西藏扁芒菊的抗補(bǔ)體活性成分研究

趙志治，高慧琴，德吉，盧燕

(1.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203;2.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西 太原 030001;3.西藏大學(xué)理學(xué)院，西藏自治區(qū) 拉薩 850000)

西藏扁芒菊[Waldheimiaglabra(Decne.)Rgl.]是菊科(Compositae)扁芒菊屬(Waldheimia)的代表性植物，生長(zhǎng)在海拔4 900～5 200 m的沙壤土中[1]，在印度、巴基斯坦、尼泊爾、阿富汗與中國(guó)均有分布。西藏扁芒菊的藏語(yǔ)名為“剛布”，其花與葉的浸泡液有良好的驅(qū)蟲效果，全草曬干可用于緩解瘙癢、頭痛、關(guān)節(jié)痛、發(fā)熱等癥狀[2-3]。Giorgi等[2]通過(guò)頂空固相微萃取-氣相色譜法從西藏扁芒菊中識(shí)別到70余種揮發(fā)性物質(zhì)，包括5個(gè)醇類化合物、2個(gè)烴類化合物、8個(gè)酮類化合物、7個(gè)游離脂肪酸、6個(gè)酯類化合物、39個(gè)萜類化合物與5個(gè)醛類化合物。De等[4]從西藏扁芒菊揮發(fā)油中分離出27個(gè)化合物，并發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油有良好的抗炎、抗病毒活性。西藏扁芒菊總多糖能夠顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞 NO分泌功能，具有免疫增強(qiáng)活性[5]。

課題組前期研究表明，清熱類中草藥解熱抗炎藥效與其抑制補(bǔ)體系統(tǒng)過(guò)度激活有關(guān)，魚腥草、火炭母、黃芩等清熱中藥普遍含有黃酮、木脂素、多糖等多類抗補(bǔ)體活性物質(zhì)[6-8]，但西藏扁芒菊的揮發(fā)油和總多糖均無(wú)抗補(bǔ)體活性[4-5]，預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示西藏扁芒菊中僅醇提物組分有顯著的抗補(bǔ)體活性?？紤]到西藏扁芒菊清熱藥效物質(zhì)研究相對(duì)不足，本研究采用課題組前期的中藥抗補(bǔ)體活性測(cè)定方法[9]，從西藏扁芒菊95%乙醇提取物中活性導(dǎo)向分離得到10個(gè)抗補(bǔ)體活性成分，包括5個(gè)酚酸、3個(gè)黃酮、1個(gè)倍半萜和1個(gè)酪醇，并對(duì)化合物的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了分析討論，為該藥材的進(jìn)一步開發(fā)利用與質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Autopol V plus型旋光儀(美國(guó)Rudolph公司)；APEXIII 7.0 TESLA FTMS型質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker公司)；DRX 400型核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司)；Agilent 1260(DAD檢測(cè)器)；Eclipse XDB-C-18 column(5 μm,9.4×250 mm)；Agilent 1200(DAD檢測(cè)器)；所用試劑均為分析純。

西藏扁芒菊藥材采收于2014年8月，經(jīng)復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院盧燕副教授鑒定為菊科扁芒菊屬西藏扁芒菊[Waldheimiaglabra(Decne.)Rgl.]全草，標(biāo)本存放于復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室。

2 方法

2.1 提取與分離 西藏扁芒菊干燥藥材1.285 kg中加入95%乙醇(1∶20料液比)，閃式提取3次，向?yàn)V渣中再次加入95%乙醇(1∶10料液比)超聲提取30 min，合并濾液減壓濃縮得到醇提物浸膏181.70 g。浸膏加2 L水混懸，以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取 5 次，分別合并濃縮得到4個(gè)部位的浸膏30.19 g(石油醚)、20.15 g(二氯甲烷)、7.72 g(乙酸乙酯)、10.50 g(正丁醇)。

對(duì)西藏扁芒菊的醇提物以及石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取物共5個(gè)部分的抗補(bǔ)體活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果與陽(yáng)性肝素比較，乙酸乙酯部分有明顯的抗補(bǔ)體活性，血清總補(bǔ)體活性(CH50)值達(dá)到(140.8±2.1)μg·mL-1，正丁醇部分活性較弱，而二氯甲烷與石油醚部分則沒(méi)有抗補(bǔ)體活性。因而選擇乙酸乙酯部分進(jìn)行進(jìn)一步的物質(zhì)分離與純化。

