三種不同乳酸菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、抗病力及腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響?

李佳徽，王明陽(yáng)，田相利,2??，劉龍鎮(zhèn)，李海東，李 麗，2，董雙林，2，薛 玲

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003； 2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237；3.青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司，山東 青島 266408)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)又稱南美白對(duì)蝦，原產(chǎn)于中、南美洲太平洋沿岸的溫暖水域，20世紀(jì)70年代初厄瓜多爾正式養(yǎng)殖并獲得成功。由于其具有生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)性強(qiáng)、對(duì)餌料要求低、出肉率高且肉味鮮美[1]等特點(diǎn)而深受世界各國(guó)蝦類養(yǎng)殖行業(yè)和水產(chǎn)品市場(chǎng)歡迎，甚至在世界范圍掀起養(yǎng)殖該品種的熱潮。凡納濱對(duì)蝦與斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)、中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)并稱為世界三大對(duì)蝦養(yǎng)殖品種，于1988年引進(jìn)我國(guó)，在育種和養(yǎng)殖技術(shù)突破后，其養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴(kuò)大[2]。

近年來(lái)，由于高密度集約化養(yǎng)殖模式的迅速發(fā)展，對(duì)經(jīng)濟(jì)效益的過(guò)分追求，養(yǎng)殖水體內(nèi)殘餌、糞便大量積累并在微生物的作用下分解產(chǎn)生了大量氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫等對(duì)凡納濱對(duì)蝦產(chǎn)生脅迫或毒害作用的物質(zhì)，造成蝦體機(jī)能下降，種質(zhì)退化，對(duì)環(huán)境和疾病的抵抗力嚴(yán)重降低，病害頻發(fā)。在病害的防治過(guò)程中，抗生素和其他化學(xué)類藥物被大量應(yīng)用，長(zhǎng)此以往，細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生了耐藥性，治療效果大打折扣。此外，藥物殘留和養(yǎng)殖廢水的大量排放對(duì)周圍生態(tài)環(huán)境和人類健康也產(chǎn)生了巨大的危害，引發(fā)了生態(tài)環(huán)境和食品安全等其他方面的問(wèn)題。因此，尋找抗生素的替代品刻不容緩，而以益生菌為代表的微生態(tài)制劑因天然、無(wú)污染、無(wú)殘留等特點(diǎn)[3]，在水產(chǎn)養(yǎng)殖的應(yīng)用方面具有很好的前景。

益生菌是一類能夠產(chǎn)生促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)、提高其免疫力、改善水質(zhì)和其他有益作用的活性微生物的統(tǒng)稱[4]。作為水質(zhì)改良劑使用能夠清除池底污泥中硫化氫、氨氮等大量對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)生毒害作用的有害物質(zhì)，達(dá)到改善水質(zhì)，修復(fù)水體，為養(yǎng)殖動(dòng)物提供一個(gè)清潔、舒適、無(wú)脅迫的生長(zhǎng)環(huán)境的目的。作為飼料添加劑使用，能夠通過(guò)產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)性物質(zhì)、消化酶、有機(jī)酸、細(xì)菌素等參與到宿主的新陳代謝，定植于腸道粘膜上與其他菌群形成生物屏障等途徑來(lái)改善腸道的生理功能，既可以促進(jìn)和維持正常微生物菌群，又能夠抑制或殺死病原菌，調(diào)節(jié)并維持宿主腸道微生態(tài)平衡，提高養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)性能的同時(shí)增強(qiáng)其抗病能力[5-6]。其次，不會(huì)產(chǎn)生抗生素的耐藥性和藥物殘留等問(wèn)題，非常適于運(yùn)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖的生產(chǎn)實(shí)踐當(dāng)中。

本研究以凡納濱對(duì)蝦為養(yǎng)殖對(duì)象，對(duì)比研究了3種不同特性的乳酸菌對(duì)其幼蝦生長(zhǎng)、副溶血弧菌抗病力以及腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，旨在為這3種乳酸菌在凡納濱對(duì)蝦的養(yǎng)殖生產(chǎn)活動(dòng)中的實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

