基于檸檬酸合成的新型可降解螺釘影像學(xué)和組織學(xué)的研究

李禎，黃海，廖堅文，樊仕才，楊誠

1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院麻醉科，武漢 430071；2.南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，廣東省骨科研究院，廣州510630

理想的生物降解材料基本特征有：①生物相容性；②生物機(jī)械性；③易變形性；④可控降解性；⑤易于細(xì)胞的粘附、增殖和分化等[1]。在前期實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)室與美國賓夕法尼亞大學(xué)材料與生物技術(shù)研究室的楊健教授團(tuán)隊協(xié)作合成檸檬酸多聚體與納米羥基磷灰石復(fù)合高分子材料[Poly（octanediol citrate）-click-Hydroxyl apatite，POC-Click-HA]，用于兔脊柱融合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其具有良好骨融合與骨誘導(dǎo)性能[2]。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上將材料改進(jìn)并加工成為全螺紋松質(zhì)骨螺釘，用于比格犬股骨外髁骨折（AO分型33.B1型）的固定，研究其固定效果及作用機(jī)制，同時使用同等規(guī)格的已應(yīng)用于臨床的聚消旋乳酸高分子材料[Poly（DL-lactide），PDLLA]全螺紋松質(zhì)骨螺釘作為對照，對比兩種材料螺釘固定骨折后的影像學(xué)及組織學(xué)變化；并探討檸檬酸材料在體內(nèi)的作用機(jī)制，期為優(yōu)化這種新型的可吸收內(nèi)固定材料提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 可吸收POC-click-HA松質(zhì)骨螺釘 材料參數(shù)見前期研究[2,3]。電腦繪制螺釘草圖，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入機(jī)械加工軟件，連接數(shù)控機(jī)床，經(jīng)過車外圓、車外形、車螺紋、去毛剌等工序，獲得POC-click-HA松質(zhì)骨螺釘（直徑5.5 mm），包裝好以鈷-60輻射滅菌，備用。

1.1.2 可吸收骨折內(nèi)固定聚消旋乳酸（PDLLA）螺釘 成都迪康中科生物醫(yī)學(xué)材料有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：直徑5.5 mm，全長55 mm，螺紋長50 mm。環(huán)氧乙烷滅菌消毒。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組

成年比格犬9只，雌雄不限，體重8～11 kg，單籠喂養(yǎng)，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（東校區(qū)）提供。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證：SCXK（粵）2011-0029；使用許可證：SYXK（粵）2011-0112。

制作比格犬股骨外髁骨折模型（AO分型為33.B1型），右側(cè)使用POC-click-HA松質(zhì)骨螺釘固定骨折，為實(shí)驗(yàn)組；左側(cè)使用同等長度PDLLA螺釘固定，為對照組。術(shù)后單籠喂養(yǎng)，術(shù)后3 d予每只動物青霉素鈉160萬單位·次-1·日-1肌肉注射，預(yù)防感染。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 術(shù)后第4，8，12周分時間點(diǎn)取材，予以雙側(cè)膝關(guān)節(jié)Micro-CT掃描。拍攝地點(diǎn)為南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院骨與軟骨再生醫(yī)學(xué)研究室，設(shè)備為Scanco μCT80。所有圖片由同一臺機(jī)器攝取。主要觀察骨折愈合進(jìn)度、螺釘內(nèi)固定情況、螺釘周圍新生骨小梁及螺釘-周圍新生骨界面的整合情況。

1.3.2 組織學(xué)染色 獲得標(biāo)本修整至合適大小，硬組織包埋，不脫鈣，切片染色。Masson-Goldner Trichrome染色后觀察螺釘-骨界面（染色后，骨髓和類骨質(zhì)呈紅色，新生骨為淺綠色，礦化骨為綠色）[4]，了解兩種材料誘導(dǎo)新生骨形成情況。