乙酸乙酯萃取部位浸膏以二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇(50∶1～1∶1)作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，依次得到Fr.1～Fr.7 7個(gè)組分，F(xiàn)r.1(380 mg)以凝膠柱(二氯甲烷-甲醇1∶1)洗脫，得到化合物2(7 mg)、4(5 mg)、8(7 mg)；Fr.2(280 mg)以二氯甲烷-甲醇(30∶1)作為洗脫劑經(jīng)硅膠柱層析得到化合物1(5 mg)、3(6 mg)；Fr.4(774 mg)以二氯甲烷-甲醇(30∶1)作為洗脫劑經(jīng)硅膠柱層后得到化合物5(4 mg)和餾分Fr.4-2，F(xiàn)r.4-2以凝膠柱(二氯甲烷-甲醇1∶1)洗脫得到化合物6(7 mg)、9(5 mg)、10(4 mg)；Fr.5(1 803 mg)以凝膠柱(二氯甲烷-甲醇1∶1)洗脫得到餾分 Fr.5-1和Fr.5-2，F(xiàn)r.5-2經(jīng)過(guò)制備液相(甲醇-水作為流動(dòng)相)制得化合物7(5 mg)。

2.2 補(bǔ)體經(jīng)典途徑的溶血活性測(cè)定

2.2.1 配制巴比妥緩沖液(BBS)，含有0.5 mol·L-1Mg2+和0.15 mol·L-1Ca2+；將配制的巴比妥緩沖液稀釋，制成1∶1 000的溶液待用。

2.2.2 測(cè)定補(bǔ)體的效價(jià) 取一定量豚鼠血清配成1∶10溶液,并倍比稀釋成1∶20、1∶40、1∶80、1∶160濃度。取溶血素、各濃度補(bǔ)體以及2%綿羊紅細(xì)胞(SRBC)各0.1 mL溶于0.3 mL BBS中,混勻后37 ℃水浴30 min，離心后取上清液在405 nm處測(cè)定吸光度值。以三蒸水溶血管的吸光度值作為全溶血標(biāo)準(zhǔn)，選擇達(dá)到相似吸光度值的最低補(bǔ)體濃度作為正常溶血所需的臨界補(bǔ)體溶度。

2.2.3 測(cè)定樣品的經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性 取臨界濃度的補(bǔ)體分別與倍比稀釋后不同濃度的供試品混勻，加入適量的BBS、溶血素和2% SRBC。37 ℃水浴30 min，離心后取上清液在405 nm處測(cè)定吸光度值。同時(shí)制備全溶血組、不溶血組、供試品對(duì)照組(不加入補(bǔ)體、溶血素和2% SRBC)，將測(cè)定組的吸光度值扣除相應(yīng)供試品對(duì)照組的吸光度值后，計(jì)算各組的溶血抑制率。以供試品溶液濃度為X軸，溶血抑制率為Y軸作圖，計(jì)算CH50值。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定 化合物1：C26H26O12，淡黃色粉末；[α]25 D-149.0°(c=0.50,MeOH),1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ:7.64,7.53(2H,d,J=16.04 Hz,H-7′,7″),7.06(2H,brs,H-2′,2″),6.95(2H,dt,J=7.5 Hz,H-5′,5″),6.80(2H,m,H-6′,6″),6.33,6.20(2H,d,J=15.6 Hz,H-8′,8″),5.38(1H,m,H-5),5.30(1H,m,H-3),3.97(1H,m,H-4),3.68(3H,s,7-OCH3),2.31(2H,m,H-2ex,6ex),2.15(2H,m,H-2ax,6ax);13C-NMR(100 MHz,CD3OD),δ:175.6(C-7),168.7,168.0(C-9′,9″),149.7,149.5(C-4′,4″),147.4,147.1(C-7′,7″),146.9,146.8(C-3′,3″),127.9,127.6(C-1′,1″),123.1,123.0(C-6′,6″),116.6,116.5(C-5′,5″),115.4,114.9(C-8′,8″),115.1,115.1(C-2′,2″),74.6(C-1),72.2(C-5),71.9(C-3),69.7(C-4),53.0(7-OCH3),36.7(C-6),35.6(C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]基本一致，故鑒定化合物1為3,5-二咖啡?？鼘幩峒柞?。

