幼期相對低劑量X線輻射對小鼠成年后學(xué)習(xí)記憶及海馬神經(jīng)發(fā)生的影響

曾蕾，紀(jì)濤濤，周霖，柯祥杰，趙艷生，楊波,2，任伯緒，唐鋒儒

1.十堰市人民醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院）放射影像中心，湖北 十堰 442000；2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，武漢 430071；3.長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023；4.新加坡國立大學(xué)，新加坡核研究與安全倡議研究所，輻射生理實(shí)驗(yàn)室，新加坡138062

相對高劑量電離輻射（＞10 Gy）如放療，尤其是針對腦或頭頸部腫瘤的放射治療會造成病人學(xué)習(xí)記憶障礙[1,2]。臨床研究表明，輻射所導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶下降在腦腫瘤放療后長期幸存的患者中發(fā)生率高達(dá)50%[3]；動物研究也證實(shí)在高劑量的輻射暴露后，嚙齒類動物表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶損害[4]。這些學(xué)習(xí)記憶損害表現(xiàn)多樣化，但是主要與海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶下降有關(guān)，比如學(xué)習(xí)、記憶、注意力、執(zhí)行力和空間處理能力的降低[5～7]。大量的臨床前期研究證明電離輻射所致的學(xué)習(xí)記憶損害與海馬齒狀回顆粒下層神經(jīng)元再生能力下降密切相關(guān)[8]。電離輻射所致學(xué)習(xí)記憶改變與射線種類、劑量、劑量率、輻射方式（單次或分割）、生物體種類、品系、所處的發(fā)育階段、輻射后認(rèn)知能力檢測時間點(diǎn)等因素皆相關(guān)[9～12]。當(dāng)劑量相同時，年齡則是輻射所致神經(jīng)行為學(xué)變化的重要易感因素，生長發(fā)育期的兒童會比成年人遭受更嚴(yán)重的學(xué)習(xí)記憶損害，其發(fā)生的機(jī)制可能也不完全相同[12～15]。然而目前研究大部分集中于成人、胚胎/胎兒受放療或高劑量輻射暴露后認(rèn)知能力的改變[16,17]。對輻射所致學(xué)習(xí)記憶改變，大部分神經(jīng)行為學(xué)檢測是輻射后短時期內(nèi)測得，輻射所致長期學(xué)習(xí)記憶的改變?nèi)孕栝L時間的觀測和分析[18]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上[11,18,19]，進(jìn)一步研究小鼠幼期接受相對低劑量的輻射（0.1～10 Gy）其成年后學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)發(fā)生的改變，闡述相對低劑量電離輻射、學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)發(fā)生之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級出生21 d昆明小鼠購自湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心（許可證號：SCXK(鄂)2018-0018），小鼠體重約（9.6±0.7）g。在室溫18～25℃、相對濕度50%～60%自然環(huán)境中用營養(yǎng)飼料分籠飼養(yǎng)，小鼠自由攝食及飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 輻射損傷模型建立 小鼠隨機(jī)分為2組：正常對照組、5 Gy輻射組，每組10只。輻射組小鼠放入小動物輻射研究專用容器，射線源來自直線加速器（瑞典，Elekta），射線中心線高度和小鼠身體中心平齊，輻射組設(shè)置輻射劑量為5 Gy。

1.2.2 體重變化檢測 分別測量小鼠在2月齡、4月齡的體重，與21 d的體重作比較，比較輻射處理后至小鼠青春后期（21 d～2月齡）、至成年期（21 d～4月齡）的體重變化百分比。

1.2.3 曠場實(shí)驗(yàn) 采用上海欣軟信息科技有限公司曠場實(shí)驗(yàn)裝置、錄像及分析系統(tǒng)。操作者輕抓4月齡小鼠放在箱底中央，系統(tǒng)同步記錄小鼠5 min內(nèi)自由探索的總路程[20]。

1.2.4 新物體識別實(shí)驗(yàn) 采用上海欣軟信息科技有限公司新物體識別實(shí)驗(yàn)裝置、錄像及分析系統(tǒng)，對4月齡小鼠行新物體識別實(shí)驗(yàn)[21]。實(shí)驗(yàn)分3個階段進(jìn)行。適應(yīng)期：第1～2 d，每天讓小鼠在實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)自由活動30 min；熟悉期：第3 d，將O、F兩個相同物體分別放在實(shí)驗(yàn)箱中，同步記錄15 min內(nèi)小鼠對兩物體的探索情況，以小鼠鼻子或嘴巴接觸物體或距物體≤2 cm有效；測試期：第4 d，將物體O替換為物體N（N不同于O、F），記錄時間為5 min，其余步驟與熟悉期相同，每只小鼠在兩物體上的探索時間記為F、N。本實(shí)驗(yàn)以辨別指數(shù)（identify index，DI）評價小鼠對新舊物體的識別記憶能力，計算公式為：DI=（N-F）/（N+F）。