1.3.3 細(xì)胞學(xué)染色和檢測 將生長良好的MC3T3-E1細(xì)胞均勻傳代至孔板培養(yǎng)皿中，所有孔中培養(yǎng)基（α-MEM+10%FBS）加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液（地塞米松0.1 μmol/L+維生素C 50μmol/L+β甘油磷酸鈉10 mmol/L）。分為空白對照組、檸檬酸組和三羧酸循環(huán)抑制劑CPI-613組：將梯度濃度的三羧酸循環(huán)抑制劑CPI-613分別加入4個孔；將梯度濃度的外源性檸檬酸（citric acid，CA）分別加入4個孔；均設(shè)空白參照孔作為對照。成骨誘導(dǎo)7 d后進(jìn)行成骨細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）染色，鑒定成骨細(xì)胞誘導(dǎo)是否成功，并使用檸檬酸濃度檢測試劑盒檢測培養(yǎng)基內(nèi)內(nèi)源性檸檬酸濃度。成骨誘導(dǎo)21 d后進(jìn)行Von Kossa's鈣結(jié)節(jié)染色，鑒定成骨細(xì)胞礦化結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用IBM SPSS Statistics 18.0統(tǒng)計軟件分析處理。計量資料統(tǒng)計描述用均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差（mean、SD）表示。不同組間術(shù)后3個時間點(diǎn)的比較采用析因方差分析法。單獨(dú)效應(yīng)分析采用單因素方差分析法（One-Way ANOVA），方差不齊使用Welch檢驗(yàn)結(jié)果。兩兩比較方差齊采用LSD法，方差不齊使用Games-Howell法，P＜0.05表明具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

實(shí)驗(yàn)動物均存活至實(shí)驗(yàn)完成。術(shù)后精神、食量、活動量逐漸恢復(fù)，1周后即可緩慢步行，4～6周后行走步態(tài)基本正常；傷口均愈合良好，未見明顯紅腫、膿液滲出、竇道形成等并發(fā)癥。

2.2 影像學(xué)結(jié)果

Micro-CT掃描POC-click-HA材料顯示高密度影，PDLLA材料顯示低密度影。兩組螺釘觀察結(jié)果基本一致。4周時骨折無移位，可見骨折處少量骨痂形成；8周時骨折處骨痂均較4周增多；12周時POCclick-HA組骨折線模糊，部分消失，PLLA組骨折線基本消失。術(shù)后4周POC-click-HA螺釘與骨組織結(jié)合弱于PDLLA螺釘；8周兩組螺釘與周圍骨組織逐漸整合，差異不明顯；12周可見兩組材料的螺釘-骨組織均鍵合良好，新形成的骨小梁圍繞螺釘螺紋生長。術(shù)后12周兩組螺釘表面螺紋部分降解，螺釘主體未見明顯降解（圖1）。

2.3 組織學(xué)染色

圖1 Micro-CT掃描結(jié)果，POC-click-HA組螺釘呈高密度影，PDLLA組螺釘呈低密度影術(shù)后4周POC-click-HA螺釘與骨組織結(jié)合弱于PDLLA螺釘，8周兩組差異不明顯，螺釘均與周圍骨組織逐漸整合，12周兩組螺釘-骨組織均鍵合良好，新形成的骨小梁圍繞螺釘螺紋生長Fig.1 Results of the Micro-CT，POC-click-HA group showed high density shadow；PDLLA group showed low density shadowThe combination of POC-click-HA screw and bone was weaker than PDLLA screw at 4 weeks after operation.At 8 weeks,the two groups of screws were gradually integrated with the surrounding bone tissue,with no significant difference.At 12 weeks,the screw-bone tissues of both groups were well bonded

圖2 螺釘-骨組織界面（箭頭）Masson-Goldner Trichrome染色結(jié)果4周POC-click-HA組螺釘周圍可見大量膠原纖維、成骨細(xì)胞和類骨質(zhì)，PDLLA組螺釘-骨界面可見膠原纖維，無類骨質(zhì)產(chǎn)生,8周POC-click-HA組螺釘周圍有部分類骨質(zhì)礦化為新生骨組織，PDLLA組螺釘周圍為成骨細(xì)胞、膠原纖維，未見礦化和新生骨組織,12周POC-click-HA組螺釘周圍完成礦化，存在較多成熟骨小梁，PDLLA組螺釘周圍仍有較多膠原纖維，有少量血管長入和少量礦化。S：螺釘，箭頭示螺釘與骨組織交界部位Fig.2 Masson-Goldner Trichrome staining for the screw-bone tissue interfaceAt 4 weeks,a large amount of collagen fibers,osteoblasts and osteoid were observed around the screw in the POC-click-HA group,while collagen fibers were observed at the screw-bone interface in the PDLLA group,without any osteoid production.At 8 weeks,osteoid mineralized new bone in the POCclick-HA group,while osteoblasts,collagen fibers,new bone issue were observed around the screw in the PDLLA group.At 12 weeks,mature bone trabeculae were around the screw in the POC-click-HA group,while some collagen fibers were around the screws in the PDLLA group,with a few amount of vascular growth and mineralization.S:screw；the arrows indicate the screw-bone tissue interface