本研究所用的3種乳酸菌菌株分別為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis，編號(hào)：LYB1)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilu，編號(hào)：W2)和凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans，編號(hào)：NJ17)，三種菌株均來(lái)自中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)研究室的菌種庫(kù)。各菌株經(jīng)發(fā)酵后將其菌液制成干粉制劑以備用。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus，編號(hào)：20160303005-1)由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所提供。

1.2 飼料制備

本實(shí)驗(yàn)選用廣東粵海有限公司(廣東，湛江)凡納濱對(duì)蝦商品配合飼料(2號(hào)料)作為基礎(chǔ)飼料[7]，在此基礎(chǔ)上按照一定比例添加3株不同種類的乳酸菌干粉(分別標(biāo)記為FCQ、RSJ和NJ)，飼料中益生菌的添加濃度均為1.0×1010cfu/kg，混合均勻后再用魚油(8.4 mL/kg)和褐藻酸鈉(6.3 g/kg)粘合。避光揉搓陰干后，4 ℃環(huán)境下低溫保存?zhèn)溆?。?duì)照組飼料(標(biāo)記為JC)由一定比例的凡納濱對(duì)蝦配合飼料表面直接用魚油(8.4 mL/kg)和褐藻酸鈉(6.3 g/kg)粘合制成。

1.3 對(duì)蝦及其養(yǎng)殖管理

實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦購(gòu)于青島市寶榮水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)，購(gòu)買后于30 cm×40 cm×50 cm的玻璃鋼水族箱中暫養(yǎng)10 d，水族箱的水量為50 L。暫養(yǎng)期間，每天升高2個(gè)鹽度，鹽度由初始的21最終馴化至30。每天投喂凡納濱對(duì)蝦基礎(chǔ)飼料，暫養(yǎng)結(jié)束后禁食24 h，選取健康活潑、個(gè)體均勻的凡納濱對(duì)蝦((3.72±0.06) g)隨機(jī)分成4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組5個(gè)重復(fù)，各10尾對(duì)蝦。在42 d的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)，每日早晚投喂2次飼料，日投喂量約為對(duì)蝦體重的4%～5%，在投喂前吸出殘餌和糞便，并于60 ℃下烘干保存。每日換水1次，換水量約為33%～66%。養(yǎng)殖平均水溫為25 ℃左右，pH=8.0±0.1，連續(xù)微量充氣，溶氧保持在5 mg/L以上。

1.4 樣品采集與處理

1.4.1 生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，統(tǒng)計(jì)4組實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦的放養(yǎng)數(shù)量與初始體重。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)各組對(duì)蝦成活尾數(shù)與末體重。在養(yǎng)殖過(guò)程中，記錄4組實(shí)驗(yàn)的投餌量、殘餌量與糞便量，各生長(zhǎng)指標(biāo)計(jì)算公式[7]如下：

成活率(%)=(實(shí)驗(yàn)后對(duì)蝦數(shù)量/實(shí)驗(yàn)前放養(yǎng)數(shù)量)×100%；

特定生長(zhǎng)率(SGR，%)=[(lnW末-lnW初)/t]×100%；

飼料效率(FER，%)=(W末-W初)/Wf×100%；

表觀消化率(ADR，%)=(Cw-Fw)/Cw×100%。

式中：W初為初體重(g)；W末為末體重(g)；t為養(yǎng)殖天數(shù)(d)；Wf為飼料量；Cw為以重量表示的對(duì)蝦的攝食量；Fw為糞便質(zhì)量。

1.4.2 對(duì)蝦腸道樣品的采集與處理 對(duì)蝦養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，每組隨機(jī)選取30尾對(duì)蝦稱量并記錄其體重，采集其腸道。首先以70%的酒精擦拭蝦體，然后用滅菌的醫(yī)用解剖剪在冰袋上解剖蝦體，取出腸道，放入1.5 mL的離心管中，-80 ℃保存，全程無(wú)菌操作。

1.4.3 蝦腸道樣品總DNA的提取與PCR擴(kuò)增 采用CTAB-SDS法[8]提取凡納濱對(duì)蝦腸道細(xì)菌基因組總DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度和濃度。將檢測(cè)合格后的DNA樣品送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所選區(qū)域?yàn)閂3～V4區(qū)，擴(kuò)增引物為341F(CCTAYGGGRBGCASCAG)和806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT)。用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行目標(biāo)條帶的切割，回收產(chǎn)物。借助Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library試劑盒[9]構(gòu)建文庫(kù)，經(jīng)Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)，結(jié)果合格后，借助Thermofisher的Life Ion S5TM或Ion S5TMXL對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，測(cè)序后優(yōu)化有效序列，生成操作分類單元(OTU)，聚類相似性定位97%。使用SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行OTU物種鑒定比對(duì)，可信度閾值設(shè)定為80%。

