海藻酸鈉微膠囊制備及其在微生物包埋中的應(yīng)用

項(xiàng)鄭昊， 周化嵐， 張建國(guó)

上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院 食品科學(xué)與工程研究所， 上海 200093

微膠囊(microcapsules)是應(yīng)用天然或人工合成的高分子成膜壁材，將固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)的物質(zhì)作為芯材，包裹成具有半通透性或密封的球形微粒。微膠囊作為微型容器具有保護(hù)芯材的作用。微膠囊的制備工藝流程影響微膠囊粒徑尺寸。微膠囊粒徑一般在1 μm ～ 1 000 μm范圍內(nèi)。通常情況下，微膠囊呈固態(tài)球形結(jié)構(gòu)，微膠囊具有隔絕外界不良環(huán)境(過高的pH、溫度、酶)，改變芯材的內(nèi)在性質(zhì)(屏蔽氣味、毒性、顏色)，控制芯材的釋放時(shí)間等作用?，F(xiàn)今微膠囊已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、化工、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。海藻酸鈉(sodium alginate, SA)是由β-D-甘露糖醛酸(M單元)與α-L-古洛糖醛酸(G單元)通過β-1,4-糖苷鍵連接，形成不同比例的GM、MM和GG片段組成的多糖[1]。海藻酸鈉由于其優(yōu)良的穩(wěn)定性、溶解性、粘性和安全性以及生物相容性，是良好的微膠囊外殼組成物質(zhì)，而且海藻酸鈉儲(chǔ)量豐富、可再生，海藻酸鈉制備的微膠囊被廣泛應(yīng)用。近年來，海藻酸鈉微膠囊的制備十分受關(guān)注，主要體現(xiàn)在微膠囊直徑的控制，保護(hù)芯材性質(zhì)、微生物包埋等方面。海藻酸鈉微膠囊的制備方法主要有擠壓法、噴霧干燥法、乳化凝膠法、層層組裝法，其影響因素主要有海藻酸鈉分子量和濃度、輔助材料種類和濃度、交聯(lián)時(shí)間、操作因素等。本文對(duì)海藻酸微膠囊的制備及其在微生物包埋的進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)和展望。

1 海藻酸鈉微膠囊制備方法

海藻酸鈉微膠囊制備方法分為物理法、化學(xué)法和物理化學(xué)法三類。物理法通過物理、機(jī)械作用將壁材包覆在小分子芯材上，例如空氣懸浮法[2]、溶劑揮發(fā)法[3]、噴霧干燥法[4]等?；瘜W(xué)法指化合物單體通過聚合反應(yīng)形成聚合物外殼，再將芯材包覆，例如擠壓法、界面縮聚法[5]、原位聚合法[6]等。物理化學(xué)法通過添加溶劑(無(wú)機(jī)鹽、非電解質(zhì))或調(diào)節(jié) pH，改變溫度等措施調(diào)節(jié)聚合物溶解度，使聚合物從溶液中析出并沉積在芯材表面，形成微膠囊，例如相分離法[7, 8]、層層組裝法[9]等。目前制備海藻酸鈉微膠囊的常用方法有噴霧干燥法、擠壓法、乳化凝膠法、層層組裝法。

1.1 噴霧干燥法

噴霧干燥法是將芯材和壁材混合溶液以液滴狀態(tài)噴到熱空氣中，水分蒸發(fā)而得到球狀粉末的過程。噴霧干燥法操作也較簡(jiǎn)單、成本低、應(yīng)用廣泛。噴霧干燥法制備微膠囊直徑取決于噴嘴類型、進(jìn)料速率、空氣流速、入口溫度、吸氣速率和材料性能等諸多參數(shù)[10, 11]。許多研究人員利用噴霧干燥法將微生物[12]、藥物[11]、油脂[13]等包覆在海藻酸鈉微膠囊中。相比擠壓法制備的微膠囊，噴霧干燥法制備的微膠囊的直徑較小。MLADENOVSKA等采用殼聚糖-鈣-海藻酸鈉作為壁材制備成直徑小于10 μm的5-氨基水楊酸微膠囊[14]。Na等利用聚乙烯醇制備成直徑低至3.1 μm的水/油/水(W/O/W)微膠囊[8]。BOWEY等采用海藻酸鈉為壁材，使用噴霧干燥法制備了直徑為2.1 μm的包裹胰島素的微膠囊[15]。SZEKALSKA等使用噴霧干燥法制備了包裹鹽酸二甲雙胍的海藻酸鈉微膠囊，微膠囊的直徑范圍在1.6 μm ～ 5.7 μm之間[10]。噴霧干燥法制備微膠囊還有利于提高被包裹微生物的活細(xì)胞比例。SURYABHAN等使用微膠囊技術(shù)包埋釀酒酵母、西方伊薩酵母，使得噴霧干燥法后酵母菌的存活率顯著提高，而且酵母微膠囊在模擬胃和膽汁中活細(xì)胞比例分別提高32%～64%和46%～80%[16]。

