UPLC-MS/MS同時測定不同產(chǎn)地石仙桃中30種酚類成分的含量

林逸凡，張宗偉，劉劍*，任銘誠，許文，趙海譽，黃鳴清*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

石仙桃(PholidotachinensisLindl.)為蘭科石仙桃屬植物石仙桃的假鱗莖或全草，始載于《生草藥性備要》[1]，主要分布于福建、廣東、云南等地。石仙桃具有養(yǎng)陰，清肺，利濕，消瘀的功效，民間常用于治療頭痛、咳嗽、高血壓等，其單方制劑頭痛定糖漿臨床上用于治療神經(jīng)功能性頭痛、腦震蕩后遺癥[2]。化學(xué)研究表明[3-6]，石仙桃中含有黃酮類、菲類、萜類、多糖等組分，但這些研究目前主要集中在多糖、菲類化合物的分離鑒定，很少涉及以黃酮為代表的酚類成分。而大量研究表明[7-14]，石仙桃中黃酮等酚類成分具有局麻、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗驚厥、抗腫瘤、抗疲勞、抗缺氧等多種活性，提示酚類成分可能是其主要藥效物質(zhì)之一。

在質(zhì)量評價方面，劉建新等[15]采用紫外可見分光法測定石仙桃總黃酮的含量；張淼等[16]采用高效液相色譜(HPLC)法對不同產(chǎn)地的石仙桃藥材進(jìn)行指紋圖譜研究；林麗聰?shù)萚17]采用HPLC法對石仙桃中的兩個酚類成分(天麻素和天麻苷元)進(jìn)行含量測定；侯慧靜等[18]采用超高效液相色譜(UPLC)法測定石仙桃中兩個二氫菲類化合物(2,7-二羥基-3,4,6-三甲氧基-9,10-雙氫菲和coelonin)的含量。然而，上述研究僅圍繞總黃酮或個別酚類化合物，并未整體考慮石仙桃中各種酚類成分。此外，石仙桃分布廣泛，在各地區(qū)以野生為主，藥材質(zhì)量參差不齊，有必要對其進(jìn)行多成分質(zhì)量控制。因此，本研究建立了一種超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)同時測定石仙桃中30種酚類成分含量的方法，并對不同產(chǎn)地的石仙桃藥材進(jìn)行定性定量及聚類分析，將為深入闡明石仙桃藥效物質(zhì)及質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

圖1 各成分及內(nèi)標(biāo)物化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

1 材料

Acquity UPLC I-Class超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Xevo TQ-S三重四極桿質(zhì)譜(美國Waters公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)；CPA225D型十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司)；JXFSTPRP-24研磨儀(上海凈信科技有限公司)；Heraeus Fresco17離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；HH-1恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；KQ-500E臺式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

乙腈、甲醇、水為質(zhì)譜純(德國Merck公司)；甲酸為色譜純(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，其余試劑均為分析純；對照品香草酸(批號：MUST-16062307)、阿魏酸(批號：MUST-16021902)、丁香酸(批號：MUST-17041910)、兒茶素(批號：MUST-16081503)、鞣花酸(批號：MUST-16062603)、葛根素(批號：MUST-15012916)、葒草苷(批號：MUST-13070502)、異葒草苷(批號：MUST-13100902)、牡荊素-2-O-鼠李糖苷(批號：MUST-17101202)、原兒茶醛(批號：MUST-15040502)、咖啡酸(批號：MUST-17032010)、白楊素(批號：MUST-14070310)、根皮素(批號：MUST-15012608)、木犀草素(批號：MUST-17102605)、木犀草苷(批號：MUSE-17030405)、金絲桃苷(批號：MUST-17022010)、洋薊素(批號：MUST-16041015)、夏佛托苷(批號：MUST-14092002)、異夏佛托苷(批號：MUST-14060203)、水仙苷(批號：MUST-17040109)、反式-2-羥基肉桂酸(批號：MUST-16051803)、野黃芩苷(批號：MUST-13091204)均購于成都曼思特生物科技有限公司；牡荊素(批號：111687-200602)、槲皮苷(批號：111538-200504)、蘆丁(批號：100080-201610)、綠原酸(批號：110753-201716)購于中國藥品生物制品檢定所；紫云英苷(批號：13022721)、異綠原酸C(批號：13022523)、山柰酚-3-O-蕓香糖苷(批號：13103022)購于天津仕蘭科技有限公司；芹菜素(批號：Y131214)、沒食子酸乙酯(批號：Y103947)購于北京賽佰草科技有限公司；紫鉚素(批號：T09J7Z17539)購于上海源葉生物科技有限公司；以上對照品均為HPLC級，含量 ≥ 98.00%。