1.2.5 條件性恐懼實(shí)驗(yàn) 采用上海欣軟信息科技有限公司小鼠條件性恐懼實(shí)驗(yàn)裝置、錄像及分析系統(tǒng)，對4月齡小鼠行條件性恐懼實(shí)驗(yàn)[22]。實(shí)驗(yàn)分為2個時期。訓(xùn)練期：將小鼠放入斯金納箱中適應(yīng)2 min后，給予20 s的聲刺激（80 dB，1000 Hz）和2 s的足部電刺激（0.85 mA），聲電刺激同步結(jié)束，間隔60 s后重復(fù)1次聲、電刺激。測試期：訓(xùn)練結(jié)束后分別于24 h和（24+1）h行環(huán)境關(guān)聯(lián)性和線索關(guān)聯(lián)性恐懼測試，環(huán)境關(guān)聯(lián)恐懼測試中不給予聲電刺激，記錄小鼠280 s內(nèi)小鼠僵直時間。線索關(guān)聯(lián)性恐懼測試中給予聲刺激但不給予電刺激，記錄280s內(nèi)小鼠僵直時間。本實(shí)驗(yàn)以測試期小鼠分別在環(huán)境關(guān)聯(lián)性和線索關(guān)聯(lián)性恐懼測試中280 s內(nèi)僵直時間（s）作為恐懼學(xué)習(xí)記憶的指標(biāo)。

1.2.6 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 采用上海欣軟信息科技有限公司水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置、錄像及分析系統(tǒng)，對4月齡小鼠行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[23]。實(shí)驗(yàn)分為兩個階段。（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：歷時5 d。第1 d，從池壁4個象限中第1象限的中點(diǎn)將小鼠放入水中，記錄小鼠找到平臺所用的時間，即逃避潛伏期（s）。若小鼠60 s內(nèi)找到水下平臺則逃避潛伏期記為X s，并在平臺上休息15 s；若60 s內(nèi)未找到平臺則逃避潛伏期記為60 s，則將小鼠引導(dǎo)上平臺，同樣在平臺上休息15 s。每個象限實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠休息60 s再進(jìn)行下一象限實(shí)驗(yàn)，直至4個象限實(shí)驗(yàn)完成。后4 d重復(fù)操作同第1 d。（2）空間探查試驗(yàn)：第6 d撤去平臺，將小鼠從原平臺所在象限的對側(cè)象限入水，記錄小鼠在60 s內(nèi)穿越原平臺的次數(shù)。本實(shí)驗(yàn)以小鼠在定位航行實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期t（s）和空間探查實(shí)驗(yàn)中穿越原平臺的次數(shù)n（次）作為小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的指標(biāo)。

1.2.7 取材及冰凍切片制作 將6月齡小鼠用1%戊巴比妥鈉（0.01 ml/g）腹腔注射麻醉后剪開胸腹腔，暴露肝及心，取灌注針自心尖向右上45°進(jìn)針至主動脈起始端，用止血鉗固定針頭，剪破右心耳，快速灌注生理鹽水約30 ml至肝變白，換4%多聚甲醛200 ml灌注。最后剪開顱骨，斷頭剝離腦組織并放入4%多聚甲醛后固定24 h后轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液中4℃保存直至組織沉入瓶底。將小鼠腦組織從30%蔗糖溶液中取出，沿正中矢狀位剖開。取其中一半腦組織用OCT包埋后行液氮冷凍，恒溫冰凍切片機(jī)（德國，Leica）連續(xù)切片，片厚約40μm，將含海馬組織的切片依次放入裝有0.1 M PB溶液的24孔板的其中4孔內(nèi)，最終每孔內(nèi)含約6～8片含海馬組織的腦片。