1.2 擠壓法

擠壓法，首先將芯材均勻分散在海藻酸鈉溶液中形成混合物，通過滴注工具將該混合物滴入氯化鈣溶液中，海藻酸鈉的Na+被Ca2+替換并硬化形成顆粒的過程。擠壓法是最簡(jiǎn)單的生產(chǎn)粒徑均勻的海藻酸鈉微膠囊方法。擠壓法制備微膠囊的粒徑取決于海藻酸鈉濃度、注射工具銳孔、銳孔到氯化鈣液面的距離[17]。擠壓法的不足為微膠囊的粒徑范圍為數(shù)百微米到毫米之間，直徑較大。例如，LOTFIPOUR等利用響應(yīng)面方法優(yōu)化了氯化鈣和海藻酸鈉濃度、硬化時(shí)間后，得到直徑為1.3 mm ～ 1.7 mm的嗜酸乳桿菌微膠囊，包埋率達(dá)到98%以上[18]。CHAN等試圖將擠壓法制備微膠囊的工藝數(shù)字化，以臨界參數(shù) (Oh) > 0.24建立了制備微膠囊的工藝模型[19]。LIM等優(yōu)化Ca2+濃度、殼聚糖濃度、制備工藝后發(fā)現(xiàn)微膠囊直徑與針孔直徑顯著相關(guān)，也建立了制備微膠囊的模型。該模型的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際值的偏差只有3.6%[20]。因此，擠壓法是一種可靠的制備較大直徑微膠囊的方法。

1.3 乳化凝膠法

乳化凝膠法通過海藻酸鈉與交聯(lián)劑進(jìn)行凝膠化得到微膠囊。乳化凝膠法可以制備粒徑小于100 μm的微膠囊，而且其實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低。乳化凝膠化分為內(nèi)部凝膠化和外部凝膠化(圖1)。外部凝膠化和內(nèi)部凝膠化的區(qū)別在于微膠囊內(nèi)、外部硬化時(shí)間的不同。內(nèi)部凝膠化表示先形成內(nèi)核，然后再逐漸形成微膠囊顆粒。外部凝膠化表示核心凝膠化之前表面已經(jīng)發(fā)生凝膠化，從而使顆粒具有剛性表面和柔軟內(nèi)核[21]。內(nèi)部凝膠化制備的微膠囊通常較軟且具有高聚集性。在較高的Ca2+濃度下，內(nèi)部凝膠化制備的微膠囊包埋效率和釋放速率較低[9]。外部乳化法制備的微膠囊的粒徑分布較寬，內(nèi)部乳化法制備的微膠囊粒徑普遍較小且分布均勻。例如，SONG等通過乳化內(nèi)部凝膠化和乳化外部凝膠化技術(shù)制備了海藻酸鈉酵母微膠囊，通過外部凝膠化方法制備的微膠囊粒徑為35 μm ～ 863 μm。而通過內(nèi)部凝膠化制備的微膠囊粒徑范圍為35 μm ～ 373 μm[22]。

