3 種富含多糖面包的體外消化酵解特性

柳芳偉，張珊珊，陳蘇明，聶少平，胡婕倫，謝明勇

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)-加拿大食品科學(xué)與技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室（南昌），江西 南昌 330047）

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝紊亂疾病[1]。目前糖尿病的治療主要依靠藥物，但藥物治療費(fèi)用高、副作用大，為此有報(bào)道提出可以通過飲食干預(yù)[2-3]，即讓糖尿病患者食用具有低血糖指數(shù)的食物，從而使得糖尿病患者在食用該類食物后血糖波動(dòng)小，長(zhǎng)此以往使病情得到改善。

膳食多糖是指來源于天然食物（如植物、真菌、藻類等）的多糖[4]。它們通常不能被人體的胃腸道酶分解，而是在人體的大腸內(nèi)被細(xì)菌利用，酵解產(chǎn)生短鏈脂肪酸，從而降低腸道pH值，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[5]。本實(shí)驗(yàn)基于本課題組前期對(duì)多糖結(jié)構(gòu)及活性的研究，選擇魔芋、瓜爾膠、燕麥β-葡聚糖3 種多糖作為研究對(duì)象。此外，有研究表明，食用這3 種多糖可以增強(qiáng)飽腹感進(jìn)而減少食量，非常符合糖尿病患者“少食多餐”的飲食原則[6-8]。為降低面包中快消化淀粉（rapid digestion starch，RDS）含量，本實(shí)驗(yàn)選用了一些營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高且對(duì)餐后血糖水平影響較小的食物，如紫薯、黃豆、薏苡仁，將其作為夾心包裹在面皮中，做成夾心面包。其中紫薯直鏈淀粉含量高于其他薯類，直鏈淀粉含量越高越容易老化回生形成抗性淀粉[9]。而黃豆中膳食纖維具有促進(jìn)消化、調(diào)節(jié)胰島素水平等功能[10]。薏苡仁則具有降血糖、抗腫瘤、清除自由基等功效。

食物血糖生成指數(shù)（glycemic index，GI）反映的是食物對(duì)餐后血糖升降的影響。通常將白面包定為標(biāo)準(zhǔn)食物，其GI定為100，根據(jù)GI的不同可以將食物分為：高GI食物（GI＞70）、中GI食物（55＜GI＜70）和低GI食物（GI＜55）[11-12]。GI越高，食物對(duì)餐后血糖的影響越大，不適合糖尿病患者食用。食物血糖負(fù)荷（glycemic load，GL）體現(xiàn)的是碳水化合物的量對(duì)血糖的影響[13-14]。采用GL與GI結(jié)合評(píng)價(jià)食物可反映一定量的食物中可利用碳水化合物引起的血糖應(yīng)答[15]，更為科學(xué)合理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魔芋精粉 湖北強(qiáng)森魔芋科技有限公司；瓜爾膠香港嘉森有限公司；燕麥β-葡聚糖 張家口一康生物科技有限公司；胃蛋白酶、胰酶、膽鹽 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；淀粉葡萄糖苷酶、葡萄糖測(cè)定試劑盒、淀粉總量檢測(cè)試劑盒、可利用碳水化合物和膳食纖維測(cè)定試劑盒愛爾蘭Megazyme公司；氯化血紅素 上海阿拉丁有限公司；VK1、刃天青 北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨 美國(guó)BD Difco公司；酵母浸膏 英國(guó)Oxoid公司；其他無機(jī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Varioskan Flash全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀、超凈工作臺(tái)美國(guó)Thermo公司；FE-28臺(tái)式pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司；厭氧手套箱 美國(guó)COY公司；FreeZone冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司；DSH-10A快速水分測(cè)定儀 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 面包的制備

含膳食多糖的面包：稱取100 g按質(zhì)量比22∶1混合的高筋面粉和膳食多糖，加入60 g水、1 g酵母、1.8 g鹽和0.01 g抗壞血酸，混合制成面團(tuán)，將一定質(zhì)量的面團(tuán)用搟面杖輥壓成面皮，在面皮上加入煮熟的紫薯、黃豆和薏苡仁，做成夾心面包。將面包置于發(fā)酵箱中發(fā)酵90 min（溫度37 ℃、相對(duì)濕度75%），轉(zhuǎn)移至烤箱，烘烤35 min（上、下底溫180 ℃）后取出，冷卻、包裝。