在螺釘與骨組織交界部位進(jìn)行觀察：4周時POCclick-HA組螺釘周圍可見大量膠原纖維、成骨細(xì)胞和類骨質(zhì)；PDLLA組螺釘-骨界面可見膠原纖維，無明顯類骨質(zhì)產(chǎn)生。8周時POC-click-HA組螺釘周圍有部分類骨質(zhì)開始礦化，逐步轉(zhuǎn)變?yōu)樾律墙M織；PDLLA組螺釘周圍為成骨細(xì)胞、膠原纖維，未見礦化和明顯的新生骨組織。12周時POC-click-HA組螺釘周圍基本完成礦化，存在較多成熟骨小梁；PDLLA組螺釘周圍仍有較多膠原纖維，有少量血管長入，可見少量礦化。術(shù)后各時間點(diǎn)兩組螺釘周圍均未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(圖2)。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

將濃度為0、5、50及100μmol/L的三羧酸循環(huán)抑制劑CPI-613分別加入正在進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)基中，7 d后使用檸檬酸濃度檢測試劑盒檢測該培養(yǎng)基內(nèi)內(nèi)源性檸檬酸濃度（即細(xì)胞分泌的檸檬酸），結(jié)果顯示，與未加入CPI-613的空白組相比，加入CPI-613后檸檬酸濃度明顯降低，P＜0.05，具有統(tǒng)計學(xué)差異（表1）。成骨培養(yǎng)7 d后ALP染色，結(jié)果顯示抑制劑濃度越高，ALP染色陽性細(xì)胞（成骨細(xì)胞）形成數(shù)量越少（圖3）。將濃度為0、2、20及200μmol/L的外源性檸檬酸（CA）分別加入進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)基中，21 d后行鈣結(jié)節(jié)染色，結(jié)果顯示檸檬酸濃度越高，鈣結(jié)節(jié)形成越多（圖4）。

3 討論

3.1 POC-click-HA骨螺釘生物活性

從POC-click-HA材料結(jié)構(gòu)來說，檸檬酸分子含有4個極性基團(tuán)（羥基和氨基），與骨中的膠原纖維結(jié)構(gòu)比較相似且適合進(jìn)行多聚反應(yīng)，將其聚合后以click化學(xué)方式與65%納米羥基磷灰石（比例同天然骨）復(fù)合在一起，使該復(fù)合物能模仿天然骨形成晶體-膠原復(fù)合結(jié)構(gòu)，既具有合適的生物力學(xué)強(qiáng)度，又具有很強(qiáng)的骨誘導(dǎo)能力[3]。本實(shí)驗(yàn)中螺釘-骨組織界面切片組織學(xué)染色可見，POC-click-HA螺釘被大量膠原纖維、類骨質(zhì)和成骨細(xì)胞所包繞，從4周到12周，新生骨逐漸礦化產(chǎn)生，成熟骨小梁形成，且周圍未見明顯的炎性細(xì)胞；而PDLLA螺釘12周時周圍仍為膠原纖維，新生骨形成較少。表明POC-click-HA螺釘比PDLLA螺釘明顯具有更強(qiáng)的骨誘導(dǎo)能力。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制內(nèi)源性檸檬酸或添加外源性檸檬酸均可對MC3T3-E1細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化產(chǎn)生影響，檸檬酸在成骨細(xì)胞的分化中具有積極作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果也再次印證了本組的一些前期實(shí)驗(yàn)[5,6]。

表1 培養(yǎng)7 d后培養(yǎng)基內(nèi)內(nèi)源性檸檬酸濃度(±s)Tab.1 Citric acid concentration in medium after 7 daysof culture(Mean±SD)

表1 培養(yǎng)7 d后培養(yǎng)基內(nèi)內(nèi)源性檸檬酸濃度(±s)Tab.1 Citric acid concentration in medium after 7 daysof culture(Mean±SD)

注：組間兩兩對比顯示，加入5μmol/L組與加入50μmol/L組的檸檬酸濃度對比P=0.057，其余各組對比均P＜0.05Note:contrast between two groups.The contrast between 5μmol/L of citric acid concentration group and 50μmol/L of citric acid concentration group was P=0.057,the left contract of each group was P＜0.05