1.4.4 攻毒實(shí)驗(yàn) 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，于第三天以副溶血弧菌對(duì)對(duì)蝦進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。從4個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別隨機(jī)抽取15尾對(duì)蝦，分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5尾蝦。菌株的培養(yǎng)與活化均在胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)中進(jìn)行，28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)18～24 h，計(jì)算有效活菌數(shù)后，在10 000 r/min離心10 min收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水漂洗3次，再用無(wú)菌生理鹽水制成梯度菌懸液。正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定合適的注射濃度(1.0×106cfu/mL)和注射體積(25 μL)，注射部位為對(duì)蝦第二腹節(jié)與第三腹節(jié)之間肌肉，對(duì)照組注射同等劑量的無(wú)菌生理鹽水。攻毒實(shí)驗(yàn)持續(xù)14 d，養(yǎng)殖條件不變，記錄對(duì)蝦的存活情況。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

采用SPSS Statistics 17軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05作為差異顯著水平。當(dāng)P<0.05時(shí)用Duncan’s多重比較檢驗(yàn)不同處理之間的差異顯著性，最終統(tǒng)計(jì)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±S.E.)[10]。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)蝦生長(zhǎng)指標(biāo)

飼料中添加不同乳酸菌投喂后，對(duì)蝦的成活率與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05，見(jiàn)表1)。但對(duì)蝦的末體重與特定生長(zhǎng)率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中凝結(jié)芽孢桿菌組對(duì)蝦最高(P<0.05)。飼料中添加不同種類的乳酸菌不僅能夠促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)，還可以提高其飼料效率和表觀消化率(P<0.05)，其中凝結(jié)芽孢桿菌組對(duì)蝦表觀消化率顯著高于其他兩組，飼料效率顯著高于糞腸球菌組。

表1 凡納濱對(duì)蝦的成活率、生長(zhǎng)率、飼料效率和表觀消化率

2.2 對(duì)蝦腸道細(xì)菌組成分析

表2為各實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦腸道微生物組高通量測(cè)序結(jié)果，共獲得約27 000條以上序列。以相似性水平為97%為閾值，將序列聚類成為OTUs。圖1為基于OTUs(即物種數(shù)量)的韋恩圖，顯示了各實(shí)驗(yàn)組之間共有和特有的OTUs情況。4個(gè)組共有271個(gè)OTUs，其中，糞腸球菌組、嗜酸乳桿菌組和凝結(jié)芽孢桿菌組特有的OTUs分別為39、77和47個(gè)，對(duì)照組有32個(gè)特有OTUs。

表2 對(duì)蝦腸道菌群樣品的測(cè)序結(jié)果及OTU分類情況

(FCQ、RSJ和NJ分別表示添加濃度為1.0×1010 cfu/kg的糞腸球菌、嗜酸乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)組，JC為不添加任何益生菌的對(duì)照組。下圖同。FCQ, RSJ and NJ are experimental groups fed with same doses of E. faecalis, L. acidophilus and B. coagulans, i.e., 1.0×1010 cfu/kg feed，and JC is the control group without any probiotics. The same as bellows.)

2.3 對(duì)蝦腸道菌群多樣性分析

表3為不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦腸道菌群的α多樣性指數(shù)。由表3可以看出，添加乳酸菌的實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦腸道菌群Ace、Chao1與 Shannon指數(shù)盡管高于對(duì)照組，但統(tǒng)計(jì)上差異不顯著(P>0.05)?；赪eighted Unifrac 距離的PCoA分析表明，4組菌群結(jié)構(gòu)組成均明顯分異。與對(duì)照組相比，糞腸菌組組內(nèi)樣品之間更加緊湊，嗜酸乳桿菌組和凝結(jié)芽孢桿菌組內(nèi)的樣品之間變得更加離散；實(shí)驗(yàn)組樣品與對(duì)照組樣品相對(duì)距離都較遠(yuǎn)，差別均較大，表明這3個(gè)實(shí)驗(yàn)組菌群結(jié)構(gòu)組成與對(duì)照組相比都發(fā)生了明顯變化(見(jiàn)圖2)。

