多抑菌物質如抗菌肽[29]、有機酸[30]、植物精油[31]、無機物[32]等對植物病原真菌的作用均會導致其細胞膜通透性和完整性受到傷害，從而起到抑菌作用。Lai Tongfei等[33]發(fā)現(xiàn)經過碳酸氫鈉處理的擴展青霉的孢子其質膜受到明顯的破壞，從而達到抑菌效果，這與本研究結果一致。經過碳酸銨處理的病原菌菌絲，其細胞膜相對滲透性發(fā)生了改變，逐步導致離子泄漏，胞內核酸與蛋白釋放到胞外（圖6、7），PI染色結果更進一步證明了病原菌的細胞膜完整性受到了影響（圖5）。活性氧積累是造成細胞膜損傷的原因之一，Shi Xuequn等[34]研究發(fā)現(xiàn)當用20 mmol/L硼酸處理芒果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），會刺激孢子體內活性氧積累，造成線粒體損壞。本實驗結果表明，碳酸銨處理的酸腐病菌菌絲，H2O2積累不十分顯著（圖8），似乎不是導致膜損傷的主要因素。進一步檢測菌絲的呼吸，發(fā)現(xiàn)碳酸銨處理對酸腐病菌菌絲呼吸有直接抑制作用（圖4），與枯草芽孢桿菌代謝物抑制酸腐病菌菌絲的呼吸有較大的差異[35]，暗示兩類物質間的作用方式有差異。推測是由于碳酸銨的加入改變了菌絲的pH值等離子環(huán)境，直接抑制呼吸，從而導致細胞維系功能的能量供應不足，進而逐步引發(fā)了膜通透性的改變和活性氧代謝的紊亂。孫莉等[36]對碳酸氫銨抑制尖孢鐮刀菌生長機制進行研究，發(fā)現(xiàn)碳酸氫銨對尖孢鐮刀菌的抑制作用與pH值有關，但不完全取決于pH值。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，碳酸銨對意大利青霉并無明顯的抑制作用[16]。至于碳酸銨對酸腐菌的抑制機制是否與提高pH值有關，及其深層次的作用機制，還有待進一步探究。

綜上，碳酸銨對柑橘酸腐病菌的孢子萌發(fā)及菌絲生長具有較強的抑制作用；其通過抑制菌絲呼吸、孢子活性影響膜完整性和滲透性，干擾菌絲代謝，從而達到抑菌效果。碳酸銨有望進一步開發(fā)為防治柑橘酸腐病的方法。