• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    淫羊藿苷對胰腺癌細胞BxPC-3增殖和凋亡的影響與miR-9上調(diào)有關(guān)①

    2021-03-01 03:27:32黃群蓮胡運春陳永鈞代良敏代良萍
    中國免疫學雜志 2021年3期
    關(guān)鍵詞:藿苷貨號胰腺癌

    黃群蓮 胡運春 陳永鈞 代良敏 代良萍

    (西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院藥學部,瀘州 646000)

    胰腺癌是一種診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤。在全世界范圍內(nèi),胰腺癌的發(fā)病率和死亡率很高,中國胰腺癌的死亡率高達88%[1]。盡管近年來醫(yī)學治療上取得了非常大的進展,但胰腺癌的死亡率并未得到明顯改善。一方面,其獨特的解剖位置使該疾病難以診斷;另一方面,大多數(shù)患者對化學療法產(chǎn)生抗藥性[2]。因此,胰腺癌患者需要更有效、毒性更小的治療方法。中藥化合物已成為胰腺癌患者體內(nèi)調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境的重要抗癌藥物和輔助藥物來源。淫羊藿苷是一種植物類黃酮苷,是中藥材淫羊藿中有效的藥理成分。淫羊藿苷因其雌激素樣作用,對心腦血管系統(tǒng)、骨代謝、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)、性功能等具有廣泛的藥理作用,同時還發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用[3]。已有研究表明淫羊藿苷可通過抑制腫瘤細胞的增殖和誘導腫瘤細胞的凋亡來抑制卵巢癌、肺癌、食管癌等多種癌癥的發(fā)展,但其對胰腺癌的作用尚不清楚[4]。miRNA是一類長度為20~24核苷酸的小型非編碼RNA,在細胞凋亡、代謝、細胞增殖以及分化等細胞中功能起關(guān)鍵作用。miR-9在乳腺癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤中表達失調(diào),發(fā)揮抑癌或致癌作用。已有研究表明,miR-9-5p在胰腺癌組織和細胞系中顯著下調(diào),這與胰腺癌患者生存時間較短有關(guān)[5]。因此,上調(diào)miR-9有望抑制胰腺癌的發(fā)展。本文利用體外培養(yǎng)的胰腺癌細胞來研究淫羊藿苷對胰腺癌細胞增殖和凋亡的作用及機制,為淫羊藿苷在臨床上治療胰腺癌提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1主要試劑 淫羊藿苷(HPLC≥98%,成都博瑞特化學技術(shù)有限公司,貨號:110583);順鉑(浙江聯(lián)碩生物科技有限公司,貨號:PHR1624);RPMI-1640培養(yǎng)基(上?;鄯f生物科技有限公司,貨號:C22400500BT);胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液(上海素爾生物科技有限公司,貨號:16000-044、15140122);四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑盒(上海信裕生物工程有限公司,貨號:111105-500);BCA試劑盒(上海易色醫(yī)療科技有限公司,貨號:BC201);活化的胱天蛋白3(cleaved caspase-3)抗體、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(碧云天生物科技有限公司,貨號:AC030-1、AB026、AB112、AF0003);辣根過氧化物酶標記的二抗、Ki67和增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抗體(上海艾博抗生物科技有限公司,貨號:ab6728、ab15580、ab92552);Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(上海聯(lián)碩生物科技有限公司,貨號:11668-019);miR-9 inhibitor質(zhì)粒及各種引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計并合成;SYBR-Green PCR試劑盒(蘇州英弗基因科技有限公司,貨號:INFG801-01);cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司,貨號:BTN60906)。

    1.1.2儀器 流式細胞儀購自美國BD公司;MuLTI SKAN GO 型全自動酶標儀購自上海智理科學儀器有限公司;K8500全自動凝膠成像系統(tǒng)購自南京世研儀器。

    1.1.3細胞及培養(yǎng) 胰腺癌BxPC-3細胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心,于RPMI1640培養(yǎng)基(含體積分數(shù)為10%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素和100 μg/ml 的鏈霉素),在體積分數(shù)為5% CO2條件下37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.2方法

    1.2.1MTT法檢測細胞活性 在96孔板中,將胰腺癌BxPC-3細胞分別用不同濃度淫羊藿苷(0、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L)處理24 h、48 h、72 h、96 h時,再用10 μl MTT染料處理細胞,然后與100 μl二甲基亞砜孵育15 min,用酶免疫分析儀在490 nm處測量光密度。用各濃度處理組細胞吸光值與 0 μmol/L 組細胞的光密度表示細胞活性。

