高脂血癥大鼠心肌中脂滴分布和H-FABP表達變化

孫曉鵬，郭康，郭志坤

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院河南省組織再生重點實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.周口職業(yè)技術學院，河南 周口 466000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003

心是機體物質代謝非?；钴S的器官，其功能實現(xiàn)依賴于持續(xù)的能量供應，成人心所需的ATP大約70%來源于心肌線粒體中β氧化的脂肪酸[1]。心型脂肪酸結 合 蛋 白（heart type fatty acid binding protein，HFABP）是一種由132個氨基酸組成的小分子可溶性蛋白質，分子量為15 Kda，在心肌細胞質中含量較為豐富，約占胞質蛋白總量的5%～15%，其主要功能是參與轉運脂肪酸到線粒體進行β氧化[2]。有研究表明H-FABP在肌細胞中含量的變化主要與脂肪酸的利用有關[3]。多種生理實驗證實脂肪酸攝取和代謝的增加可以提高H-FABP及其RNA的濃度，表明脂肪酸水平調(diào)控H-FABP基因的表達[4]。目前對H-FABP的研究主要集中于它作為急性心肌梗死的早期生物學標志物，而對其在高脂血癥中的表達研究較少。本實驗通過建立高脂血癥大鼠模型，觀察不同血脂水平大鼠心肌中脂滴含量和心功能，以及相應的H-FABP表達，旨在為進一步研究高脂血癥大鼠心肌脂肪酸的代謝特點和臨床治療高脂血癥提供實驗依據(jù)和理論參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組

清潔級雄性大鼠30只，體重180～200 g，新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物中心提供，隨機分為對照組15只，實驗組15只；每組大鼠根據(jù)取材時間（4周、8周、12周）分為3個亞組，每個亞組5只。

1.2 實驗方法

1.2.1 飼養(yǎng)與采血 對照組大鼠予普通飼料自然喂養(yǎng)，實驗組予高脂飼料自然喂養(yǎng)。分別在飼養(yǎng)4、8、12周檢測血脂。檢測方法：取空腹大鼠，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，眼眶取血1 ml分離血清，全自動生化分析儀檢測總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglycerides，TG）含量。

1.2.2 心功能檢測 采血后應用高頻探頭行二維心超聲檢查，于左側胸骨旁左心室水平做短軸切面采集左室二維圖像，測定左心室舒張末期內(nèi)徑（Lvid：d）、左心室后壁厚度（Plvw：d）及左室射血分數(shù)（LVEF）。

1.2.3 心肌組織病理學觀察 分別在飼養(yǎng)4、8、12周，禁食12 h后，麻醉處死大鼠，取心，10%多聚甲醛固定過夜，30%蔗糖溶液脫水，oct包埋，冰凍切片，厚度8μm，0.5%油紅O避光染色，蘇木素復染，甘油明膠封片觀察。

1.2.4 脂滴透射電鏡觀察 大鼠禁食12 h后，心室切取1 mm×1 mm×1 mm心肌組織，立即放入2.5%的戊二醛中4℃浸泡2 h。PBS漂洗3次，每次15 min，然后放入10 g/L鋨酸中固定2～3 h，PBS漂洗3次，每次15 min，乙醇梯度脫水。純丙酮加包埋液（1：2）室溫過夜，60℃烘箱固化24 h，切片，厚度60 nm。將切片經(jīng)3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，JEM 1200透射電鏡觀察。

1.2.5 H-FABP免疫組化顯色 將各組大鼠心用多聚甲醛固定24 h，30%蔗糖溶液脫水至心沉底。Pbs沖洗，oct包埋，冰凍切片，厚度8μm。37℃溫箱烤片30 min，將切片置于檸檬酸鹽緩沖液中（PH 6.0），微波爐加熱10 min進行抗原修復，自然冷卻至室溫。PBS清洗3次，滴加3%過氧化氫浸泡20 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。而后依次滴加正常山羊血清（北京中杉金橋生物公司）浸泡20 min封閉非特異性抗原，1：200小鼠來源H-FABP抗體（abcam公司）及1：500 HRP標記的山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物公司）進行免疫組化染色，DAB顯色，光學顯微鏡下觀察。