圖3 ALP染色結(jié)果MC3T3-E1細(xì)胞成骨誘導(dǎo)7 d加入梯度濃度的三羧酸循環(huán)抑制劑CPI-613，ALP染色陽性細(xì)胞數(shù)量減少，抑制劑濃度越高，陽性細(xì)胞越少Fig.3 ALP staining after 7 days’osteogenic induction of MC3T3-E1.Pictures above indicated the CPI-613 concentration of 0μmol/L、5μmol/L、50μmol/L、100μmol/L.The number of API staining positive cells decreased.The higher concentration of inhibitor,the fewer number of positive cells

圖4 鈣結(jié)節(jié)染色結(jié)果MC3T3-E1細(xì)胞成骨誘導(dǎo)21 d加入梯度濃度的檸檬酸（CA），鈣結(jié)節(jié)增多，檸檬酸濃度越高，鈣結(jié)節(jié)形成越多Fig.4 Von Kossa’s calcium nodule staining results after 21 days’osteogenic induction of MC3T3-E1.Pictures above indicated the exogenous citric acid concentration of 0μmol/L、2μmol/L、20μmol/L、200μmol/L.Calcium nodule increased.The higher concentration of citric acid,the more calcium nodule formed

3.2 POC-click-HA骨螺釘?shù)纳锝到庑?/h3>

在術(shù)后12周，影像學(xué)和組織學(xué)可見POC-click-HA螺釘與周圍骨組織結(jié)合緊密，表面螺紋模糊，部分螺釘有新生骨組織從表面向內(nèi)部生長，表明POCclick-HA螺釘對骨組織的誘導(dǎo)能力很強(qiáng)，提示螺釘正在逐步降解；而PDLLA螺釘未見絲毫降解跡象。理想的可降解材料是材料的降解與骨折的愈合同步，同時力學(xué)強(qiáng)度衰減的速度適宜，骨折部位在愈合的過程中能夠適應(yīng)逐漸增加的外部應(yīng)力刺激，加快新骨的生長速度及其局部微結(jié)構(gòu)的調(diào)整，避免術(shù)后應(yīng)力遮擋效應(yīng)，減少術(shù)后骨折部位骨質(zhì)疏松和再骨折發(fā)生的可能[7]。因此本實(shí)驗(yàn)組計劃下一步通過調(diào)整檸檬酸預(yù)聚物（POC-click）與復(fù)合材料（HA）的比例，優(yōu)化復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)，爭取達(dá)到材料生物降解速度、材料生物力學(xué)強(qiáng)度的保持和骨折愈合速度三者的平衡。

3.3 基于檸檬酸合成的新型材料促進(jìn)骨折愈合的可能機(jī)制

目前尚無特異性抑制內(nèi)源性檸檬酸生成的藥物。文獻(xiàn)記載CPI-613作為丙酮酸脫氫酶的抑制劑，能干擾線粒體的代謝[8]。由三羧酸循環(huán)可知[9,10]，丙酮酸脫氫酶受到抑制后，乙酰-CoA的生成減少，進(jìn)而可導(dǎo)致檸檬酸生成減少[11,12]。因此，本組采用CPI-613作為檸檬酸生成抑制劑，加入進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，并設(shè)置空白對照組，觀察內(nèi)源性檸檬酸減少后是否會影響成骨細(xì)胞分化。結(jié)果證明，內(nèi)源性檸檬酸對成骨細(xì)胞分化具有積極作用。因此推測基于檸檬酸合成的材料在降解過程中釋放檸檬酸促進(jìn)局部成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨整合，這與前期研究成果一致[7,13]。

綜上所述，POC-click-HA松質(zhì)骨螺釘在本實(shí)驗(yàn)過程中，表現(xiàn)出良好骨誘導(dǎo)活性和降解性，具備與新生骨生成速率相一致的適當(dāng)降解速度，而且降解產(chǎn)物不像聚乳酸等材料會造成遲發(fā)性無菌性炎癥、釘?shù)乐車侨芙獾炔l(fā)癥[14～16]，對于比格犬股骨外髁B1型骨折具有較好的內(nèi)固定作用。本組后續(xù)工作是進(jìn)一步優(yōu)化材料的組成和結(jié)構(gòu)，在生物力學(xué)強(qiáng)度和生物降解性二者之間找到最優(yōu)平衡，最終使這種合成方便、價格低廉、易于定型和批量生產(chǎn)的POC-click-HA材料能成為滿足臨床要求的可吸收新型內(nèi)固定物。