不含多糖的面包（對(duì)照面包）：將多糖面包中的膳食多糖換成等質(zhì)量的高筋面粉，其他成分均不變。

白面包：在100 g高筋面粉中加入60 g水、1 g酵母、1.8 g鹽和0.01 g抗壞血酸，混合制成面團(tuán)，將面團(tuán)切分成小塊后揉成圓形，置于發(fā)酵箱中發(fā)酵90 min（溫度37 ℃、相對(duì)濕度75%），轉(zhuǎn)移至烤箱，烘烤35 min（上、下底溫180 ℃）后取出，冷卻、包裝[16]。

1.3.2 產(chǎn)品基本理化性質(zhì)測(cè)定

采用快速水分測(cè)定儀測(cè)定水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)；采用淀粉總量檢測(cè)試劑盒測(cè)定總淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)；采用可利用碳水化合物和膳食纖維測(cè)定試劑盒測(cè)定可利用碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 膳食面包的體外模擬消化

1.3.3.1 模擬消化用的電解質(zhì)溶液配制

根據(jù)Minekus等提出的靜態(tài)體外消化方法對(duì)面包進(jìn)行體外消化[17]。消化液中鹽的濃度如下：模擬唾液：15.1 mmol/L KCl、3.7 mmol/L KH2PO4、13.6 mmol/L NaHCO3、0.15 mmol/L MgCl2·(H2O)6、0.06 mmol/L (NH4)2CO3；模擬胃液：6.9 mmol/L KCl、0.9 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3、47.2 mmol/L NaCl、0.1 mmol/L MgCl2·(H2O)6、0.5 mmol/L (NH4)2CO3；模擬腸液：6.8 mmol/L KCl、0.8 mmol/L KH2PO4、85 mmol/L NaHCO3、38.4 mmol/L NaCl、0.33 mmol/L MgCl2·(H2O)6。

1.3.3.2 膳食面包的體外消化模型

模擬口腔消化：將5 g絞碎的面包與5 mL模擬唾液（含有750 U的α-淀粉酶和7.5 μmol的CaCl2）混合，混合體系pH值為7，放入37 ℃的恒溫?fù)u床中振蕩2 min；模擬胃消化：將口腔消化后的樣品與10 mL模擬腸液（含有4 000 U的胃蛋白酶和1.5 μmol的CaCl2）混合，用1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0后將樣品置于37 ℃的恒溫?fù)u床中孵育2 h；模擬小腸消化：將胃消化后的樣品與20 mL模擬腸液（含有4 000 U的胰酶、0.4 mmol的膽汁和12 μmol的CaCl2）混合，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0后置于37 ℃條件下恒溫振蕩3 h。在小腸消化過程中，分別于20、30、60、90、120、180 min時(shí)，取500 μL消化液于2 mL離心管中，并立即在99.9 ℃下高溫滅酶5 min[18]，5 000 r/min離心5 min，取上清液。每個(gè)產(chǎn)品一式三份進(jìn)行體外消化。

1.3.3.3 淀粉水解率的測(cè)定

取100 μL消化上清液，加入1 mL醋酸鈉緩沖溶液（0.4 mol/L、pH 4.75）和30 μL淀粉葡萄糖苷酶溶液，在60 ℃條件下水浴45 min[19-20]，5 000 r/min離心5 min。取25 μL反應(yīng)后上清液，加入750 μL葡萄糖氧化酶溶液，在50 ℃條件下水浴20 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算葡萄糖質(zhì)量。將葡萄糖質(zhì)量換算成淀粉質(zhì)量，再利用淀粉總量檢測(cè)試劑盒測(cè)定總淀粉質(zhì)量，并通過式（1）計(jì)算淀粉水解率。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，淀粉水解率為縱坐標(biāo)，繪制淀粉消化曲線[21]。

式中：mGt表示取樣時(shí)間點(diǎn)消化液中葡萄糖質(zhì)量/mg；0.9表示由葡萄糖換算為淀粉的系數(shù)；mTS表示樣品中總淀粉質(zhì)量/mg。

1.3.3.4 快消化淀粉、慢消化淀粉、抗消化淀粉相對(duì)含量的計(jì)算

根據(jù)淀粉的消化速率可將淀粉分為：RDS，即在20 min內(nèi)消化的淀粉；慢消化淀粉（slowly digestible starch，SDS），即在20～180 min內(nèi)消化的淀粉；抗消化淀粉（resistant starch，RS），即超過180 min不消化的淀粉[22-23]。根據(jù)公式（2）～（4）分別計(jì)算各樣品中RDS、SDS和RS的相對(duì)含量。