1.2.8 免疫組化染色 采用SABC法進(jìn)行免疫組化染色。腦片用0.1 mol/L PBS洗滌3次，經(jīng)3%H2O210 min、山羊血清2孔（1：50，Vector公司，瑞士）和驢血清1孔（1：50，Santa Cruz公司，美國）室溫封閉2 h，吸棄封閉液后一孔山羊血清中加入一抗Ki67（1：200，GeneTex公司，美國），和另一份山羊血清中加入一抗PV（1：4000，Swant公司，美國），驢血清中加入一抗DCX（1：200，Santa Cruz公司，美國）4℃過夜孵育，PBST（PBS中加入0.1%Triton-X100，pH 7.6）洗滌3次，加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1：100，Vector公司，瑞士）和驢抗山羊IgG（1：100，Santa Cruz公司，美國）室溫孵育1 h；PBST洗滌后AB液（1：50，Vector公司，瑞士）孵育0.5 h，最后DAB（Vector公司，瑞士）顯色，裱片后顯微鏡觀察結(jié)果并照相。

1.2.9 細(xì)胞計數(shù) 各組取自每只小鼠一半腦組織含海馬結(jié)構(gòu)的片子（8～10片）納入觀察。每一張切片在10×10倍鏡下采用Immage-pro plus軟件（IPP，6.0）計數(shù)海DG區(qū)各指標(biāo)單位面積陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 體重增加量檢測結(jié)果

5 Gy輻射組小鼠在輻射期（21 d）至青春后期（2月齡）期間體重增加百分比（150.34±23.46）%低于對照組（191.44±15.11）%，t=3.02，*P＜0.05；在輻射期至成年期（4月齡）輻射組小鼠體重增加百分比（199.01±21.93）%顯著低于對照組（260.31±21.27）%，t=4.22，**P＜0.01，見圖1。

圖1 兩組小鼠2月齡（*P＜0.05，n=10）和4月齡體重增加百分比的比較（**P＜0.01，n=10）Fig.1 Comparison of body weight gain percentage at 2 months(*P＜0.05,n=10)and 4 months(**P＜0.05,n=10)of agebetween thetwo groups

2.2 行為學(xué)測試結(jié)果

2.2.1 曠場實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果 對照組、5 Gy輻射組小鼠4月齡在曠場實(shí)驗(yàn)中5 min內(nèi)自由探索總路程分別為（33055.92±2601.40）mm、（37773.01±5086.99）mm，無統(tǒng)計學(xué)差異（t=-1.672，P＞0.05），見圖2。

2.2.2 新物體識別實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果 對照組、5 Gy輻射組小鼠4月齡在新物體識別實(shí)驗(yàn)中對新舊物體的識別能力（DI）分別為（0.70±0.15）、（0.61±0.21），無統(tǒng)計學(xué)差異（t=0.753，P＞0.05），見圖3。

2.2.3 條件性恐懼實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果 對照組、5 Gy輻射組小鼠4月齡在條件性恐懼實(shí)驗(yàn)中環(huán)境關(guān)聯(lián)性恐懼的僵直時間分別為（12.31±4.43）s、（19.59±6.39）s，無統(tǒng)計學(xué)差異（t=-0.885，P＞0.05）；線索關(guān)聯(lián)性恐懼的僵直反應(yīng)時間分別為（42.70±21.78）s、（39.08±12.88）s，亦無統(tǒng)計學(xué)差異（t=0.15，P＞0.05），見圖4。

2.2.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果 經(jīng)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測試，對照組、5 Gy輻射組小鼠在定位航行中第1～5 d內(nèi)每天逃避潛伏期無統(tǒng)計學(xué)差異（F=2.30，P＞0.05）；在空間探查實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠60 s內(nèi)穿越平臺的次數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異（t=-1.07，P＞0.05）,具體見表1，圖5。

圖2 曠場實(shí)驗(yàn)測試，兩組小鼠5 min內(nèi)自由探索度無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，n=10）Fig.2 Comparison of distance traveled within 5 min in the open field test between the two groups(P＞0.05,n=10)

圖3 新物體識別實(shí)驗(yàn)測試，兩組小鼠對新舊物體辨別能力無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，n=10）Fig.3 Comparison of recognition memory between the two groups of mice in the new object recognition experiment(P＞0.05,n=10)

2.3 免疫組化檢測結(jié)果

2.3.1 Ki67標(biāo)記的陽性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果 兩組小鼠海馬SGZ區(qū)均可見棕黃色ki67核蛋白表達(dá)；5 Gy輻射組海馬SGZ區(qū)Ki67陽性細(xì)胞數(shù)為（40.00±19.06）/mm2，低于對照組（66.10±22.47）/mm2，t=2.80，*P＜0.05，見圖6。