1.2.6 H-FABP免疫熒光顯色 37℃溫箱烤片30 min，將切片置于檸檬酸鹽緩沖液中，于高壓鍋內(nèi)熱處理2 min進行抗原修復。滴加3%過氧化氫浸泡20 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。0.3%Triton浸泡30 min進行細胞膜打孔，而后依次滴加正常山羊血清浸泡20 min，1：200小鼠來源H-FABP抗體（abcam公司）及1：500 CY3（北京中杉金橋生物公司）標記的山羊抗小鼠IgG，DAPI染核，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。

1.2.7 Western blotting蛋白表達 每組取3只大鼠左心室標本分別進行組織勻漿，組織裂解液裂解，取上清液，BCA總蛋白定量，取等量蛋白樣品進行SDSPAGE凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，依次加入1：500小鼠抗H-FABP單克隆抗體以及1：1000山羊抗小鼠HRP標記IgG。ECL發(fā)光檢測，成像，顯影。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 高脂飲食大鼠血脂

實驗組大鼠TG水平在第4周末、第8周末、第12周末明顯高于同期對照組（P＜0.05，P＜0.01），3個實驗階段大鼠TG水平呈現(xiàn)先增高后下降趨勢，但在第4周末與第8周末、第8周末與第12周末的結果比較差異不明顯（P＞0.05）（圖1A）。實驗組大鼠TC水平在第4周末、第8周末、第12周末3個時相點明顯高于同期對照組（P＜0.001），3個實驗時相點TC水平逐漸升高，且差異顯著（P＜0.001，P＜0.01）（圖1B）。

2.2 高脂飲食大鼠心功能

超聲心動圖結果顯示實驗組大鼠Lvid：d、Plvw：d在第4周末、第8周末、第12周末明顯高于同期對照組（P＜0.001，P＜0.01），在第4周末與第8周末、第8周末與第12周末之間比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.01），（圖2C、D），尤其是Plvw：d變化呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢。實驗組大鼠LVEF在第4周末、第8周末、第12周末明顯低于同期對照組（P＜0.001，P＜0.01），第4周末與第8周末比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），第8周末與第12周末比較呈現(xiàn)明顯下降（P＜0.001），（圖2E）。

2.3 高脂血癥大鼠心肌脂滴分布

心肌油紅O染色結果顯示，第4周實驗組大鼠禁食12 h后，心肌內(nèi)有大量的細小脂滴，廣泛分布于肌原纖維之間。而對照組心肌細胞內(nèi)幾乎看不到脂滴存在。脂滴在第4周末含量最多，第8周末、第12周末脂滴含量逐漸減少（圖3A～D）。透射電鏡同樣觀察到在高脂飲食第4周心肌細胞內(nèi)的脂滴最多。在心肌縱切面上，肌原纖維之間出現(xiàn)條狀排列、大小不等的空泡，即脂滴（圖3E～H）。有些細胞的脂滴位于細胞膜下（圖3C）。在橫切面上，脂滴位于線粒體和肌原纖維之間，大小不等，散在分布（圖3F，G）。

圖1 高脂飲食對大鼠血清TG、TC影響A：實驗組和對照組在第4、8和12周TG水平B：實驗組和對照組在第4、8和12周TC水平*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，ns P＞0.05Fig.1 Effects of high fat diet on TGand TCA:the TG levels of experimental group and control group at the4th week,the 8th week and the 12th week；B:the TC levels of experimental group and control group at the4th week,the 8th week and the12th weekNote:*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,ns P＞0.05

圖2 高脂飲食對大鼠心功能影響A：對照組左心室超聲心動圖B：實驗組左心室超聲心動圖C、D、E：實驗組與對照組在第4、8和12周左心室舒張末期內(nèi)徑、左心室厚壁厚度、左心室射血分數(shù)*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001，ns P＞0.05Fig.2 Effects of high-fat diet on cardiac functionA:left ventricular echocardiography in the control group；B:left ventricular echocardiography in the experimental group；C、D、E:the left ventricular diameter at end-diastole,left ventricular thick-wall thickness and left ventricular ejection fraction were measured at the 4th week,the 8th week and the12th week*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001，ns P＞0.05