式中：m20為水解20 min后產(chǎn)生的葡萄糖質(zhì)量/mg；mFG為未水解時(shí)淀粉中的游離葡萄糖質(zhì)量/mg；m180為水解180 min后產(chǎn)生的葡萄糖質(zhì)量/mg；0.9為葡萄糖換算成淀粉的系數(shù)；mTS為樣品中總淀粉質(zhì)量/mg。

1.3.3.5 估計(jì)血糖生成指數(shù)和估計(jì)血糖負(fù)荷的測(cè)定

估計(jì)血糖生成指數(shù)（estimate glycemic index，eGI）參考Akerberg[24]和Lau[25]等的方法計(jì)算，公式如式（5）所示。

式中：HI為水解指數(shù)/%，是指被測(cè)食物體外水解曲線下面積與等量標(biāo)準(zhǔn)食物（白面包）體外水解曲線下面積之比。

估計(jì)血糖負(fù)荷（estimate glycemic load，eGL）是指該食物的eGI與攝入該食物的實(shí)際可利用碳水化合物質(zhì)量的乘積（本研究中攝入該食物的質(zhì)量按50 g計(jì)算），計(jì)算公式[26]如式（6）所示。

1.3.4 膳食面包的體外模擬酵解

1.3.4.1 糞便接種物的制備

新鮮糞便樣本取自糖尿病患者和健康受試者各10 名，其均有良好的飲食習(xí)慣，至少3 個(gè)月以上未服用過抗生素，并且均未出現(xiàn)過腸道疾病。將取好的糞便立即轉(zhuǎn)移至厭氧手套箱，用磷酸鹽緩沖液按固液比1∶4稀釋，漩渦混勻，500×g離心5 min，上清液通過3 層無菌紗布，得到糞便濾液。

1.3.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

每1 L酵解培養(yǎng)基中含有3 g細(xì)菌蛋白胨、3 g酵母浸膏、0.1 g NaCl、40 mg K2HPO4、40 mg KH2PO4、10 mg MgSO4·(H2O)7、10 mg CaCl2·(H2O)6、2 g NaHCO3、1 gL-鹽酸半胱氨酸、0.5 g膽鹽、20 μL VK1、2 mL Tween-80、0.02 g氯化血紅素、1 mL混合維生素、5 g消化凍干樣品（將消化后的樣品倒入透析袋，透析26 h后凍干[27]）或菊粉，調(diào)節(jié)pH值至7.0左右，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min[28]。

1.3.4.3 酵解

在厭氧環(huán)境（5% H2、5% CO2、90% N2）下，將糞便接種物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，漩渦混勻，使每根Hungate厭氧管中均含有體積分?jǐn)?shù)1%的糞便提取液。加塞、封蓋，置于37 ℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)，在0、6、12、24、48 h 5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取出相應(yīng)的厭氧管，酵解液混勻后分裝到小管中，于-80 ℃下凍存，用于后續(xù)指標(biāo)測(cè)定。以菊粉和蒸餾水分別作為陽性、陰性對(duì)照，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)、每個(gè)平行設(shè)置單獨(dú)的厭氧管[29]。

1.3.4.4 pH值的測(cè)定

取不同時(shí)間點(diǎn)的酵解液1 mL于10 mL的離心管中，用FE-28臺(tái)式pH計(jì)測(cè)定酵解液的pH值。

1.3.4.5 糖酵解過程中糖消耗情況分析

參考張冠亞的方法測(cè)定糖質(zhì)量濃度[30]。在試管中加入490 μL蒸餾水、10 μL酵解液、500 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的苯酚和2 mL濃硫酸，30 min后于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。配制0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液并稀釋成6 個(gè)不同質(zhì)量濃度梯度，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。糖消耗率按式（7）計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用Tukey HSD法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPad Prism 7.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 面包的主要成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)

表1 面包的主要成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Contents of major components in breads

面包主要成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果如表1所示，含多糖面包總淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在50%～60%之間，可利用碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在67%～73%之間，均較白面包中總淀粉和可利用碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)低。

