基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討紅核婦潔洗液抗炎的活性成分和作用機(jī)制

饒鴻宇，李沛波，諶攀，何彥，蘇薇薇

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心/廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510275)

紅核婦潔洗液是以山楂核為原料，經(jīng)高溫干餾制得的婦科外用洗劑，具有殺蟲(chóng)止癢、解毒祛濕的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紅核婦潔洗液對(duì)瓊脂致小鼠肉芽腫增生和二甲苯致小鼠耳腫脹均存在良好的抑制作用，具有減輕炎癥反應(yīng)的功效，臨床上主要用于各種原因引起的女性陰道炎[1-2]。本團(tuán)隊(duì)前期研究闡明了紅核洗液的物質(zhì)組成，但對(duì)其藥效關(guān)鍵物質(zhì)有待進(jìn)一步發(fā)掘[3-4]。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從醫(yī)學(xué)和化學(xué)等角度系統(tǒng)的探討了藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，并運(yùn)用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)藥物的藥理學(xué)模型，構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病” 網(wǎng)絡(luò)，揭示藥物的作用機(jī)制，為中藥多成分、多靶點(diǎn)和多途徑的復(fù)雜作用機(jī)制提供新的研究方向[5-6]。目前已有多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)可提供中藥成分和作用靶點(diǎn)等信息，在中藥藥理學(xué)研究和中醫(yī)藥現(xiàn)代化方面發(fā)揮了良好的作用。本研究首次采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究紅核婦潔洗液抗炎的活性成分和機(jī)制，為紅核婦潔洗液的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 方法

1.1 化學(xué)成分的收集 本團(tuán)隊(duì)前期基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)對(duì)紅核婦潔洗液進(jìn)行了化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)的研究，共確證和指認(rèn)了92個(gè)化合物，其中酚類(lèi)化合物26個(gè)，醛酮類(lèi)化合物24個(gè)，醇醚類(lèi)化合物13個(gè)，有機(jī)酸類(lèi)及其酯類(lèi)化合物11個(gè)，呋喃及其他含氧雜環(huán)類(lèi)化合物11個(gè)，其他化合物7個(gè)，明確了紅核婦潔洗液的化學(xué)組成[3-4]。

1.2 交集靶點(diǎn)的確定及藥材-活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過(guò)SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)基于結(jié)構(gòu)相似性預(yù)測(cè)化合物的靶點(diǎn)，再結(jié)合CTD(https://ctdbase.org/)和TCMSP(http://tcmspw.com/)檢索活性化合物的靶蛋白或靶標(biāo)基因，借助Drugbank(https://www.drugbank.ca/)和 Uniprot(https://www.uniprot.org/)等數(shù)據(jù)庫(kù)查閱靶蛋白對(duì)應(yīng)的基因名。以“inflammation”為關(guān)鍵詞在DisGeNET(http://www.disgenet,org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索炎癥相關(guān)的靶點(diǎn)。將紅核婦潔洗液的藥物成分靶點(diǎn)與DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)應(yīng)，獲得交集靶點(diǎn)，并繪制Venn圖。根據(jù)交集靶點(diǎn)結(jié)果，篩選與交集靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的功效成分后，運(yùn)用Cytoscape3.7.2構(gòu)建可視化的藥材-活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并分析網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)涮卣鳌?/p>

1.3 交集靶點(diǎn)功能富集分析和通路富集分析 為進(jìn)一步解析上述篩選出的靶基因的功能，預(yù)測(cè)紅核婦潔洗液的作用機(jī)制，將篩選得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID v6.7數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)并限定物種為人(Homo sapiens)，進(jìn)行GO功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號(hào)通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分的收集及交集靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)CTD和TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)共搜集到紅核婦潔洗液成分作用的潛在靶點(diǎn)1 056個(gè)，通過(guò)DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)現(xiàn)有報(bào)道抗炎作用靶點(diǎn)共467個(gè)，兩者整合后得到交集靶點(diǎn)143個(gè)(見(jiàn)圖1)，視為紅核婦潔洗液抗炎的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，通過(guò)Cytoscape分析，明確了與預(yù)測(cè)靶點(diǎn)相關(guān)的活性成分共84個(gè)，其中酚類(lèi)化合物24個(gè)，醛酮類(lèi)化合物24個(gè)，醇醚類(lèi)化合物11個(gè)，有機(jī)酸類(lèi)及其酯類(lèi)化合物10個(gè)，呋喃及其他含氧雜環(huán)類(lèi)化合物8個(gè)，其他化合物7個(gè)，用于后續(xù)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

