通過參數(shù)相關(guān)性分析對(duì)發(fā)酵控制策略在植酸酶高密度發(fā)酵中的作用探討

韓慶曄， 公維麗， 史建國(guó)， 王丙蓮， 劉慶艾， 蔡 雷， 鄭 嵐，孟慶軍， 楊 艷， 楊俊慧， 馬耀宏

齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 山東省科學(xué)院生物研究所 山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250103

植酸(肌醇六磷酸)是農(nóng)作物中肌醇和磷酸的主要來(lái)源，因單胃動(dòng)物無(wú)法直接利用植酸中的磷酸，造成飼料中需添加無(wú)機(jī)磷以滿足飼養(yǎng)動(dòng)物對(duì)磷元素的需求，而過剩的無(wú)機(jī)磷會(huì)引起環(huán)境污染和富營(yíng)養(yǎng)化等嚴(yán)重的生態(tài)問題[1,2]。因此，提高單胃動(dòng)物對(duì)飼料中植酸磷的吸收利用以減少磷元素的排放對(duì)資源有效利用和減少環(huán)境污染具有重要意義[3]。利用植酸酶(Phytase)作為一種新型飼料添加劑，催化植酸(鹽)水解為肌醇及無(wú)機(jī)磷酸[4]，以促進(jìn)動(dòng)物對(duì)微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分的吸收成為解決上述問題的關(guān)鍵。

植酸酶主要來(lái)源于微生物，當(dāng)前用于工業(yè)植酸酶生產(chǎn)的菌株大多為單位表達(dá)量已較天然菌株大幅度提高的基因工程菌。但對(duì)于高密度生產(chǎn)植酸酶的工藝方法主要通過在搖瓶研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行放大。由于工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際中的發(fā)酵罐不同于實(shí)驗(yàn)室的搖瓶培養(yǎng)，因而常造成搖瓶培養(yǎng)中細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的水平不能準(zhǔn)確反映其在發(fā)酵罐中的真實(shí)情況。為了可全面了解細(xì)胞在反應(yīng)器中的宏觀生理代謝特性，實(shí)現(xiàn)跨尺度觀察與調(diào)控，張明等指出微生物發(fā)酵實(shí)質(zhì)上是在分子水平上的遺傳特性、細(xì)胞水平上的代謝調(diào)節(jié)和工程水平上的傳遞特性這3個(gè)不同水平上發(fā)生調(diào)控的[5]。張嗣良等為此設(shè)計(jì)了可用于了解細(xì)胞生理代謝特性的全參數(shù)檢測(cè)生物反應(yīng)器[6]，該技術(shù)已成功應(yīng)用于青霉素，紅霉素等工業(yè)發(fā)酵工藝的優(yōu)化和規(guī)模放大，實(shí)現(xiàn)了工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)效率的提高[7]。莊等亦基于此首次建立了可通過在線生理數(shù)據(jù)計(jì)算出實(shí)時(shí)關(guān)鍵參數(shù)的方程式，用來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)葡萄糖酸鈉(SG)發(fā)酵的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)方法，使發(fā)酵總產(chǎn)量提升超過16%，顯著提高了SG生產(chǎn)[8]。目前，大量先進(jìn)的在線生物過程檢測(cè)儀表已用于發(fā)酵過程中關(guān)鍵代謝特性參數(shù)的采集，并通過參數(shù)之間的對(duì)比與相關(guān)性分析進(jìn)行培養(yǎng)過程工藝的優(yōu)化調(diào)控[9]。