2.2 面包的淀粉水解率

圖1 面包在消化過程中的淀粉水解曲線Fig.1 Starch hydrolysis curves during bread digestion

采用體外實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)面包進(jìn)行消化模擬，其淀粉水解率分析結(jié)果如圖1所示，各面包在0～20 min時(shí)淀粉水解速率急劇上升，在20 min后，淀粉的水解速率基本趨于平衡。且在小腸消化180 min時(shí)，白面包的水解率為96.24%，不含多糖面包的水解率為52.62%，3 種多糖面包的淀粉水解率在49%～52%之間，其中含瓜爾膠面包（51.62%）＞含燕麥β-葡聚糖面包（50.35%）＞含魔芋面包（49.86%）。3 種多糖面包的淀粉水解率較小，可能與淀粉的晶體結(jié)構(gòu)改變和黏度變化有關(guān)。Zheng Mingjing等將添加了瓜爾膠的蓮子淀粉與不添加瓜爾膠的蓮子淀粉進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)添加了瓜爾膠的蓮子淀粉具有更低的淀粉水解率，并解釋可能是由于瓜爾膠改變了淀粉的結(jié)構(gòu)和黏度，從而推遲了淀粉的體外消化[31]。

2.3 面包中RDS、SDS、RS相對(duì)含量比較

圖2 面包的淀粉組分及相對(duì)含量Fig.2 Starch composition of breads

面包中RDS、SDS、RS相對(duì)含量如圖2所示，3 種多糖面包的RDS、SDS、RS相對(duì)含量分別為45%～53%、2%～7%、45%～49%。其中含魔芋面包、含燕麥β-葡聚糖面包和含瓜爾膠面包的RS相對(duì)含量分別為50.14%、49.65%、48.38%。白面包和不含多糖面包的RS相對(duì)含量分別為3.76%和47.38%。白面包的RDS相對(duì)含量明顯高于其他幾款面包，這可能是由于白面包的多孔結(jié)構(gòu)使得與酶大面積接觸從而使淀粉快速水解。除白面包外其他幾款面包呈現(xiàn)高RS相對(duì)含量的現(xiàn)象，這可能是由于脂質(zhì)的存在，阻止了淀粉的糊化[32]。

2.4 面包的eGI和eGL

表2 面包的eGI和eGLTable 2 eGI and eGL values of breads

有的食物雖然GI很高，但食物中攝入的可利用碳水化合物含量低，會(huì)導(dǎo)致其GL相對(duì)較低。因此通過結(jié)合GI和GL來選擇食物，這樣既考慮到食用后對(duì)血糖變化影響，又照顧到食用量對(duì)血糖負(fù)荷的影響[33]。

面包的eGI和eGL如表2所示。不含多糖面包的eGI為53.24，含魔芋面包、含瓜爾膠面包和含燕麥β-葡聚糖面包的eGI分別為52.41、52.84、52.71，均小于55，屬于低GI食物。本實(shí)驗(yàn)中以攝入食物50 g計(jì)算，得到不含多糖面包、含魔芋面包、含瓜爾膠面包、含燕麥β-葡聚糖面包的eGL分別為9.79、9.16、9.00、8.76，不含多糖面包的eGL顯著高于3 種多糖面包的eGL（P＜0.05）。一般認(rèn)為GL＜10為低血糖負(fù)荷食物，10≤GL≤19為中血糖負(fù)荷食物，GL≥20為高血糖負(fù)荷食物[34]。因此，3 種多糖面包在攝入50 g時(shí)屬于低血糖負(fù)荷食物，對(duì)血糖影響較小。這可能歸因于3 種多糖面包具有低可利用碳水化合物和高抗性淀粉含量的特性，使得它們?cè)谖改c消化中水解產(chǎn)生的葡萄糖含量較少。

2.5 酵解過程中的pH值變化情況

圖3 面包消化后產(chǎn)物在正常受試者糞便中酵解的pH值變化情況Fig.3 pH change of the digested products of breads during fermentation by fecal bacteria from normal people

圖4 面包消化后產(chǎn)物在糖尿病患者糞便中酵解的pH值變化情況Fig.4 pH change of the digested products of breads during fermentation by fecal bacteria from diabetic patients