13批石仙桃藥材分別采集于浙江麗水(S1)、福建寧德(S2)、福建泉州(S3)、四川成都(S4)、廣東韶關(guān)(S5、S9、S13)、福建漳州(S6、S7)、廣西玉林(S8)、廣西欽州(S10)、廣東揭陽(S11)、云南曲靖(S12)，并經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)黃澤豪教授鑒定為蘭科石仙桃屬植物石仙桃(PholidotachinensisLindl.)的假鱗莖或全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Welch Xtimate UHPLC C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流動相：0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脫模式，流動相比例為：0～0.5 min，2% B；0.5～2.5 min，2%→7% B；2.5～4.5 min，7%→13% B；4.5～6.5 min，13%→20% B；6.5～9.5 min，20%→55% B；9.5～12.5 min，55%→90% B；12.5～13.5 min，90% B；13.5～13.6 min，90%→2% B；13.6～15 min，2%→2% B；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

質(zhì)譜條件：采用正負(fù)切換的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，離子源為電噴霧電離源，質(zhì)譜參數(shù)如下：離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣流量800 L·h-1，脫溶劑氣溫度500 ℃，毛細(xì)管電壓2.5 kV，脫溶劑氣N2，碰撞氣體Ar，錐孔氣流量50 L·h-1，駐留時間0.02 s。待測成分及內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)見表1，各成分MRM色譜圖見圖2。

表1 各化合物及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)

圖2 各成分及內(nèi)標(biāo)物的MRM色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱定香草酸、阿魏酸、丁香酸、紫鉚素、兒茶素、鞣花酸、葛根素、牡荊素、葒草苷、異葒草苷、牡荊素-2-O-鼠李糖苷、原兒茶醛、咖啡酸、沒食子酸乙酯、白楊素、芹菜素、根皮素、木犀草素、綠原酸、槲皮苷、紫云英苷、木犀草苷、金絲桃苷、異綠原酸C、洋薊素、夏佛托苷、異夏佛托苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、蘆丁、水仙苷對照品適量，加入純甲醇溶解并稀釋至刻度，制備為濃度2 mg·mL-1的單一對照品儲備液。分別精密量取各對照品儲備液適量，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，分別得到質(zhì)量濃度為4 014.78、4 073.7、2 433.2、504、19.76、210、102、4 075.5、2 056.824、2 005.248、10.022 4、1 054.85、509.76、120.4、203.84、2 068、10.128、698.28、200、62.01、408、84、1 833.96、424.2、304.92、247.68、524、1 666.98、783、2 021.376 ng·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱定對照品反式-2-羥基肉桂酸、野黃芩苷適量，加入純甲醇溶解并稀釋至刻度，制備為濃度2 mg·mL-1的單一對照品儲備液，分別精密量取內(nèi)標(biāo)對照品儲備液適量，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，得到濃度分別為367.8、836.8 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)混合溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 石仙桃全草于60 ℃烤箱中干燥48 h后，粉碎，過篩。精密稱取1 g粉末，置于錐形瓶中，加入40 mL 80%乙醇，搖勻，于80 ℃水浴鍋中回流提取2 h，靜置冷卻，離心(10 000 r·min-1)10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。用于定量分析的樣品溶液：取續(xù)濾液稀釋10倍，按1∶1(200∶200,μL)加入內(nèi)標(biāo)溶液后進(jìn)行測定。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察及定量限測定 精密量取“2.2.1”項下的混合對照品溶液，用50%甲醇逐級稀釋，并加入內(nèi)標(biāo)液，即得一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以各成分與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)，待測成分濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。分別以信噪比為3和10時各對照品溶液的濃度作為檢測限(LOD)和定量限(LOQ)，見表2。

表2 各檢測成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限和定量限

2.3.2 精密度試驗 配制適當(dāng)濃度的混合對照品溶液，在“2.1”和“2.2”項下的色譜與質(zhì)譜條件下，當(dāng)天連續(xù)進(jìn)樣6次測定其日內(nèi)精密度，連續(xù)測定3 d，考察其日間精密度，記錄各對照品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比，并計算RSD，結(jié)果見表3，RSD均小于5.19%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取石仙桃藥材適量，按“2.2.3”項下制備供試品溶液，分別于制備后的0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定其峰面積，計算RSD，結(jié)果見表3，RSD均小于3.80%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗 取同一批石仙桃藥材，按“2.2.3”項下同法制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣測定，計算其平均含量及RSD，結(jié)果見表3，RSD均小于4.12%，表明方法重復(fù)性良好。