圖1 內(nèi)源乳化法和外源乳化法制備微膠囊的原理示意圖

1.4 層層組裝法

層層組裝法利用逐層交替沉積的方法，借助各層分子間的相互作用(靜電引力、氫鍵、配位鍵等)，自發(fā)形成結(jié)構(gòu)完整、性能穩(wěn)定、具有某種特定功能的分子聚集體或超分子結(jié)構(gòu)的過程。層層組裝法可以制備出幾百到幾千納米范圍內(nèi)的中空微膠囊。層層組裝法的優(yōu)點(diǎn)主要在于在納米尺度上對(duì)微膠囊直徑、組成、結(jié)構(gòu)、形態(tài)和囊壁厚度的精確控制。ZHAO等以天然多糖殼聚糖(CS)和海藻酸鈉(SA)為載體，采用層層組裝法制備了百里香精油微膠囊(TMS)。百里香精油微膠囊的抑菌效果均優(yōu)于未制備微膠囊的百里香油。當(dāng)溫度從37 ℃升至121 ℃時(shí)，百里香精油微膠囊的抑菌率由88.0 %升高到99.8%，表明百里香精油微膠囊可作為天然抗菌劑在食品和制藥工業(yè)中應(yīng)用[23]。

2 制備微膠囊的影響因素

海藻酸鈉微膠囊的粒徑是影響芯材性質(zhì)、微膠囊降解性、芯材與外界進(jìn)行物質(zhì)交換，及釋放動(dòng)力學(xué)的重要參數(shù)。微膠囊的最佳尺寸也根據(jù)不同芯材和應(yīng)用場(chǎng)景的不同而變化。微膠囊粒徑分布影響微膠囊體積、密度、流動(dòng)性、復(fù)水性、溶解性和分散性等性能，對(duì)芯材的負(fù)載、聚集、釋放和組織滯留有重要的影響。海藻酸鈉種類和濃度、油相種類和濃度、表面活性劑種類和濃度、交聯(lián)劑種類和濃度、交聯(lián)時(shí)間、攪拌時(shí)間、轉(zhuǎn)速、芯材含量都是影響海藻酸鈉微膠囊制備及其粒徑和粒徑分布的重要因素。

2.1 海藻酸鈉的種類和濃度

M/G比值小于1的海藻酸鈉被稱為高G，M/G比值大于1的的海藻酸鈉稱為高M(jìn)。KENDALL等分別比較了中等粘度高G、低粘度高G、低粘度高M(jìn)、中等粘度高M(jìn)制備的微膠囊。結(jié)果表明高G海藻酸鈉微膠囊的直徑始終大于相應(yīng)的高M(jìn)海藻酸鈉微膠囊的直徑，平均粒徑分別為780 μm和607 μm。因此，高M(jìn)海藻酸鈉相較于高G海藻酸鈉更適于制備直徑較小的微膠囊[24]。微膠囊的平均粒徑隨海藻酸鈉濃度的增加而增加[25, 26]。這是由于海藻酸鈉濃度的增加導(dǎo)致海藻酸鈉溶液粘度的增加，增大了海藻酸鈉液滴與油相之間的界面張力，因而形成尺寸更大的微膠囊[27]。SILVA等人通過乳化法制備海藻酸鈉微膠囊過程中將海藻酸鈉濃度從2%增加到3% (w/v)時(shí)，微膠囊的平均粒徑從53 μm增加到112 μm，而且，粒徑分布的多分散性參數(shù)SPAN從0.66增加到1.77[25]。

2.2 油相種類和濃度

乳化法制備微膠囊的過程中可以使用的油有液體石蠟[7,28]、大豆油[29]、橄欖油[30]、葵花籽油、棕櫚油等。油相的粘度會(huì)影響微膠囊的尺寸和分布均勻性。WANG等人發(fā)現(xiàn)隨著油相黏度的增加，微膠囊的平均粒徑減小。當(dāng)油相黏度為1 MPa·s時(shí)，微膠囊的平均直徑為10 μm。當(dāng)油相黏度增加到80 MPa·s時(shí)，微膠囊的平均直徑減小到5 μm[31]。由此可見，通過改變油相粘度與水相粘度的比值可以調(diào)整微膠囊的粒徑和尺寸分布。由于液體石蠟的高儲(chǔ)能、溫度波動(dòng)小、體積變化小、安全且良好的化學(xué)和熱穩(wěn)定性、經(jīng)濟(jì)型好，其作為芯材用于微膠囊制備最廣泛[32]。