在酵解實(shí)驗(yàn)中pH值的變化情況在一定程度上可以反映酵解體系中碳水化合物的消耗程度和短鏈脂肪酸的產(chǎn)生情況。如圖3所示，3 種多糖面包在正常受試者糞便中酵解至24 h時(shí)pH值均顯著下降，其中含燕麥β-葡聚糖面包降幅最大，在24～48 h間，pH值的降幅趨于平緩。如圖4所示，3 種多糖面包在糖尿病患者糞便中酵解至12 h時(shí)pH值均明顯下降，3 種多糖面包的降幅相近，在酵解12 h后，降幅趨于平緩甚至稍有上升，這可能與有機(jī)酸的消耗有關(guān)[35]。在48 h的酵解過程中，含魔芋面包、含瓜爾膠面包、含燕麥β-葡聚糖面包在用正常受試者糞便酵解時(shí)，pH值分別下降了2.51±0.08、2.56±0.02、2.59±0.06，在用糖尿病患者糞便酵解時(shí)，pH值分別下降了2.29±0.02、2.28±0.02、2.24±0.03。由此可知，面包在正常受試者糞便中酵解的pH值下降量高于在糖尿病患者糞便中酵解的pH值下降量。這可能是由于正常受試者糞便中菌群比糖尿病患者糞便中的菌群具有更高的豐富度和多樣性，使得產(chǎn)生的有機(jī)酸含量更高。

2.6 酵解過程中糖消耗情況

圖5 面包消化后產(chǎn)物在正常受試者糞便中酵解的糖消耗情況Fig.5 Sugar consumption of the digested products of breads during fermentation by fecal bacteria from normal people

圖6 面包消化后產(chǎn)物在糖尿病患者糞便中酵解的糖消耗情況Fig.6 Sugar consumption of the digested products of breads during fermentation by fecal bacteria from diabetic patients

在酵解體系中，腸道菌群會(huì)將高分子碳水化合物降解成小分子化合物供自身生長(zhǎng)，且碳水化合物的被酵解程度絕大部分取決于它本身的性質(zhì)。因此，糖含量不僅可以反映腸道菌群利用碳水化合物的情況，而且可以反映該碳水化合物是否易被腸道菌群利用[36]。如圖5所示，3 種多糖面包在用正常受試者糞便酵解的過程中，糖消耗率分別為：含魔芋面包（80.00±1.10）%、含瓜爾膠面包（81.22±2.53）%、含燕麥β-葡聚糖面包（72.79±1.97）%，菊粉的糖消耗率為（63.46±0.59）%。如圖6所示，3 種多糖面包在用糖尿病患者糞便酵解的過程中，糖消耗率分別為：含魔芋面包（78.36±0.63）%、含瓜爾膠面包（72.59±0.94）%、含燕麥β-葡聚糖面包（81.88±0.46）%，菊粉的糖消耗率為（56.47±1.12）%。不論是在正常受試者糞便中酵解還是在糖尿病患者糞便中酵解，3 種多糖面包的糖消耗率均明顯高于菊粉，可以認(rèn)為，3 種多糖面包消化后產(chǎn)物可以很好地被糞便中腸道菌群利用。除了含燕麥β-葡聚糖面包之外，另外兩種多糖面包和菊粉在用糖尿病患者糞便酵解過程中糖消耗率比在用正常受試者糞便酵解過程中糖消耗率有所降低，對(duì)比酵解過程中pH值的變化情況來看，這可能也與糞便中的菌群豐富度有關(guān)[37]。

3 結(jié) 論

本研究中以高筋面粉、黃豆、薏仁、紫薯為主要原料并添加一定量的膳食多糖制作成富含多糖的面包，通過分析基本指標(biāo)并進(jìn)行體外模擬胃腸消化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，這3 種多糖面包具有低可利用糖類、高抗性淀粉等特點(diǎn)，屬于低GI食物，當(dāng)以食物質(zhì)量為50 g計(jì)算時(shí)，3 種多糖面包的eGL顯著低于不含多糖面包（P＜0.05），且均為低血糖負(fù)荷食物。此外，通過將3 種多糖面包的消化后產(chǎn)物分別用正常受試者糞便和糖尿病患者糞便進(jìn)行體外模擬大腸酵解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未被消化的碳水化合物在正常受試者和糖尿病患者腸道菌群的作用下均可被大量利用，供腸道菌群生長(zhǎng)。說明這3 種面包在一定食用量范圍內(nèi)對(duì)血糖的影響較小且不消化糖類被菌群的利用率高，適合控糖人群食用。