化合物2：C8H10O2，白色針晶；1H-NMR(400 MHz,CD3OD).δ:7.01(2H,d,J=8.4 Hz,H-4,8),6.68(2H,d,J=8.4 Hz,H-5,7),3.66(2H,t,J=7.0 Hz,H-1),2.70(2H,t,J=7.0 Hz,H-2；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:156.8(C-6),130.1(C-3,4,8),116.1(C-5,7),64.6(C-1),39.4(C-2)。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]一致，故鑒定化合物2為酪醇。

化合物3：C26H26O12，淡黃色粉末；[α]25 D-297.1°(c=0.50,MeOH),1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.60,7.50(2H,d,J=16.1 Hz,H-7′,7″),7.05,7.03(2H,brs,H-2′,2″),6.92(2H,m,H-5′,5″),6.75(2H,brs,H-6′,6″),6.32,6.18(2H,d,J=16.0 Hz,H-8′,8″),5.53(1H,m,H-3),5.11(1H,m,H-4),4.34(1H,m,H-5),3.72(3H,s,7-OCH3),2.34(1H,m,H-6ax),2.26(1H,m,H-2ex),2.26(1H,m,H-2ax),2.80(1H,dd,J=13.8,6.0 Hz,H-6ex);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:175.2(C-7),168.5,167.9(C-9′,9″),149.8,149.7(C-4′,4″),147.7,147.7(C-7′,7″),146.8,146.8(C-3′,3″),127.7,127.5(C-1′,1″),123.1,123.1(C-6′,6″),116.5,116.5(C-5′,5″),115.2,115.2(C-2′,2″),114.7,114.6(C-8′,8″),75.8(C-1),74.9(C-4),69.1(C-3),68.6(C-5),53.1(7-OCH3),38.6(C-2),38.4(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12-13]基本一致，故鑒定化合物3為3,4-二咖啡?？鼘幩峒柞?。

化合物4：C17H20O9，淡黃色粉末；[α]25 D-50.2°(c=0.50,water)，1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ:7.51(1H,d,J=15.9 Hz,H-7′),7.04(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),6.95(1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6′),6.78(1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.22(1H,d,J=15.9 Hz,H-8′),5.26-5.30(1H,m,H-3),4.12-4.15(1H,m,H-5),3.71(1H,dd,J=7.2 Hz,2.8 Hz,H-4),3.69(3H,s,-OCH3),1.93-2.23(4H,m,H-2,H-6);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:175.4(COO-),168.3(C-9′),149.7(C-3′),147.2(C-4′),146.9(C-7′),127.6(C-6′),123.0(C-1′),116.5(C-5′),115.1(C-2′,C-8′),75.8(C-4),72.5(C-1),72.1(C-3),70.3(C-5),53.0(-OCH3),38.1(C-6),37.7(C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]基本一致，故鑒定化合物4為綠原酸甲酯。

化合物5：C15H10O6，淡黃色粉末；1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:12.98(1H,s,5-OH),7.43(1H,d,J=2.1 Hz,H-2′),7.41(1H,dd,J=8.7,2.7 Hz,H-6′),6.90(1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.67(1H,s,H-3),6.44(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.19(1H,d,J=2.0 Hz,H-6);13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:182.2(C-4),164.6(C-2),164.5(C-7),162.0(C-9),157.8(C-5),150.2(C-4′),146.2(C-3′),122.0(C-1′),119.5(C-6′),116.2(C-5′),113.8(C-2′),104.1(C-10),103.3(C-3),99.3(C-6),94.3(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15-16]基本一致，故鑒定化合物5為木犀草素。

化合物6：C9H8O4，淡黃色無(wú)定形粉末；1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.53(1H,d,J=16.0 Hz,H-7),7.03(1H,d,J=2.0 Hz,H-2),6.94(1H,dd,J=8.0,2.0 Hz,H-6),6.78(1H,d,J=8.0 Hz,H-5),6.22(1H,d,J=16.0 Hz,H-8)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:171.2(C-9),149.7(C-4),147.2(C-7),147.0(C-3),128.0(C-1),123.0(C-6),116.7(C-8),115.7(C-2),115.3(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]一致，故鑒定化合物6為咖啡酸。