2.3.2 DCX標(biāo)記的陽性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果 兩組小鼠海馬DG區(qū)均可見棕黃色DCX蛋白表達(dá)，主要定位于神經(jīng)元胞漿、樹突和軸突，其突起穿過顆粒細(xì)胞層到達(dá)分子層；5 Gy輻射組海馬DG區(qū)DCX陽性神經(jīng)元為（66.90±46.05）/mm2，顯著低于對照組（315.20±109.20）/mm2，t=6.63，***P＜0.001，見圖7。

2.3.3 CB標(biāo)記的陽性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果 兩組小鼠海馬DG區(qū)均可見棕黃色CB蛋白表達(dá)，主要定位于DG區(qū)顆粒細(xì)胞層神經(jīng)元胞體的胞漿；5 Gy輻射組小鼠海馬DG區(qū)CB陽性神經(jīng)元為（1000±353）/mm2，顯著低于對照組（2061±822）/mm2，t=3.75，**P＜0.01，見圖8。

2.3.4 PV標(biāo)記的陽性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果 兩組小鼠海馬DG區(qū)均可見棕黃色PV蛋白表達(dá)，主要定位于DG區(qū)神經(jīng)元胞體的胞漿、樹突。5 Gy輻射組小鼠海馬DG區(qū)PV陽性神經(jīng)元為（18.70±10.59）/mm2，顯著低于對照組（66.60±26.03）/mm2，t=5.39，***P＜0.001，見圖9。

3 討論

圖4 條件性恐懼實(shí)驗(yàn)測試，兩組小鼠環(huán)境關(guān)聯(lián)性僵直時間（A）與線索關(guān)聯(lián)性僵直時間（B）均無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05，n=10Fig.4 Comparison of contextual memory related freezing time(figure A,P＞0.05,n=10))and clued memory related freezing time(figure B,P＞0.05,n=10))in conditioned fear experiment between the two groupsof mice

高劑量的電離輻射會擾亂生長發(fā)育、造成內(nèi)分泌紊亂及學(xué)習(xí)記憶下降[1,2]。臨床研究表明電離輻射所致的海馬損傷在接受全腦或局部輻射后的病人的神經(jīng)認(rèn)知下降中扮演著重要角色，尤其會引起與學(xué)習(xí)、記憶和空間信息處理能力相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶損害[5～7]。動物研究表明電離輻射后海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶的下降主要?dú)w因于神經(jīng)發(fā)生能力的減弱[8]。

表1 小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s,n=10）Tab.1 Comparison of escaping latency in the spatial reference memory task and the platform crossing times in the probe test in Morris water maze between the two groups of mice（Mean±SD,n=10）

表1 小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s,n=10）Tab.1 Comparison of escaping latency in the spatial reference memory task and the platform crossing times in the probe test in Morris water maze between the two groups of mice（Mean±SD,n=10）

注：與對照組相比，P＞0.05Compared with control group,P＞0.05

圖5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，兩組小鼠逃避潛伏期（A）與穿越平臺次數(shù)（B）均無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05，n=10Fig.5 Comparison of escaping latency in the spatial reference memory task(figure A,P＞0.05,n=10),and the platform crossing times in the probe test in Morris water maze between the two groups of mice(figure B,P＞0.05,n=10)

圖6 免疫組化檢測小鼠海馬SGZ區(qū)的Ki67陽性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果A：對照組腦片鏡下觀B：5 Gy輻射組腦片鏡下觀C：統(tǒng)計圖箭頭所指為Ki67陽性細(xì)胞*P＜0.05,n=10Fig.6 The Ki67 immunopositive cells in the SGZ of hippocampusA:Brain immunohistochemical image of the control group mice B:Brain immunohistochemical image of the 5 Gy irradiation group mice C:Statistical diagram of thetwo groupsThe Ki67 positive cells was indicated by the arrows,*P＜0.05,n=10

圖7 小鼠海馬DG區(qū)DCX陽性神經(jīng)元表達(dá)檢測結(jié)果（×20）A：對照組腦片鏡下觀B：5 Gy輻射組腦片鏡下觀C：統(tǒng)計圖箭頭所指為DCX陽性神經(jīng)元***P＜0.001 n=10Fig.7 The DCX immunopositive neurons in the DG of hippocampus(×20)A:Brain immunohistochemical image of the control group mice B:Brain immunohistochemical image of the 5 Gy irradiation group mice C:Statistical diagram of thetwo groupsThe DCX positiveneurons was indicated by the arrows,***P＜0.001,n=10