圖1 紅核婦潔洗液成分潛在靶點(diǎn)與炎癥靶點(diǎn)Venn圖

2.2 交集靶點(diǎn)篩選和藥材-成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析 利用Cytoscape 建立的藥材-成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖2。由圖2可知，該網(wǎng)絡(luò)共有227個(gè)節(jié)點(diǎn)(84個(gè)成分，143個(gè)交集靶點(diǎn))，1 392條邊。在143個(gè)交集靶點(diǎn)中，Degree值前15的靶點(diǎn)為CYP19A1、PARP1、IDO1、JAK2、ALPL、ALOX5、NOS2、EGFR、CDK5、PTGS2、HSP90AA1、CHRNB2、CHRNA4、NOS3和NAT1。Degree值前5的成分是eugenol(丁香酚)、2-methoxy-4-(1-propenyl)-phenol(異丁香酚)、2-methyl-1H-benzimidazole(2-甲基苯并咪唑)、2-methoxy-phenol(愈創(chuàng)木酚)和coniferyl aldehyde(松柏醛)。

2.3 交集靶點(diǎn)通路分析 運(yùn)用DAVID平臺(tái)的GO富集分析和KEGG通路分析的功能，對(duì)紅核婦潔洗液中的143個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行研究。通過(guò)GO富集分析確定了645個(gè)GO條目(P<0.05)。由圖3可知，生物過(guò)程相關(guān)的條目有522個(gè)(81%)，主要涉及炎癥反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、一氧化氮生物合成過(guò)程的正向調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增殖的正向調(diào)控、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路和免疫應(yīng)答等方面；分子功能相關(guān)的條目有72個(gè)(11%)，主要涉及酶結(jié)合、細(xì)胞因子活性、蛋白結(jié)合、受體結(jié)合、趨化因子活性、血紅素結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、相同的蛋白結(jié)合、蛋白激酶綁定和類(lèi)固醇激素受體活性等方面；細(xì)胞組成相關(guān)的條目有51個(gè)(8%)，主要涉及細(xì)胞外空間、細(xì)胞表面、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞質(zhì)膜、質(zhì)膜組成部分、質(zhì)膜外側(cè)、膜筏、細(xì)胞膜小窩、細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞膜等方面。通過(guò)KEGG通路分析共篩選到 107條通路(篩選P<0.05的通路，P值越小，富集程度越高)。圖4為列舉的前25條相關(guān)通路，主要包括腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、Toll樣受體(TLR)信號(hào)通路和細(xì)胞因子之間的相互作用等。

圖4 紅核婦潔洗液交集靶點(diǎn)KEGG通路富集分析結(jié)果

3 討論

紅核婦潔洗液是以山楂核為原料制成的外用洗液，具有抗炎效果好，毒副作用小的特點(diǎn)，是婦科臨床常見(jiàn)的抗菌消炎藥之一?，F(xiàn)階段研究表明紅核婦潔洗液對(duì)于多種致病菌具有良好的抑制作用，與臨床效果相一致，然而其抗炎機(jī)制方面的研究卻較為少見(jiàn)。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)紅核婦潔洗液中的化學(xué)成分進(jìn)行研究，系統(tǒng)地分析了紅核婦潔洗液的92個(gè)化合物。其中，有72個(gè)化合物至少10個(gè)以上的靶點(diǎn)相關(guān)，分值從高到低排序的化合物依次為丁香酚、異丁香酚、2-甲基苯并咪唑和愈創(chuàng)木酚等，其中排名最高的是丁香酚，為49個(gè)。丁香酚是一種從植物精油中提取得到的酚類(lèi)化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗腫瘤等多種生物活性，多項(xiàng)研究表明丁香酚可以改善LPS和汽車(chē)尾氣等引起的肺損傷，降低IL-6等炎癥因子水平；還可以通過(guò)作用于MAPKs和AKT/IκBα信號(hào)通路，抑制一氧化氮合酶的表達(dá)，降低巨噬細(xì)胞的NO水平，發(fā)揮抗炎的功效[7-9]。異丁香酚是丁香酚的異構(gòu)體，Kaur等[10]發(fā)現(xiàn)異丁香酚能抑制COX-2和iNOS的表達(dá)，降低PGE2和NO水平，緩解弗氏試劑引起的大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀；還能減弱LPS對(duì)小鼠腹膜巨噬細(xì)胞的刺激，減少TNF-α的含量，發(fā)揮抗炎作用。Johansson等[11]對(duì)麥芽提取物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)愈創(chuàng)木酚具有緩解橄欖油誘發(fā)的小鼠足墊炎癥的功效。Akram等[12]運(yùn)用細(xì)胞模型和動(dòng)物模型對(duì)松柏醛的抗炎活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明松柏醛能抑制JAK2-STAT1-iNOS信號(hào)通路，降低NO水平，還能緩解角叉菜膠引起的大鼠足部水腫和佛波醇肉豆蔻酸酯引起的小鼠耳部水腫，具有良好的抗炎功效。由此可見(jiàn)，紅核婦潔洗液中的丁香酚、異丁香酚和愈創(chuàng)木酚等在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞水平上均表現(xiàn)出良好的抗炎作用。