本文立足于工程水平上的調(diào)控，基于前期搖瓶研究基礎(chǔ)[10]，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室自構(gòu)建的植酸酶工程菌在10 L發(fā)酵罐上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，利用多種物理傳感器(pH傳感器、溶氧(DO)傳感器、尾氣分析儀)和生物傳感器(活細(xì)胞在線、甘油傳感器、還原糖測(cè)定儀、乳酸測(cè)定儀)實(shí)時(shí)檢測(cè)改變攪拌速度、接種量與補(bǔ)料甘油三種條件下發(fā)酵液中pH、DO、尾氣中CO2含量(CER)、尾氣中O2含量(OUR)、細(xì)胞密度與發(fā)酵液中甘油含量、還原糖含量、乳酸含量等參數(shù)變化，探討植酸酶高密度發(fā)酵下各參數(shù)變化對(duì)工程菌細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的具體影響，并進(jìn)而通過各參數(shù)變化間相關(guān)性分析討論三種發(fā)酵調(diào)控策略在發(fā)酵控制中的具體作用，為工業(yè)上具體操作的優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株

畢赤酵母GS115產(chǎn)植酸酶工程菌由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，-20 ℃保藏。

1.1.2試劑

酵母粉，蛋白胨，無(wú)氨基酵母氮源YNB(含硫酸銨)，生物素，丙烯酰胺，N,N,N′,N′-四甲基乙二胺TEMED，十二烷基苯磺酸鈉(SDS)，過硫酸銨，均購(gòu)買自生工(上海，中國(guó))；葡萄糖，KH2PO4，K2HPO4，甲醇，甘油，釩酸銨，鉬酸銨，硝酸，乙酸，乙酸鈉，購(gòu)買自國(guó)藥(北京，中國(guó))；植酸鈉(Sigma, 美國(guó))

1.1.3培養(yǎng)基

1.1.3.1種子培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 10.0，蛋白胨 20.0，葡萄糖 10.0。

1.1.3.2擴(kuò)大培養(yǎng)基

BMGY培養(yǎng)基(g/L)：YNB 13.4，KH2PO411.8，K2HPO42.9，酵母粉10.0，蛋白胨 10.0，Biotin 4×10-4，甘油10 mL。

1.1.3.3發(fā)酵培養(yǎng)基

BMMY培養(yǎng)基(g/L)：YNB 13.4，KH2PO411.8，K2HPO42.9，酵母粉10.0，蛋白胨 10.0，Biotin 4×10-4，甲醇5 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳儀(Bio-rad，美國(guó))，搖床(知楚，上海)，TECAN酶標(biāo)儀(TECAN，瑞士)，SGD全自動(dòng)還原糖測(cè)定儀(山東省科學(xué)院，山東)，SBA-4D型生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院，山東)，甘油傳感器(山東省科學(xué)院，山東)，尾氣傳感分析儀(山東省科學(xué)院，山東)，Control Unit EVO 265活細(xì)胞在線(FOGALE nanotech，德國(guó))，KRh-BIO 3000型發(fā)酵罐(科潤(rùn)海，江蘇)，DZFZ-6D型蒸汽發(fā)生器(三星，江蘇)

1.3 方法

1.3.1培養(yǎng)方法

1.3.1.1種子活化

挑取菌種接種于100 mL YPD培養(yǎng)基中，于30 ℃，200 r/min過夜培養(yǎng)。

1.3.2.2高密度發(fā)酵培養(yǎng)

如表1所示，對(duì)相關(guān)因素進(jìn)行設(shè)置，將一定量菌體接入10 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。在發(fā)酵過程中控制攪拌速度以適合菌體生長(zhǎng)；維持罐內(nèi)空氣流量在10 L/min；pH控制為6.0；罐溫設(shè)置為30 ℃。通過下表操作，探討不同轉(zhuǎn)速、不同接種量和補(bǔ)料甘油對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)植酸酶的影響。表1中批次a～批次d在結(jié)果與討論的圖示中為便于比較，記作a組～d組；與結(jié)論表中批次a～批次d意義相同。

1.3.2.3誘導(dǎo)表達(dá)

酵母細(xì)胞于擴(kuò)大培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間后，按日流加1%(v/v)甲醇。定時(shí)取樣，探究發(fā)酵期間改變轉(zhuǎn)速、接種量及補(bǔ)料甘油對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)與目的蛋白表達(dá)情況的影響(表1)。