圖8 小鼠海馬DG區(qū)CB陽性神經(jīng)元表達(dá)檢測A：對照組腦片鏡下觀B：5 Gy輻射組腦片鏡下觀C：統(tǒng)計圖 箭頭所指為CB陽性神經(jīng)元***P＜0.01 n=10Fig.8 The CB immunopositive interneurons in the DG of hippocampusA:Brain immunohistochemical image of the control group mice B:Brain immunohistochemical image of the 5 Gy irradiation group mice C:Statistical diagram of the two groups The CB positive interneurons was indicated by the arrows,***P＜0.01,n=10

輻射劑量是衡量能否產(chǎn)生認(rèn)知缺陷的一個關(guān)鍵因素。多個團(tuán)隊(duì)研究證實(shí)輻射所導(dǎo)致條件性恐懼記憶、空間記憶的下降呈劑量依賴性[24]。Ji等[25]觀察到1次30 Gy（而不是10 Gy）的輻射劑量會造成大鼠學(xué)習(xí)記憶損害，此外，輻射持續(xù)抑制BDNF基因的轉(zhuǎn)錄與海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的長期損害有關(guān)。有學(xué)者[1]發(fā)現(xiàn)1次10 Gy的輻射劑量會造成小鼠海馬依賴性空間學(xué)習(xí)記憶能力的下降，但是海馬大體結(jié)構(gòu)并沒有明顯變化。Rola等[26]報道了在輻射劑量降至5 Gy時，對出生21 d的小鼠進(jìn)行1次輻射，3個月后觀察到海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生能力及海馬依賴性記憶功能的下降。本團(tuán)隊(duì)前期的研究表明，5 Gy的輻射劑量會造成小鼠在條件恐懼實(shí)驗(yàn)中環(huán)境關(guān)聯(lián)性恐懼學(xué)習(xí)記憶及新物體識別實(shí)驗(yàn)中辨別記憶能力的下降，同時觀察到海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生能力的下降[11]。本實(shí)驗(yàn)中相同劑量的輻射（5 Gy）并未造成成年后小鼠自由活動能力、物體識別記憶、環(huán)境相關(guān)性及線索相關(guān)性恐懼記憶、空間信息處理能力的改變，可能與輻射所用的射線種類、能量高低、劑量率、小鼠品系、行為學(xué)測試時間點(diǎn)等其他一系列復(fù)雜因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中所用的X射線的輻射損傷作用比γ射線要弱；昆明小鼠可能比相同周齡的BALB/c小鼠更抗輻射；輻射后檢測期的延長可能導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶損害程度的減弱或者部分恢復(fù)。神經(jīng)發(fā)生能力降低與前期研究結(jié)果一致，表明5 Gy的輻射劑量足以造成海馬神經(jīng)發(fā)生能力的損害。

輻射產(chǎn)生時生物所處的發(fā)育階段是影響輻射后認(rèn)知效果的另一重要因素[27]。研究表明，年長的動物在輻射后并未表現(xiàn)出持續(xù)性的未成熟神經(jīng)元和成熟神經(jīng)元的缺失，但是表現(xiàn)出顯著的炎癥反應(yīng)，這與年幼動物在輻射損傷后主要表現(xiàn)出神經(jīng)發(fā)生的減弱不同，而輻射后年幼和年長動物表現(xiàn)出的學(xué)習(xí)記憶損害卻有很多相同之處[28]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)暧讋游镙椛浜笊窠?jīng)發(fā)生和成熟神經(jīng)元的減弱一直持續(xù)至成年期，與輻射損傷神經(jīng)發(fā)生過程中神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分裂、分化、遷移、成熟一系列進(jìn)程受損密切相關(guān)。