化合物7：C21H30O8，無(wú)色油狀物；[α]25 D-297.1°(c=0.20,MeOH)，1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.38(1H,s,H-13ax),5.84(1H,s,H-13ax),5.57(1H,d,J=8.0 Hz,H-1′),3.84(1H,dd,J=12.2,1.5 Hz,H-6′ax),3.68(1H,dd,J=12.2,4.7 Hz,H-6′ex),3.42(1H,m,H-3′),3.41(1H,m,H-5),3.40(1H,m,H-2′),3.38(1H,m,H-4′),2.93(1H,m,H-6ex),2.57(1H,m,H-2ex),2.56(1H,m,H-7),2.33(1H,dt,J=16.7,3.9 Hz,H-2ax),2.15(1H,m,H-6ax),1.81(1H,m,H-8ax),1.81(1H,m,H-1),1.75(1H,m,H-8ex),1.75(1H,s,H-15),1.74(1H,m,H-9ex),1.51(1H,m,H-9ax),1.26(1H,s,H-14)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:201.5(C-3),166.8(C-12),164.5(C-5),145.3(C-11),129.9(C-4),125.9(C-13),96.1(C-1′),78.9(C-3′),78.1(C-5′),74.0(C-2′),71.0(C-4′),62.3(C-6′),42.9(C-9),41.5(C-7),38.4(C-1),37.0(C-10),34.6(C-6),34.5(C-2),28.2(C-8),22.7(C-14),11.0(C-15)。以上的數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物7為β-D-glucopyranosyloxyl pteodonote。

化合物8：C15H10O7，黃色粉末；1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.71(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.61(1H,dd,J=8.0,2.0 Hz,H-6′),6.86(1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.36(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.15(1H,d,J=2.0 Hz,H-6)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:177.3(C-4),165.6(C-7),162.5(C-5),158.2(C-9),148.8(C-2),148.0(C-4′),146.2.0(C-3′),137.2(C-3),124.1(C-1′),121.7(C-6′),116.2(C-5′),116.0(C-2′),104.5(C-10),99.2(C-6),94.4(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]一致，故鑒定化合物8為槲皮素。

化合物9：C18H21O10，黃綠色油狀物；[α]25 D +100.7°(c=0.50,MeOH),1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.64(1H,d,J=16.0 Hz,H-3″),7.57(1H,d,J=16.0 Hz,H-3′),7.14(1H,d,J=2.0 Hz,H-5″),7.07(1H,d,J=2.0 Hz,H-5′),6.97(1H,dd,J=8.0,2.0 Hz,H-9′),6.95(1H,dd,J=8.0,2.0 Hz,H-9″),6.77(1H,d,J=2.0 Hz,H-8″),6.72(1H,d,J=8.0,H-8′),6.43(1H,d,J=16.0,H-2′),6.34(1H,d,J=16.0 Hz,H-2″),5.44(1H,m,H-3),5.33(1H,dd,J=12.0,8.0 Hz,H-9ax),4.65(1H,dd,J=12.0,8.0 Hz,H-9ex),4.59(1H,m,H-1),4.54(1H,m,H-7),4.23(1H,dd,J=5.0,5.4 Hz,H-2),3.79(3H,s,-OCH3),2.41(1H,dd,J=15.5,5.5 Hz,H-4ax),2.27(1H,dd,J=16.0,1.2 Hz,H-4ex)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:169.4(C-10),169.2(C-1″),168.7(C-1′),149.6(C-7′,1″),147.4,147.2(C-3′,3″),146.9,146.8(C-6′,6″),127.9,127.8(C-4′,4″),123.4,123.1(C-9″,9′),116.6,116.5(C-8″,8′),115.6,115.2(C-5′,5″),115.2,114.9(C-2′,2″),104.6(C-5),81.1(C-7),78.4(C-1),67.9(C-3),67.8(C-3),64.2(C-9),53.4(-Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20-21]基本一致，故鑒定化合物9為methyl rel-(1S,2R,3R,5S,7R)-7-[(E)-caffeoyloxymethyl]-3-[(E)-caffeoyloxy]-2-hydroxy-6,8-dioxabicyclo[3.2.1]octane-5-carboxylate。