1.3.2測(cè)定方法

1.3.2.1酵母菌株平板培養(yǎng)方法、搖瓶培養(yǎng)方法、酶液透析方法、蛋白及酶活測(cè)定方法、SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)方法、還原糖和乳酸含量測(cè)定方法以上各測(cè)定方法同文獻(xiàn)[10]。

1.3.2.2發(fā)酵液中菌體濃度、溶氧、pH、甘油含量、尾氣中O2與CO2含量的測(cè)定

利用活細(xì)胞在線測(cè)菌體濃度；利用發(fā)酵罐在線控制系統(tǒng)配置的溶氧電極和pH電極檢測(cè)溶氧和pH；利用山東省科學(xué)院生物研究所研發(fā)的甘油傳感器、尾氣傳感分析儀檢測(cè)甘油和尾氣中O2與CO2含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)速控制在植酸酶工程菌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)酵中的影響

2.1.1轉(zhuǎn)速對(duì)植酸酶工程菌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

溶氧量( dissolved oxygen content，DO) 是酵母細(xì)胞生長(zhǎng)過程中最重要的檢測(cè)指標(biāo)之一，它直接影響著酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝。當(dāng)O2不足時(shí)，菌體的生長(zhǎng)就會(huì)受到抑制，并代謝產(chǎn)生乳酸[11]。而攪拌器轉(zhuǎn)速與溶氧的變化密切相關(guān)[12]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在發(fā)酵前20 h，轉(zhuǎn)速均保持在200 r/min，此時(shí)兩組細(xì)胞密度、溶氧變化無(wú)明顯差異(圖1A、B)。b組逐步提高轉(zhuǎn)速，細(xì)胞密度在發(fā)酵36 h～50 h增至最高達(dá)4.25 pF/cm(圖1 A)，因菌體代謝伴有極高的耗氧與CO2的釋放，致使溶氧降至最低，尾氣中O2含量降至最低(圖1 D)，CO2含量升至最高(圖1 E)。細(xì)胞密度最高時(shí)，受此時(shí)溶氧的限制，伴有乳酸短時(shí)升高(圖1 C)。發(fā)酵50 h后隨著甲醇流加，細(xì)胞密度開始降低，溶氧升高，尾氣中O2含量增加，CO2含量降低；發(fā)酵60 h后，各參數(shù)趨于平穩(wěn)。而a組細(xì)胞密度低于b組(圖1 A)，由于轉(zhuǎn)速低，攪拌不均質(zhì)，O2與CO2濃度在發(fā)酵過程中無(wú)明顯變化，乳酸變化亦不明顯。因此，保證持續(xù)通氧的情況下，相應(yīng)調(diào)整攪拌器轉(zhuǎn)速，有利于提高菌體細(xì)胞密度。

圖1 在不同攪拌器轉(zhuǎn)速控制條件下活細(xì)胞密度、DO、乳酸及尾氣中O2與CO2濃度的變化曲線

2.1.2轉(zhuǎn)速對(duì)植酸酶工程菌細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

在菌體表達(dá)蛋白的過程中pH變化明顯。當(dāng)pH值穩(wěn)定在3.5時(shí)，蛋白表達(dá)出現(xiàn)的時(shí)間與pH變化趨于穩(wěn)定的時(shí)間相近(圖2 A)。a組菌體24 h培養(yǎng)后經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，于發(fā)酵66 h后有明顯目的蛋白出現(xiàn)并累積(圖2 E)，最高酶活為991.05 U/mL(圖2 B-a)；整體還原糖含量基本穩(wěn)定(圖2 C)；相同誘導(dǎo)條件與時(shí)間，b組于發(fā)酵42 h后表達(dá)蛋白(圖2 F)，時(shí)間縮短24 h，且酶活提高44.9%，達(dá)到1 436.09 U/mL(圖2 B-b)。因此，提高轉(zhuǎn)速利于改善發(fā)酵溶氧條件，促使菌體利用甘油進(jìn)行生長(zhǎng)(圖2 D)，并有利于后期蛋白的表達(dá)。

9：細(xì)胞培養(yǎng)24 h,開始流加甲醇; 10-29：每隔6 h取樣檢測(cè)