圖3顯示了實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照對(duì)蝦腸道菌群在門(Phylum)分類水平上的相對(duì)豐度?？梢钥闯?，各實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦腸道菌群均以變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為優(yōu)勢(shì)菌群。比較可見(jiàn)，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組腸道中變形菌門較對(duì)照組均有所增加，以糞腸球菌組增加最為明顯。而厚壁菌門相對(duì)豐度則較對(duì)照組有所減少，以糞腸球菌組減少最為明顯。凝結(jié)芽孢桿菌組擬桿菌門相對(duì)豐度有所增加，其他兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組擬桿菌門相對(duì)豐度較對(duì)照組均有所減少。

表3 凡納濱對(duì)蝦腸道菌群多樣性比較

圖2 基于Weighted Unifrac距離的凡納濱對(duì)蝦腸道菌群PCoA分析

圖3 凡納濱對(duì)蝦腸道菌群在門分類水平上的相對(duì)豐度

圖4為各實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦腸道菌群在綱(Class)分類水平上的相對(duì)豐度分析結(jié)果?？梢钥闯?，α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia)和黃桿菌綱(Flavobacteriia)為對(duì)蝦腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群，其中，α-變形菌綱為第一優(yōu)勢(shì)菌群，丹毒絲菌綱為第二優(yōu)勢(shì)菌群。投喂乳酸菌后，各實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦腸道菌群豐度變化明顯。各實(shí)驗(yàn)組α-變形菌綱豐度與對(duì)照組相比均有所上升，而丹毒絲菌綱則均大幅下降。相對(duì)于對(duì)照組，糞腸球菌組、嗜酸乳桿菌組中黃桿菌綱豐度有所下降，凝結(jié)芽孢桿菌組則基本保持不變。此外，相對(duì)于對(duì)照組，糞腸球菌提高了對(duì)蝦腸道內(nèi)疣微菌綱、擬桿菌綱、噬纖維菌綱和芽孢桿菌綱細(xì)菌的豐度，嗜酸乳桿菌增加了柔膜菌綱、擬桿菌綱細(xì)菌和芽孢桿菌綱細(xì)菌的豐度，而凝結(jié)芽孢桿菌降低了對(duì)蝦腸道酸微菌綱和酸微菌綱細(xì)菌豐度，提高了γ變形菌綱、梭菌綱和擬桿菌綱細(xì)菌的豐度。

圖4 凡納濱對(duì)蝦腸道菌群在綱分類水平上的相對(duì)豐度

圖5為各實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦腸道菌群在科(Family)分類水平上的相對(duì)豐度?？梢钥闯觯鲗?shí)驗(yàn)組腸道菌群以紅桿菌科(Rhodobacteraceae)、丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)和黃桿菌科(Flavobacteriaceae)為優(yōu)勢(shì)菌群。各實(shí)驗(yàn)組比較，糞腸球菌組、嗜酸乳桿菌組和凝結(jié)芽孢桿菌組的紅桿菌科所占比例分別為42.951%、51.408%和41.784%，對(duì)照組為41.258%，各實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組紅桿菌科均有不同程度增加；3個(gè)實(shí)驗(yàn)組腸道菌群中丹毒絲菌科所占比例分別為20.074%、15.113%和18.447%，對(duì)照組為28.223%，各實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組丹毒絲菌科明顯減少；糞腸球菌組、嗜酸乳桿菌組和凝結(jié)芽孢桿菌組的黃桿菌科含量分別為12.388%、9.658%和15.445%，對(duì)照組為15.088%，嗜酸乳桿菌組和糞腸球菌組較對(duì)照組黃桿菌科明顯減少；相較于對(duì)照組的乳桿菌科(0.015%)和芽孢桿菌科(0.003%)，嗜酸乳桿菌組的乳桿菌科(0.047%)和芽孢桿菌科(0.011%)及糞腸球菌組的芽孢桿菌科(0.008)比例明顯升高。