2.4 高脂血癥大鼠心肌H-FABP的免疫表達

免疫組織化學顯色顯示，實驗組和對照組大鼠各個時相點心肌細胞中H-FABP主要表達于胞漿內(nèi)，呈現(xiàn)棕黃色顆粒。與對照組相比，實驗組在3個時相點的H-FABP表達依次增加，第12周增加最為顯著（圖4）。免疫熒光顯色顯示H-FABP在3個時間點逐漸增強，與免疫組化結果一致（圖5）。Western blotting檢測顯示實驗組大鼠心肌中H-FABP表達量高于對照組，隨著實驗進程H-FABP表達逐漸增加，對照組各時段沒有差異（圖6A、B）。實驗第4周與同期對照組相比表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），（圖6C）。實驗第8周、12周與同期對照組相比表達顯著增多（P＜0.001），（圖6D、E）。

3 討論

圖3 大鼠心肌細胞脂滴A：對照組心肌內(nèi)未見脂滴CON：對照組B～D：光鏡下高脂飲食第4、8和12周心肌細胞脂滴分布（油紅O染色）E～H：電鏡下高脂飲食第4、8和12周心肌細胞脂滴的亞微結構分布E和F為心肌細胞縱切面G和H為心肌細胞橫切面 箭頭示脂滴Fig.3 Lipid droplets in myocardial cells of high-fat diet ratsA:no lipid droplets in myocardial cells of the control group；B～D：the distribution of lipid droplets in myocardial cells under light microscopy at the 4th week,the 8week and the 12 week,oil red O staining；E-H:the ultrastructural distribution of lipid droplets in hyperlipidemic myocardial cells at the 4th week,the 8th week and the 12th week；E and F were the longitudinal sections of cardiomyocytes；G and H were the transverse sections of cardiomyocytes,arrows indicated lipid droplets

圖4 不同階段高脂飲食影響大鼠心肌細胞H-FABP免疫組化表達 CON：對照組Fig.4 Immunohistochemical staining of H-FABP in cardiomyocytes CON:control group

心是人體能量需求較高的器官，為維持正常心功能，需要保證足夠的能量持續(xù)供應心，因此，心肌細胞活動有賴于ATP的持續(xù)生成。在能量代謝過程中，糖和長鏈脂肪酸是心主要的能量來源[5,6]。雖然糖的氧化是心肌ATP的重要來源，但健康成人的心肌ATP 50%～70%來自長鏈脂肪酸[7]。心肌獲得脂肪酸主要來自循環(huán)系統(tǒng)中甘油三酯水解后與白蛋白結合的游離脂肪酸以及極低密度脂蛋白水解的脂肪酸[8]。獲取的脂肪酸除供線粒體氧化供能外，其余部分以三酰甘油的形式儲存于心肌細胞的脂滴中，并在需要時由三酰甘油脂酶（ATGL）水解為脂肪酸和甘油[9]。

長鏈脂肪酸是主要的脂類，但游離長鏈脂肪酸不溶于胞質，它們在細胞內(nèi)的轉運需要脂肪酸結合蛋白幫助。脂肪酸結合蛋白（FABPs）是胞質內(nèi)可溶性的小分子蛋白（14-15Kda）家族，可以結合長鏈脂肪酸[10]。心型脂肪酸結合蛋白（H-FABP）是FABPs家族主要成員，由FABPs3基因編碼，主要分布于心肌和骨骼肌[11]，結合并轉運長鏈脂肪酸至線粒體進行氧化。研究表明，HFABP可以刺激心肌細胞肥大[12]。H-FABP近年來作為心肌梗死早期生物學標志物越來越被重視，據(jù)載，在急性心肌梗死30 min內(nèi)，H-FABP從胞質釋放入血液循環(huán)[13]。

高脂血癥是冠心病最大的風險因子[14]，高脂血癥是指血清TC、TG、LDL、VLDL升高和HDL降低，其中高膽固醇血癥和高甘油三酯血癥與缺血性心病密切相關[15]。高脂血癥患者血液中膽固醇和甘油三酯水平升高，心肌細胞攝入的脂肪酸隨之增加，作為長鏈脂肪酸的轉運蛋白H-FABP表達也會增高，但對于高脂血癥患者H-FABP的表達和血脂水平的關系以及對心肌脂肪酸代謝的影響卻鮮有研究。

圖5 大鼠心肌細胞H-FABP免疫熒光表達A～C：對照組CON：對照組D～F：實驗4周組G～I：實驗8周組J～L：實驗12周組A、D、G、J：H-FABP表達B、E、H、K：Dapi標記細胞核 C、F、I、L：前兩列的疊加Fig.5 Immunofluorescence expression of H-FABP in cardiomyocytes of hyperlipidemic ratsA-C:control group；D-F:the 4 week experimental group；G-I:the 8 week experimental group；J-L,the 12 week experimental group；A，D，G，J:H-FABP expression；B，E，H，K:dapi labeled nucleus；C，F(xiàn)，I，L:merged the first two columns