化合物10：C30H26O14，黃綠色油狀物；1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ：6.49(1H,s,H-3),6.50(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.70(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.68(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),6.85(1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),7.32(1H,m,H-6′),5.08(1H,d,J=8.0 Hz,H-1′),3.53(2H,m,H-2″,3″),3.41(1H,m,H-4″),3.83(1H,m,H-5″),4.28(1H,dd,J=12.0,5.0 Hz,H-6a″),4.63(1H,dd,J=12.0,2.5 Hz,H-6b″),6.82(1H,d,J=2.0 Hz,H-2?),6.59(1H,d,J=8.0 Hz,H-5?),6.85(1H,d,J=8.0 Hz,H-6?),6.22(1H,d,J=16.0 Hz,H-α),7.45(1H,d,J=16.0 Hz,H-β)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:183.4.4(C-4),169.1(C=O),166.7(C-2),164.5(C-7),162.9(C-5),158.8(C-9),151.0(C-4′),149.5(C-4?),147.4(C-3?),146.9(C-3′),146.6(C-β),127.3,123.4(C-1?,1′),122.6,120.5(C-6?,6′),116.7,116.4(C-5?,5′),115.4(C-2?),114.6(C-α),114.2(C-2′),107.1,104.1(C-10,3),99.8(C-6,1″),95.9(C-8),77.8,75.6(C-3″,5″),74.6,72.1(C-2″,4″),64.7(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22-23]基本一致，故鑒定化合物10為木犀草素-7-(6″-咖啡酰氧基)-β-D-葡萄糖。

本實(shí)驗(yàn)從西藏扁芒菊95%乙醇提取物中共分得10個(gè)化合物，包括3,5-二咖啡?？鼘幩峒柞?1)、酪醇(2)、3,4-二咖啡酰奎寧酸甲酯(3)、綠原酸甲酯(4)、木犀草素(5)、咖啡酸(6)、β-D-glucopyranosyloxyl pteodonote(7)、槲皮素(8)、methyl rel-(1S,2R,3R,5S,7R)-7-[(E)-caffeoyloxyme-thyl]-3-[(E)-caffeoy-loxy]-2-hydroxy-6,8-dioxabicyclo[3.2.1]octane-5-carboxylate(9)、木犀草素-7-(6′′-咖啡酰氧基)-β-D-葡萄糖(10)。

3.2 抗補(bǔ)體活性 課題組前期已經(jīng)報(bào)道了木犀草素、槲皮素以及咖啡酸3個(gè)化合物的抗補(bǔ)體活性，本研究對(duì)其余7個(gè)化合物進(jìn)行了抗補(bǔ)體活性的測(cè)定，這10個(gè)化合物的抗補(bǔ)體活性數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 化合物1～10的抗補(bǔ)體活性CH50值

上述10個(gè)化合物均為首次從西藏扁芒菊中分離得到，且均有不同程度的補(bǔ)體抑制作用。5個(gè)酚酸類化合物(1、3、4、6、9)的CH50范圍為80.0～769.9 μg·mL-1，3個(gè)黃酮類化合物(5、8、10)的CH50范圍為280.1～450.0 μg·mL-1，兩類成分的抗補(bǔ)體活性與文獻(xiàn)報(bào)道一致[24-26]；另外，1個(gè)倍半萜類化合物(7，CH50:650.9±1.9 μg·mL-1)和1個(gè)酪醇類化合物(2，CH50:490.5±2.2 μg·mL-1)也顯示中等強(qiáng)度的活性。

圖1 化合物1～10的結(jié)構(gòu)

4 討論

本研究分離得到的10個(gè)化合物中，具有鄰二酚烴基結(jié)構(gòu)的酚酸類和黃酮類成分的抗補(bǔ)體活性普遍較強(qiáng)，其中以咖啡酸(6，CH50:80.0 μg·mL-1)的活性最強(qiáng)。進(jìn)一步對(duì)比發(fā)現(xiàn)，酚酸類成分中含有兩個(gè)咖啡?；?個(gè)化合物(1、3、9)活性明顯強(qiáng)于僅含一個(gè)咖啡酰基的化合物(4)，而且，具有咖啡?；狞S酮類成分(10)活性也明顯強(qiáng)于黃酮母核相同但不含此基團(tuán)的黃酮(5)，提示咖啡?；谖鞑乇饷⒕粘煞值目寡a(bǔ)體活性中發(fā)揮重要的作用。

課題組前期報(bào)道了西藏扁芒菊揮發(fā)油的抗炎、抗病毒活性，以及總多糖的免疫增強(qiáng)活性，并確定了揮發(fā)油的主要揮發(fā)性成分及總多糖的單糖組成[4-5]。本研究進(jìn)一步明確了西藏扁芒菊中酚酸、黃酮等抗補(bǔ)體活性小分子成分，豐富了該傳統(tǒng)藏藥的藥效物質(zhì)研究基礎(chǔ)，為其藥材及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。