圖5 凡納濱對(duì)蝦腸道菌群在科分類水平上的相對(duì)豐度

圖6為對(duì)蝦腸道菌群在屬分類水平上的物種豐度聚類圖。可以看出，在屬分類水平上，主要優(yōu)勢(shì)類群為魯杰氏菌屬(Ruegeria)、海綿單胞菌屬(Spongiimonas)、海命菌屬(Marivita)、小紡錘狀菌屬(Fusibacter)等。與對(duì)照組相比，糞腸球菌組中發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、噬冷菌屬(Algoriphagus)以及蛭弧菌屬(Bdellovibrio)顯著升高(P<0.05)，凝結(jié)芽孢桿菌組中Shimia顯著升高(P<0.05)。

飼料中添加的3種乳酸菌所在的綱、科、屬水平相對(duì)豐度如表4所示。可以看出，嗜酸乳桿菌組和糞腸球菌組對(duì)蝦腸道中芽孢桿菌綱顯著高于凝結(jié)芽孢桿菌組和對(duì)照組(P<0.05)。相較于對(duì)照組的乳桿菌科(0.015 1%)和芽孢桿菌科(0.003 1%)，嗜酸乳桿菌組的乳桿菌科(0.047 7%)和芽孢桿菌科(0.011 3%)及糞腸球菌組的芽孢桿菌科(0.007 5%)豐度顯著增加，嗜酸乳桿菌組中乳桿菌屬顯著高于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(P<0.05)。但腸球菌科和屬在各實(shí)驗(yàn)組中均未檢出。

2.4 副溶血弧菌攻毒

副溶血弧菌攻毒后各組對(duì)蝦累計(jì)死亡率情況見(jiàn)圖7。經(jīng)副溶血弧菌攻毒后，對(duì)蝦攝食量明顯降低，活動(dòng)緩慢或沿壁漫游，直至死亡。大部分死亡蝦體附肢發(fā)紅，解剖發(fā)現(xiàn)存在空胃、肝胰腺腫大現(xiàn)象。從圖7可以看出，攻毒實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后各組對(duì)蝦陸續(xù)出現(xiàn)死亡，在11～13 d時(shí)停止死亡。各實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦累積死亡率比較，糞腸球菌組(40.0%)與嗜酸乳桿菌組(6.7%)對(duì)蝦死亡率顯著低于對(duì)照組(66.7%，P<0.05)，以嗜酸乳桿菌組效果最佳，而凝結(jié)芽孢桿菌組(53.3%)與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

圖6 凡納濱對(duì)蝦腸道菌群在屬分類水平上的物種豐度聚類圖

表4 飼料中添加的3種乳酸菌所在的綱、科、屬分類水平上的相對(duì)豐度

3 討論

3.1 飼料中添加乳酸菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)和抗病力的影響

研究表明，乳酸菌作為飼料添加劑，可以有效促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[7,11]。例如，劉迪等[12]發(fā)現(xiàn)，在凡納濱對(duì)蝦飼料中添加嗜酸乳桿菌組，對(duì)蝦增重率顯著提高，飼料系數(shù)明顯降低。沙玉杰等[13]研究表明，與對(duì)照組相比，用含有1.0×107cfu/g糞腸球菌的飼料投喂凡納濱對(duì)蝦，可有效提高其特定生長(zhǎng)率。同時(shí)，相關(guān)研究顯示，在飼料中添加適宜濃度的凝結(jié)芽孢桿菌也對(duì)對(duì)蝦生長(zhǎng)具有明顯促進(jìn)作用，提高其特定生長(zhǎng)率等指標(biāo)[14-16]。不過(guò)，關(guān)于糞腸球菌、嗜酸乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)等影響的效果的比較尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究表明，在飼料中添加這3種不同種類的乳酸菌，均可顯著提高凡納濱對(duì)蝦的體重、特定生長(zhǎng)率、飼料效率等指標(biāo)，與上述研究結(jié)果相似。但3種不同乳酸菌促長(zhǎng)的效果有所差異，以凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能改善的效果為最佳。而從副溶血弧菌攻毒后對(duì)蝦累積死亡率來(lái)看，添加糞腸球菌和嗜酸乳桿菌可顯著對(duì)蝦的抗病力，但以嗜酸乳桿菌效果最為好。