輻射所致的神經(jīng)發(fā)生和學(xué)習(xí)記憶的損害在短期效應(yīng)和長期效應(yīng)的檢測中也是多變和復(fù)雜的[29,30]。比如在認(rèn)知層面，Zhou等[30]發(fā)現(xiàn)年幼的大鼠接受1次20 Gy或40 Gy的輻射，4周后均表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶損害，8周后測試只有接受40 Gy輻射的大鼠表現(xiàn)出認(rèn)知損害，12個月后兩組大鼠已檢測不到認(rèn)知損害。在神經(jīng)發(fā)生層面，Silasi等[31]實(shí)驗(yàn)中小鼠接受1次0.5 Gy的X線輻射2 h后未檢測到神經(jīng)發(fā)生下降，但是12 h后卻檢測到凋亡細(xì)胞明顯增加、神經(jīng)發(fā)生明顯下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，2周后神經(jīng)發(fā)生可以恢復(fù)到正常水平[32]。本實(shí)驗(yàn)中小鼠出生21 d時接受5 Gy劑量的X線輻射，4個月后檢測到海馬DG區(qū)神經(jīng)再生的損害，說明幼期5 Gy劑量的輻射可造成小鼠神經(jīng)再生減弱長久持續(xù)存在且不能逆轉(zhuǎn)到正常水平；但是，學(xué)習(xí)記憶未檢測到損害，可能表明當(dāng)神經(jīng)元數(shù)量降低到一定程度時才會引起學(xué)習(xí)記憶缺陷，或是大腦通過增強(qiáng)其它執(zhí)行相同功能的神經(jīng)元的作用對抗損害的神經(jīng)功能，或是小鼠在生長發(fā)育過程中大腦通過修復(fù)作用修復(fù)了部分缺失的神經(jīng)元的功能，亦或是大腦通過其他神經(jīng)元或腦區(qū)/核團(tuán)的代償/替代作用彌補(bǔ)了缺失的認(rèn)知功能。

神經(jīng)發(fā)生包括神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分裂、分化、遷移、成熟等一系列連續(xù)進(jìn)程，各階段表達(dá)不同的神經(jīng)元標(biāo)記物。Ki67僅在周期性分裂的細(xì)胞核中表達(dá)，其表達(dá)隨細(xì)胞周期進(jìn)展而增加，在G0期和G1早期不表達(dá)，G1中期到后期開始出現(xiàn)，S期的后半程增加明顯，G2、M期到達(dá)高峰[33]。Ki67在海馬齒狀回SGZ區(qū)的陽性表達(dá)即為SGZ區(qū)神經(jīng)發(fā)生中處于增殖期的神經(jīng)元。本實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠SGZ區(qū)Ki67陽性細(xì)胞數(shù)的顯著差異說明了21 d時5 Gy的X線輻射劑量對小鼠神經(jīng)發(fā)生過程中神經(jīng)元的分裂增殖具有損害作用，已直接或間接導(dǎo)致了海馬SGZ區(qū)分裂增殖的神經(jīng)元的減少。雙皮質(zhì)素（doublecortin，DCX）主要表達(dá)于遷移中的神經(jīng)元胞體和前導(dǎo)突起上以及分化中的神經(jīng)元軸突，故常用來鑒定未成熟神經(jīng)元[34]。本實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠DG區(qū)DCX陽性細(xì)胞數(shù)的顯著差異說明了21 d時5 Gy的輻射劑量對小鼠神經(jīng)發(fā)生過程中神經(jīng)元的遷移分化具有抑制作用，已直接或間接引起了海馬DG區(qū)處于遷移、分化中的未成熟神經(jīng)元的減少。鈣結(jié)合蛋白（calcium-binding proteins，CBP）：Calbindin（CB），Calretinin（CR）和Parvalbumin（PV）表達(dá)于成熟的中間神經(jīng)元，代表著海馬GABA能中間神經(jīng)元的3個群體，具有各自的分布和功能特點(diǎn)[35]。本實(shí)驗(yàn)兩組小鼠CB、PV陽性細(xì)胞數(shù)的顯著差異說明了21 d時5 Gy的X線輻射劑量對小鼠神經(jīng)發(fā)生或成熟神經(jīng)元具有損傷作用，已直接或間接導(dǎo)致了海馬DG區(qū)成熟、中間神經(jīng)元的減少。

電離輻射所致的學(xué)習(xí)記憶損害取決于一系列因素，這些因素間相互或共同協(xié)作，由此導(dǎo)致復(fù)雜多變的學(xué)習(xí)記憶缺陷，其機(jī)制更是撲朔迷離、爭議不斷。神經(jīng)發(fā)生減弱是學(xué)習(xí)記憶下降的一個重要機(jī)制。研究輻射所致的認(rèn)知功能的損害及其機(jī)制需要綜合考慮各種因素更加詳盡細(xì)致深入地分析，進(jìn)而為輻射防護(hù)提供參考，為研究開發(fā)抗輻射藥物、修復(fù)輻射所致認(rèn)知及神經(jīng)損傷的藥物提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。