2.3 表面活性劑種類和濃度

表面活性劑的作用是降低親水性分子和疏水性分子之間的界面表面張力，從而形成穩(wěn)定的乳液，并防止乳液液滴聚結(jié)形成離散的微球[33]。表面活性劑有助于修飾微球使表面平滑[13]。常用的疏水性乳化劑Span80、Span85，聚甘油聚蓖麻油酸酯(PGPR)被廣泛用作表面活性劑。親水親脂平衡(HLB)是衡量表面活性劑用于微膠囊制備的重要參數(shù)。HLB在8～18范圍內(nèi)的乳化劑表示親水性，適用于水包油(O/W)型乳化劑。而HLB值在3.5～6之間的油包水(W/O)型乳化劑被稱為親脂性表面活性劑[34]。W/O型乳液HLB值較高的表面活性劑可產(chǎn)生更穩(wěn)定的乳液。因此，乳液熱穩(wěn)定性依賴于表面活性劑的HLB值。對(duì)于結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)相似的表面活性劑，較高C/H比引起其極性不同，導(dǎo)致表面活性劑分散不均勻、乳液不穩(wěn)定[34]。例如聚甘油蓖麻醇酸酯(PGPR)和Span80就是常用的表面活性劑。PGPR可以很好地溶解于向日葵油和玉米油中[35]。Span80能夠較好地溶解于液體石蠟中[13]。表面活性劑濃度的增加會(huì)降低微膠囊的粒徑和微膠囊粒徑分布[9]。Span80濃度的增加減小了乳液中海藻酸鈉與油相之間的界面張力，形成更小粒徑的微膠囊。ALNAIEF等評(píng)估了Span80濃度對(duì)微膠囊尺寸的影響。結(jié)果表明當(dāng)Span80含量從0%增加到3%(w/v)時(shí)，微膠囊平均粒徑從259 μm降低到115 μm[36]。

2.4 交聯(lián)劑種類和濃度

Ca2+、Sr2+、Ba2+離子等二價(jià)陽(yáng)離子常作為微膠囊的交聯(lián)劑。其中，Sr2+和Ba2+離子具有中等毒性，而Ca2+離子無(wú)毒性。因此，Ca2+離子是最廣泛使用的交聯(lián)劑[21]。CaCl2、Ca-EDTA或CaCO3是最常見Ca2+離子來源[29]。當(dāng)Ca2+離子被引入海藻酸鈉聚合物溶液中時(shí)，進(jìn)入帶負(fù)電荷海藻酸鈉分子之間形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被稱為“蛋盒”模型。交聯(lián)劑濃度太低時(shí)凝膠交聯(lián)度不夠，包埋不完全，內(nèi)容物易流失。而交聯(lián)劑濃度太高時(shí)，形成的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑小，分子聯(lián)結(jié)緊密，影響分子的擴(kuò)散。因此，通過調(diào)整交聯(lián)劑濃度可以控制細(xì)胞、蛋白質(zhì)和藥物的釋放。BAIMARK等發(fā)現(xiàn)負(fù)載藍(lán)色葡聚糖的微膠囊在0.5%和1.25% Ca2+濃度下聚集[37]。這是Ca2+濃度過低，不足以使微膠囊硬化而導(dǎo)致微膠囊相互聚集。CaCl2濃度的增加使海藻酸鈉和CaCl2之間的高度交聯(lián)并收縮，導(dǎo)致微膠囊粒徑略有減小。CHO等制備白藜蘆醇微膠囊時(shí)將CaCl2濃度從0.5%升高到1%后，微膠囊的平均粒徑從244.0 μm減小到217.3 μm[38]。

2.5 交聯(lián)時(shí)間

通常交聯(lián)時(shí)間對(duì)擠壓法和乳化凝膠法制備的微膠囊的形態(tài)沒有顯著影響，LOTFIPOUR等人在使用擠壓法制備微膠囊過程中，將交聯(lián)時(shí)間從15 min增加到60 min，微膠囊粒徑從1.34 mm增加到了1.35 mm[18]。但交聯(lián)時(shí)間對(duì)載藥材料的穩(wěn)定性有較大影響。過短的交聯(lián)時(shí)間導(dǎo)致海藻酸鹽溶液凝膠不完全，從而降低包封率。交聯(lián)時(shí)間延長(zhǎng)使更多的Ca2+擴(kuò)散到微膠囊中取代藥物，從而減少了藥物包封率。如RAHMAN等人報(bào)道交聯(lián)時(shí)間從10 min增加到30 min后，包封率從84.3%下降到46.5%[39]。