2.2 接種量對(duì)植酸酶工程菌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)酵的影響

2.2.1接種量對(duì)植酸酶工程菌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，按1%、10%的接種量進(jìn)行發(fā)酵，10%接種量能有效縮短發(fā)酵時(shí)間。

發(fā)酵前7 h，由于c組接種量大，細(xì)胞對(duì)氧的利用高于b組，溶氧先于b組降低；受攪拌影響，細(xì)胞密度略低于b組(圖3 A)。發(fā)酵24 h，細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，溶氧降至最低(圖3 B)，尾氣中O2含量開始降低，CO2含量升高；發(fā)酵36 h，此時(shí)尾氣中O2含量降至最低(圖3 D)，CO2含量升至最高(圖3 E)，此階段伴有乳酸升高(圖3 C)。比較b組得出：在通氧充足的條件下，發(fā)酵前期升高轉(zhuǎn)速，菌體生長(zhǎng)，細(xì)胞密度升高使發(fā)酵液中溶氧降低，尾氣中O2含量降低與CO2含量升高。穩(wěn)定期流加甲醇，細(xì)胞密度趨于平穩(wěn)，菌體吸收甲醇作為碳源，由于甲醇具有一定的毒害作用，致使細(xì)胞密度下降，溶氧升高，尾氣中O2含量降低與CO2含量升高；此間降低轉(zhuǎn)速，可使細(xì)胞密度適當(dāng)恢復(fù)，出現(xiàn)溶氧降低，尾氣中O2含量降低，CO2含量升高的情況。其中溶氧與尾氣的檢測(cè)可直接反應(yīng)出菌體的生長(zhǎng)狀況，乳酸可提示菌體進(jìn)行對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。

圖3 不同接種量條件下活細(xì)胞密度、DO、乳酸及尾氣中O2與CO2濃度的變化曲線

2.2.2接種量對(duì)植酸酶工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，10%接種量使植酸酶表達(dá)提前；細(xì)胞密度升高的同時(shí)，使植酸酶得到明顯積累。c組發(fā)酵末期酶活可達(dá)3037.98 U/mL(圖4 A)，相較b組酶活提高111.5%；pH上，c組提前處于表達(dá)蛋白階段(圖4 C)，此間還原糖含量基本不變(圖4 D)；SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果也可表明c組植酸酶表達(dá)時(shí)間(圖4 F)的提前。

11：細(xì)胞培養(yǎng)24 h,開始流加甲醇; 12-25：每6 h取樣檢測(cè)

2.3 甘油補(bǔ)料對(duì)植酸酶工程菌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)酵的影響

2.3.1甘油補(bǔ)料對(duì)植酸酶工程菌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

在菌體到達(dá)穩(wěn)定期之前，提升穩(wěn)定菌體含量對(duì)后期目的蛋白的高效表達(dá)具有一定影響。通過對(duì)前期補(bǔ)料甘油來(lái)探討此時(shí)菌體生長(zhǎng)情況與對(duì)蛋白表達(dá)的影響。

按10%接種量，轉(zhuǎn)速逐步增加，待培養(yǎng)至18 h，d組補(bǔ)料1%(v/v)的甘油。結(jié)果顯示，發(fā)酵前18 h，由于細(xì)胞整體活度的影響，造成前期溶氧的利用并不完全一致(圖5 B)；發(fā)酵18 h，d組補(bǔ)料甘油；20 h乳酸升至最高(圖5 C)，由于甘油的添加，造成發(fā)酵液黏度上升，乳酸的峰值較c組有所延遲；發(fā)酵24 h，d組細(xì)胞密度升至最高；發(fā)酵31 h，尾氣中O2含量明顯降低、CO2含量升高(圖5 D、E)；此后，d組細(xì)胞密度開始降低。甘油的添加一方面易造成發(fā)酵液黏度升高，使菌體對(duì)溶氧的利用受到限制；另一方面可穩(wěn)定細(xì)胞量，延緩細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)不足而導(dǎo)致的過早衰亡，并維持細(xì)胞較高的溶氧消耗，提高細(xì)胞活度(圖5 B)。