本研究通過生化指標的檢測，運用油紅O染色光鏡和電鏡觀察大鼠心肌組織脂滴沉積變化，以及對H-FABP的免疫組化、免疫熒光，Western blotting表達和心功能進行檢測，初步揭示了高脂血癥大鼠心肌脂肪酸代謝的特點以及心肌形態(tài)和功能的影響。結果顯示，隨著高脂飼料喂養(yǎng)時間的延長TC水平顯著升高，而TG水平增加不明顯，并在第12周末出現(xiàn)降低。這種現(xiàn)象在其它實驗的造模過程中也曾出現(xiàn)，可能機制是脂質代謝紊亂加重及血中TG水平升高，肝起到貯存TG的緩沖作用，大量的TG向肝內(nèi)轉移，肝功能損傷至一定程度時，其代謝轉運TG的能力便會大大減弱[16]。組織學結果顯示，高脂血癥大鼠心肌細胞內(nèi)肌原纖維間出現(xiàn)脂滴儲積，而正常大鼠心肌細胞中無明顯脂滴，說明高脂飲食使心肌的脂肪酸攝入增多，超過了心肌脂肪酸的β氧化能力，多余的脂肪酸以甘油三酯形式貯存在心肌細胞的脂滴內(nèi)，最終導致心肌發(fā)生脂肪變性。但是本實驗還顯示，隨著高脂飲食時間延長，血脂濃度升高，反而導致大鼠心肌內(nèi)的脂滴減少。如何解釋這一看似相互矛盾的現(xiàn)象？通過免疫組化、免疫熒光和Western blotting表達顯示，隨著造模時間的延長心肌H-FABP表達量逐漸增加，這可能是高脂飲食持續(xù)一定時間后心肌內(nèi)脂滴下降的根本原因。因為H-FABP主要作用是轉運脂肪酸至線粒體進行β氧化，H-FABP增多，脂滴分解加快，脂肪酸的β氧化增加，心肌細胞內(nèi)的脂滴數(shù)量也會減少。如果繼續(xù)延長高脂飲食喂養(yǎng)時間，是否會出現(xiàn)HFABP下降（衰竭），心肌細胞內(nèi)的脂滴再次增多，加重心肌變性，而導致心功能障礙等，尚需進一步研究。

圖6 對照組與高血脂大鼠心肌組織H-FABP的表達CON：對照組ns P＞0.05，***P＜0.001Fig.6 Expression changes of H-FABP in myocardium of hyperlipidemia rats in the control groupCON:control group,ns P＞0.05,***P＜0.001

有大量的證據(jù)表明脂質及其代謝的中間產(chǎn)物可以導致心肌的脂毒性損傷，心肌脂毒性可以造成心肌胰島素抵抗，心肌細胞凋亡和心收縮功能障礙[1]。在脂肪酸的氧化過程中會伴隨活性氧簇（reactive oxygen stress，ROS）的產(chǎn)生，ROS增加可誘導心肌肥厚和心肌細胞功能紊亂[17]。本研究通過二維超聲心動圖檢測發(fā)現(xiàn)高脂血癥大鼠與對照組相比Lvid：d明顯增大、Plvw：d明顯增厚，LVEF明顯下降，隨著血脂濃度的升高這種變化更為顯著。這表明高血脂已明顯影響大鼠的心功能。但本研究發(fā)現(xiàn)大鼠心肌內(nèi)脂滴的增多與心功能變化并不一致，脂滴明顯增多時，心功能下降反不明顯，隨著脂滴數(shù)量的減少心功能出現(xiàn)明顯下降。這種結果可能與高血脂大鼠心肌的脂毒性損傷有關。因為心肌脂肪酸的β氧化增多，同時伴隨ROS生成增加，導致對心肌細胞造成損傷，另外H-FABP高表達也可以造成對心肌細胞的刺激[12]。

綜上所述，高脂飲食可使大鼠心肌內(nèi)脂滴增多，心肌發(fā)生脂肪變性，隨著血脂濃度的升高，H-FABP的表達明顯增加，心肌脂肪酸的β氧化增強，心肌中脂滴含量減少，但心功能下降。然而相關機制仍不清楚，需要進一步探索。