圖7 副溶血弧菌攻毒后各實(shí)驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦累計(jì)死亡率

3.2 飼料中添加乳酸菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

正常動(dòng)物腸道中棲居著大量的微生物群系[17]，受遺傳、飲食和自然條件等多種因素的影響[18]。它們不僅與宿主之間保持著一種動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系，菌群與菌群間也存在一定比例的聯(lián)系，即動(dòng)物腸道的微生態(tài)平衡[19]。保持腸道微生態(tài)的平衡對(duì)維持機(jī)體物質(zhì)代謝和免疫調(diào)節(jié)等生理功能以及動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育均具有重要的影響[20]。研究表明，變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門是多種水產(chǎn)動(dòng)物的腸道中最主要的細(xì)菌類群[21-24]。例如，Gao等[21]的研究顯示變形菌門細(xì)菌是養(yǎng)殖池塘刺參(Stichopusjaponicus)腸道內(nèi)第一優(yōu)勢(shì)菌群。溫崇慶等[25]發(fā)現(xiàn)，盡管凡納濱對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)因不同DNA提取方法而呈現(xiàn)顯著差異，但仍以變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門等為優(yōu)勢(shì)菌門。在本研究中，變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門類群也是凡納濱對(duì)蝦腸道中最為主要的類群。但添加乳酸菌后，對(duì)蝦腸道變形菌門均有所增加，厚壁菌門則有所減少。而凝結(jié)芽孢桿菌組中擬桿菌門的物種豐度較其他實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照有所增加。一般認(rèn)為，擬桿菌門具有促進(jìn)碳水化合物發(fā)酵的功能，是一類可參與糖類、膽汁酸和類固醇代謝等功能的菌群[24]，這可能與凝結(jié)芽孢桿菌組對(duì)蝦體現(xiàn)的最優(yōu)生長(zhǎng)性能有關(guān)。另外，值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)丹毒絲菌綱為對(duì)蝦腸道內(nèi)第二優(yōu)勢(shì)類群，這在水產(chǎn)動(dòng)物腸道中尚屬首次發(fā)現(xiàn)。

乳酸菌能夠有效調(diào)節(jié)水產(chǎn)動(dòng)物腸道菌群，可通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、分泌抑菌物質(zhì)等方式改變動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)[26]。例如，Venkat等[27]研究表明，添加1.4×108或2.4×108cfu/kg乳酸芽孢桿菌的能夠顯著提高羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)腸道菌群中益生菌的數(shù)量。章蔚等[24]用分離的一株乳酸菌(Leuconostoclactis)投喂黑鯛(Sparusmacrocephlus)，發(fā)現(xiàn)其腸道細(xì)菌的DGGE圖譜的條帶數(shù)顯著增加。傅玲琳等[28]則發(fā)現(xiàn)飼料中添加乳酸菌顯著降低了羅非魚(Tilapia)腸道芽孢桿菌的數(shù)量，同時(shí)弧菌、假單胞菌(Pseudomonas)和氣單胞菌(Aeromonas)的數(shù)量也有所下降。然而，關(guān)于不同種類乳酸菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物腸道菌群可能的差異性影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究則發(fā)現(xiàn)，添加乳酸菌后，盡管菌群多樣性指數(shù)未見(jiàn)顯著差異，但實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)與對(duì)照組產(chǎn)生了明顯分異。在綱和科分類水平的優(yōu)勢(shì)類群中，α-變形菌綱豐度在各實(shí)驗(yàn)組均有所上升，丹毒絲菌綱和丹毒絲菌科則均顯著下降，紅桿菌科則在不同實(shí)驗(yàn)組中不同程度有所增加，黃桿菌綱和黃桿菌科在糞腸球菌組、嗜酸乳桿菌組中明顯下降。同時(shí)，嗜酸乳桿菌組中乳桿菌科和芽孢桿菌科豐度則明顯高于對(duì)照組，糞腸球菌組中的芽孢桿菌科豐度也明顯升高。不過(guò)，值得注意的是，腸球菌科在本研究中各實(shí)驗(yàn)組中均未被檢出，具體原因尚需進(jìn)一步研究。