表3 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱定已知含量的石仙桃藥材適量，平行9份，分別精密加入低、中、高3種濃度的對照品溶液，按“2.2.3”項同法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，計算平均回收率及RSD，結(jié)果見表4。

表4 各成分回收率考察結(jié)果

2.4 樣品含量測定 分別精密稱取不同產(chǎn)地石仙桃藥材適量，按“2.2.3”項下的方法制備樣品，再按“2.1”和“2.2”項下的LC-MS條件進(jìn)樣測定，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計算各批次藥材中30種化合物的含量，結(jié)果見表5。

表5 不同產(chǎn)地藥材含量測定結(jié)果(μg·g-1,n=3)

2.5 聚類分析 為考察不同產(chǎn)地藥材間的差異性，采用SPSS 26.0軟件，以本法測定的30種化合物含量為變量，以Squared Euclidean Distance為測度，對13批不同產(chǎn)地的石仙桃藥材進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示(圖3)，13批藥材可聚為2類，其中浙江(S1)、福建(S2、S3、S6、S7)、廣東(S5、S9、S11、S13)、廣西(S8、S10)產(chǎn)地歸為Ⅰ類，四川(S4)與云南(S12)產(chǎn)地歸為Ⅱ類，可見不同地域的石仙桃藥材在質(zhì)量方面存在一定的差異性。

圖3 13批不同產(chǎn)地石仙桃藥材的層次聚類圖

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 為快速、有效分離各成分，前期比較了不同規(guī)格色譜柱的分離效果。結(jié)果顯示，Welch Xtimate UHPLC C18柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)對大部分化合物的分離效率較高，且峰型尖銳，對稱性好，適用于本試驗成分體系的測定。另一方面，通過比較甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液等4種流動相體系的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)在含甲醇的流動相體系下色譜峰存在嚴(yán)重的拖尾與基線漂移現(xiàn)象，且峰型較寬，洗脫能力遠(yuǎn)不如含乙腈的流動相體系；而在流動相中加入甲酸，可減少拖尾，改善峰型，促進(jìn)質(zhì)子化，增強離子響應(yīng)，故選用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 為了使離子響應(yīng)達(dá)到最高，分別采用正、負(fù)離子模式對各成分的單一對照品溶液進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)多數(shù)化合物在負(fù)離子模式下響應(yīng)較高，而個別化合物僅在正離子模式下有響應(yīng)，因此采用正、負(fù)離子切換模式，保證各成分在最佳電離模式下進(jìn)行測定[19]。此外，對各化合物進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，在MRM模式下，通過能量碰撞的方式選擇響應(yīng)最高的碎片離子作為定量離子(見表1)。以葛根素為例，其一級離子為417.1，經(jīng)碰撞裂解，產(chǎn)生399.0、351.2、321.1、296.9多個二級離子，其中響應(yīng)最高且干擾最小的是296.9，即[C18H16O4+]的碎片離子峰，故選其為葛根素的定量離子。

3.3 不同產(chǎn)地藥材含量分析 通過對不同產(chǎn)地藥材進(jìn)行含量測定，發(fā)現(xiàn)各批次間的成分含量存在差異；結(jié)合聚類分析可知，沿海產(chǎn)地(浙江、福建、廣東、廣西)藥材質(zhì)量較一致，但與內(nèi)陸產(chǎn)地(四川、云南)差異較大。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)陸產(chǎn)地藥材中的牡荊素、葒草苷、異葒草苷含量較高，且成分總量顯著高于沿海產(chǎn)地藥材。由此推測石仙桃中部分酚類成分含量高低可能與產(chǎn)地地理位置、氣候土壤等因素相關(guān)。綜上可見，不同地區(qū)的石仙桃藥材在質(zhì)量上存在較大差異，因此有必要對其進(jìn)行全面的質(zhì)量控制研究。

3.4 結(jié)論 本試驗基于UPLC-MS/MS建立了一種同時測定石仙桃多成分的定量分析方法，該方法在15 min內(nèi)實現(xiàn)了對各成分的基本分離，其精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性良好，具有高選擇性、高靈敏度的特點，可用于石仙桃藥材的質(zhì)量評價。此外，聚類分析結(jié)果提示不同地區(qū)的石仙桃藥材質(zhì)量存在較大差異。