圖5 不同甘油補(bǔ)料條件下活細(xì)胞密度、DO、乳酸及尾氣中O2與CO2濃度的變化曲線

2.3.2補(bǔ)料甘油對(duì)植酸酶工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：前期補(bǔ)料甘油，d組酶活在發(fā)酵末期可達(dá)到2216.33 U/mL(圖6 A)，相較于c組酶活降低27%；從pH變化時(shí)間上看d組有所延后(圖6 B-d)；從甘油、還原糖含量可看出d組中菌體利用甘油進(jìn)行生長(zhǎng)(圖6 C、D)，至發(fā)酵后期，還原糖含量有所降低(圖6 D)。

5：細(xì)胞培養(yǎng)24 h,開始流加甲醇; 12：流加甲醇后5 h

從SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果中可以看出：d組自發(fā)酵33 h流加甲醇至發(fā)酵42 h后植酸酶開始表達(dá)，較于c組自發(fā)酵24 h流加甲醇至發(fā)酵27 h即有植酸酶表達(dá)延遲6 h。在甘油與甲醇并存的前提下，菌體優(yōu)先利用甘油、補(bǔ)充碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，推測(cè)前期甘油的不完全利用對(duì)于后期蛋白表達(dá)具有一定的遲滯作用。

3 總結(jié)與討論

通過四次發(fā)酵(如表1所示)探得：對(duì)植酸酶工程菌以流加甲醇含量為1%，培養(yǎng)溫度為30 ℃的情況下，接種量為10%，其發(fā)酵遲滯期最短且蛋白表達(dá)量最高，末期可達(dá)3 037.98 U/mL，此時(shí)生長(zhǎng)pH為5.0，產(chǎn)酶的pH為3.5。

本文基于罐體培養(yǎng)，結(jié)合多種在線傳感器，著重分析轉(zhuǎn)速、細(xì)胞密度、溶氧和尾氣中氧氣與二氧化碳含量的關(guān)系，結(jié)合其他發(fā)酵指標(biāo)，結(jié)果得到(如表2，表3所示)：(1) 轉(zhuǎn)速影響溶氧和細(xì)胞密度，且在發(fā)酵前期，轉(zhuǎn)速提高，細(xì)胞密度增加，罐內(nèi)溶氧降低，尾氣中O2含量降低，CO2含量升高；菌體平穩(wěn)后，轉(zhuǎn)速提高，細(xì)胞密度下降，罐內(nèi)溶氧升高，尾氣中O2含量升高，CO2含量降低。其中當(dāng)CO2排放(CER)達(dá)到最值時(shí)，與細(xì)胞密度或菌體量增至最值時(shí)的時(shí)間相吻合，此時(shí)發(fā)酵液pH變化趨于平穩(wěn)，且目的蛋白也開始表達(dá)。(2) 溶氧和乳酸開始變化與達(dá)到最值且平穩(wěn)的時(shí)間基本吻合；乳酸可作為發(fā)酵環(huán)境中溶氧是否充足的指標(biāo)。

表2 不同發(fā)酵批次各參數(shù)指標(biāo)變化時(shí)間(一)

表3 不同發(fā)酵批次各參數(shù)指標(biāo)變化時(shí)間(二)

通過四次發(fā)酵結(jié)果，得出如下關(guān)系：轉(zhuǎn)速-細(xì)胞密度-溶氧-乳酸相關(guān)的發(fā)酵罐內(nèi)外環(huán)境氧控制關(guān)系；細(xì)胞密度-氧氣吸收-二氧化碳釋放相關(guān)的細(xì)胞生長(zhǎng)氧控制關(guān)系；細(xì)胞密度-二氧化碳釋放-pH變化-蛋白表達(dá)的細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)的關(guān)系。通過罐體培養(yǎng)，以傳感器反饋結(jié)果，建立起實(shí)驗(yàn)室與工業(yè)實(shí)踐的關(guān)聯(lián)，以期為植酸酶工業(yè)生產(chǎn)做好前期探索。