3.3 腸道菌群組成與對(duì)蝦抗病力的關(guān)聯(lián)

乳酸菌能夠有效調(diào)節(jié)水產(chǎn)動(dòng)物腸道菌群平衡，提高宿主免疫力，抑制病原微生物的生長(zhǎng)，使宿主在遭受病害侵襲時(shí)，增強(qiáng)抗病能力，進(jìn)而提高存活率。例如，Gildberg等[29]使用添加的乳酸菌飼料投喂鱈魚(Gadusmorhua)苗后，在處于強(qiáng)致病弧菌的養(yǎng)殖環(huán)境時(shí)，鱈魚抗病率顯著提高。李軍亮等[30]研究了飼料中添加嗜酸乳桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗哈維弧菌(V.harveyi)的效果，發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦存活率隨添加量的增加顯著升高。本研究則表明，不同乳酸菌種類影響對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌的抵抗力，盡管均可不同程度提高對(duì)蝦抗病力，但以嗜酸乳桿菌效果最佳。一般認(rèn)為，益生菌可以作為非特異性免疫因子，在宿主免疫系統(tǒng)內(nèi)通過(guò)鞭毛蛋白、脂多糖、肽聚糖和細(xì)胞因子分泌被腸粘膜細(xì)胞表面受體識(shí)別，進(jìn)而提高對(duì)病原菌的抵抗力[31]。然而，關(guān)于腸道菌群組成的變化與宿主抗病力關(guān)系則比較復(fù)雜，尚缺乏一致的結(jié)論，但部分種類的確可反映出腸道和機(jī)體的健康狀態(tài)。從本研究結(jié)果看，一方面，在嗜酸乳桿菌組對(duì)蝦腸道菌群中，優(yōu)勢(shì)類群的丹毒絲菌科和黃桿菌科豐度的下降以及紅桿菌科豐度的增加最為顯著；另一方面，添加的3種乳酸菌中，乳酸桿菌和糞腸球菌都屬乳酸桿菌目，它們與凝結(jié)芽孢桿菌都屬芽孢桿菌綱。從綱、科和屬三個(gè)分類水平上分別比較，嗜酸乳桿菌組對(duì)蝦腸道芽孢桿菌綱顯著高于凝結(jié)芽孢桿菌組和對(duì)照組，乳桿菌科、芽孢桿菌科及乳桿菌屬也顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。但腸球菌科和屬在各實(shí)驗(yàn)組中均未檢出。這些腸道菌群組成的變化可能都與對(duì)蝦的生長(zhǎng)與抗病力等方面存在的差異有關(guān)。一般認(rèn)為，乳桿菌科和芽孢桿菌科細(xì)菌種類是腸道中潛在的益生菌。例如，研究證明，芽孢桿菌屬、乳桿菌屬和乳球菌屬可以抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和病原體誘導(dǎo)的腸功能紊亂[32-34]。同時(shí)，也有研究表明紅桿菌科的豐度與對(duì)蝦的生長(zhǎng)和存活成正相關(guān)關(guān)系[35]。不過(guò)，丹毒絲菌科目前在水產(chǎn)動(dòng)物中尚未見(jiàn)報(bào)道，其在人的腸道菌群中的角色也尚不明確，但其部分種類可能會(huì)增加腸道的炎癥反應(yīng)[36]，因此，其豐度的降低可能反映腸道的健康度較好。但遺憾的是，關(guān)于腸道菌群對(duì)機(jī)體影響的機(jī)制比較復(fù)雜，尚需結(jié)合代謝組學(xué)等研究手段進(jìn)一步深入研究與解析。

4 結(jié)語(yǔ)

飼料中添加1.0×1010cfu/kg的嗜酸乳桿菌W2、糞腸球菌LYB1和凝結(jié)芽孢桿菌NJ17均可有效促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)速率，并不同程度提高蝦體對(duì)副溶血弧菌的抗病力。若以對(duì)蝦特定生長(zhǎng)率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，添加凝結(jié)芽孢桿菌效果最佳；若以對(duì)蝦抗弧菌能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，添加嗜酸乳桿菌最佳。3種乳酸菌均明顯改變了對(duì)蝦腸道微生物群落的組成和豐度，但對(duì)對(duì)蝦腸道菌群多樣性影響不大。