2.6 攪拌速度

擠壓法中攪拌速度對(duì)微膠囊尺寸沒有顯著影響。乳化法中隨著攪拌速度的增加，微膠囊的平均粒徑減小，且粒徑分布范圍逐漸增大。攪拌速度過小時(shí)，形成的微膠囊成球形較差，聚集嚴(yán)重，包埋產(chǎn)率低。這是轉(zhuǎn)子頂端的剪切應(yīng)力大于攪拌中心位置，給予乳狀液不均勻的能量分布，導(dǎo)致粒徑分布范圍增大[22]。ZHAI等使用轉(zhuǎn)速1 000 r/min制備的微膠囊的粒徑范圍為1 μm ～ 4 μm，以1 300 r/min制備的微膠囊的粒徑范圍為0.8 μm ～ 2.3 μm，以1 600 r/min轉(zhuǎn)速制備的微膠囊的粒徑范圍為0.3 μm ～ 2.3 μm[40]。

3 海藻酸鈉微膠囊在微生物包埋方面的應(yīng)用

微生物微膠囊不僅可以保護(hù)微生物免受有害環(huán)境的影響，而且可以控制釋放。以海藻酸鈉與其它材料混合制備微膠囊調(diào)整壁材、包封技術(shù)、包藏手段可以滿足多種微生物微膠囊的制備[41]。目前包埋的微生物主要是益生菌類，例如乳桿菌等。益生菌也必須能夠通過粘附定植在小腸內(nèi)。益生菌面臨的最大挑戰(zhàn)是保持益生菌的存活能力[42]，微膠囊化提高了益生菌的生存能力，在食品工業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用。微生物微膠囊也具有延長(zhǎng)貨架期、提高存活率[43-46]。表1列出了制備多種微生物微膠囊及其效果。目前主要采用乳化法制備微生物微膠囊。除了螺旋藻的包埋率為44.5%外，其它微生物，例如益生乳桿菌、保加利亞乳桿菌、假單胞菌、植物乳桿菌、釀酒酵母、嗜酸乳桿菌的包埋率都在87%及以上。而且，微膠囊使微生物的存活率有了顯著提高。這說明微膠囊技術(shù)為微生物的應(yīng)用提供了良好的基礎(chǔ)。

表1 近年來使用海藻酸鈉為壁材制備微膠囊的代表性研究

4 展望

海藻酸鈉微膠囊在生物活性物質(zhì)、微生物包埋中具有光明前景。但其制備技術(shù)仍然面臨一些理論和應(yīng)用方面的挑戰(zhàn)。例如微膠囊制備工藝的控制[52]，內(nèi)容物釋放的復(fù)雜性，微膠囊核心材料載荷/釋放機(jī)制不清楚[53]。海藻酸鈉微膠囊的研究將主要集中在以下兩方面：1、海藻酸鈉官能團(tuán)的定向功能化改性將是海藻酸鈉微膠囊高效利用技術(shù)的一個(gè)重要方向?？偨Y(jié)藻酸鈉中特征化學(xué)鍵的斷裂方式和規(guī)律，從而實(shí)現(xiàn)海藻酸鈉的定向改性。YU等人將疏水性分子連接到海藻酸鈉上，采用內(nèi)源乳化法制備兩親性水凝膠的牛血清白蛋白(BSA)微膠囊。結(jié)果表明疏水性物質(zhì)聚乙酸乙烯酯的引入能有效延緩BSA的釋放，而且聚乙酸乙烯酯在海藻酸鈉上取代度越高，BSA釋放速率越慢[54]。2、改進(jìn)海藻酸鈉微膠囊制備技術(shù)。以海藻酸鈉作為壁材的新型微膠囊技術(shù)正成新熱點(diǎn)。MOGHADDAM等人采用熔體同軸電噴霧電離法制備海藻酸鈉為壁材、正十九烷為芯材的相變微膠囊。結(jié)果得到直徑小于100 μm的微膠囊[55]。微膠囊的粒徑可以通過工作電壓、進(jìn)給速率、針到集電極的距離和針徑進(jìn)行控制。這些技術(shù)的發(fā)展就更有利于微膠囊的制備，有效地促進(jìn)微膠囊在生物醫(yī)藥、食品工業(yè)和工業(yè)微生物等領(lǐng)域的發(fā)展。