在“成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖”分析過(guò)程中，紅核婦潔洗液預(yù)測(cè)的143個(gè)靶點(diǎn)中，有55個(gè)靶點(diǎn)與至少10個(gè)以上的化合物相關(guān)，占38.46%，分值從高到低排序的靶點(diǎn)依次為CYP19A1、PARP1、IDO1、JAK2和ALPL等。CYP19A1是細(xì)胞色素P450家族中的一員，具有催化雌激素等類(lèi)固醇激素生成的作用，多項(xiàng)研究表明LPS刺激引起的炎癥與CYP19A1的表達(dá)存在相關(guān)性[13-14]。此外，Qin等[15]發(fā)現(xiàn)CYP19A1的表達(dá)與TNF-α的分泌也存在一定的聯(lián)系。IDO1是一種色氨酸分解酶，可以抑制適應(yīng)性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，諸多研究表明抑制IDO1的表達(dá)可以減輕炎癥反應(yīng)[16-18]。Ho等[19]對(duì)IDO1的抗炎機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)被TNF-α等炎癥因子活化的IDO1可以促進(jìn)AhR水平的提升，激活巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，加重炎癥反應(yīng)。JAK2是酪氨酸蛋白激酶家族中的成員，可激活JAK/STAT通路，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。Chen等[20]對(duì)蛙皮素刺激的大鼠胰腺細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路可導(dǎo)致IL-6和TGF-1水平降低，減少細(xì)胞死亡。與此同時(shí)，多項(xiàng)研究表明JAK2/STAT3信號(hào)通路還可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化，加重炎癥反應(yīng)[21-23]。因此，紅核婦潔洗液可作用于CYP19A1、IDO1和JAK2等靶點(diǎn)，發(fā)揮抗炎的功效。

通過(guò)生物功能富集分析和KEGG信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)紅核婦潔洗液涉及多項(xiàng)生物過(guò)程和信號(hào)通路，尤其是炎癥反應(yīng)、TNF信號(hào)通路和缺氧反應(yīng)等，在抗炎過(guò)程中起到重要的作用。TNF是與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的細(xì)胞因子家族，活化的TNFR可以促進(jìn)IL-1、IL-6和IL-10等炎癥因子的釋放，還能激活MAPK-JNK和NF-κB等多條信號(hào)通路，活化與機(jī)體炎癥相關(guān)的5-脂氧合酶和磷脂酶A2等多個(gè)蛋白，加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)[24]。諸多研究發(fā)現(xiàn)藥物可通過(guò)作用于TNF信號(hào)通路和LPS信號(hào)通路等，下調(diào)IL-1β、IL-6和等TNF-α炎癥因子水平，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，促進(jìn)康復(fù)[25-26]。HIF-1常在低氧、生長(zhǎng)因子和癌基因等因素的刺激下完成活化，也可被活化的Akt激活，維持組織和細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，使細(xì)胞適應(yīng)缺氧狀態(tài)?；罨蟮腍IF-1α具有增加巨噬細(xì)胞遷移抑制因子的分泌，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的聚集和侵襲；激活PD-L1等配體，促進(jìn)B細(xì)胞的成熟和T細(xì)胞的活化；調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)炎癥性淋巴管中淋巴管再生；促進(jìn)炎癥條件下樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟的作用[27-28]。有研究發(fā)現(xiàn)藥物可以通過(guò)抑制HIF-1途徑，改善缺氧條件和氧化應(yīng)激下誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥，改善機(jī)體功能[29-30]。因此，紅核婦潔洗液可從減少炎癥因子分泌，改善氧化應(yīng)激和促進(jìn)免疫功能等方面發(fā)揮加速炎癥的消退，促進(jìn)患者康復(fù)。

綜上所述，紅核婦潔洗液中的活性成分群可通過(guò)多靶點(diǎn)多通路減輕炎癥反應(yīng)，還能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，改善氧化應(yīng)激和缺氧反應(yīng)，促進(jìn)患者的康復(fù)。本研究闡明了紅核婦潔洗液抗炎的活性成分及作用機(jī)制，為紅核婦潔洗液的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)的依據(jù)。