    1.2.2分組及處理 將BxPC-3細胞分為對照組、淫羊藿苷12.5、25、50 μmol/L組、順鉑10 μmol/L組、miR-9 inhibitor組、淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor組。對照組、淫羊藿苷12.5、25、50 μmol/L組BxPC-3細胞用終濃度含有Icariin 0、12.5、25、50 μmol/L 培養(yǎng)基培養(yǎng);順鉑10 μmol/L組BxPC-3細胞用終濃度含有順鉑 10 μmol/L培養(yǎng)基培養(yǎng);miR-9 inhibitor組和淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor組利用Lipofectamine 2000將100 nmol/L的miR-9 inhibitor質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入胰腺癌BxPC-3細胞后,用終濃度含有淫羊藿苷0或50 μmol/L培養(yǎng)基培養(yǎng)。

    1.2.3克隆形成實驗檢測細胞生長 將胰腺癌BxPC-3細胞接種于6孔板(1×106個/孔),繼續(xù)培養(yǎng)14 d,其間每隔3 d進行換液并觀察細胞狀態(tài),體積分數(shù)為4%多聚甲醛固定30 min,質(zhì)量體積分數(shù)為0.25% 結(jié)晶紫染色20 min,計數(shù)菌落數(shù)量。

    1.2.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將胰腺癌BxPC-3細胞處理48 h后,胰酶消化胰腺癌BxPC-3細胞,12 000 r/min離心5 min,按1×106個/ml的濃度重懸胰腺癌BxPC-3細胞。在胰腺癌BxPC-3細胞懸液中加入5 μl FITC標記的膜聯(lián)蛋白V和5 μl碘化丙啶,暗環(huán)境孵化15 min,然后通過流式細胞儀分析細胞凋亡情況。細胞凋亡率(%)=早期細胞凋亡率(%)+晚期細胞凋亡率(%)。

    1.2.5蛋白印跡法檢測Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相對表達水平 用RIPA裂解液提取各組胰腺癌BxPC-3細胞的總蛋白,并通過BCA試劑盒檢測蛋白濃度。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后,用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜,并在室溫下,用脫脂牛奶封閉2 h。接著加入兔來源的單克隆一抗(Ki67 1∶1 000、PCNA 1∶1 000、cleaved caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶500、Bcl-2 1∶1 000),在4℃封閉過夜。然后加入對應山羊抗兔單克隆二抗(1∶2 000),室溫封閉1 h。最后滴電化學發(fā)光液曝光,以GAPDH為內(nèi)參,使用Quantity One軟件分析目標蛋白質(zhì)的相對表達水平。

    1.2.6RT-qPCR檢測miR-9 mRNA的表達 通過QIAzol裂解試劑提取1.2.2中各組胰腺癌BxPC-3細胞的總RNA,再通過cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,并按照SYBR-Green PCR試劑盒說明書操作進行miR-9 mRNA測定。反應條件:50℃ 2 min,95℃ 10 min,95℃ 15 s,60℃ 1 min,40個循環(huán),用U6標準化。miR-9的上游引物序列:5′-GAGACATAGGTATCTTGTCCC-3′,miR-9的下游引物序列:5′-GCTTAGGACTAGGGACTCAACC-3′;U6的上游引物序列:5′-GTGGTCCGCGTAGCGAGT-3′,U6的下游引物序列:5′-CGCTTCGGCAGCACAT-3′。

    2 結(jié)果

    2.1淫羊藿苷抑制胰腺癌BxPC-3細胞增殖 如圖1所示:各不同濃度組胰腺癌BxPC-3細胞吸光值隨時間變化逐漸出現(xiàn)差異,在24 h時,與0 μmol/L 組相比,50和100 μmol/L 組胰腺癌BxPC-3細胞吸光值明顯減少(P<0.05);在48 h時,與0 μmol/L組相比,25、50和100 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞吸光值明顯減少(P<0.05,P<0.01);在72 h時,與0 μmol/L組相比,12.5、25、50和100 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞吸光值明顯減少(P<0.05,P<0.01)。選擇淫羊藿苷12.5、25、50 μmol/L進行后續(xù)實驗。

    圖1 MTT法檢測不同濃度淫羊藿苷處理不同時間對胰腺癌BxPC-3細胞增殖的影響

    如圖2所示:與對照組相比,淫羊藿苷12.5 μmol/L 組胰腺癌BxPC-3細胞克隆細胞數(shù)目及增殖標記蛋白PCNA和Ki67表達無明顯變化,淫羊藿苷 25 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞克隆細胞數(shù)目減少(P<0.05)、增殖標記蛋白PCNA和Ki67表達下調(diào)(P<0.05),淫羊藿苷 50 μmol/L和順鉑10 μmol/L 組克隆胰腺癌BxPC-3細胞數(shù)目顯著減少(P<0.01),增殖標記蛋白PCNA和Ki67表達顯著下調(diào)(P<0.01)。

    圖2 不同濃度淫羊藿苷對胰腺癌BxPC-3細胞增殖的影響

    2.2淫羊藿苷誘導胰腺癌BxPC-3細胞凋亡 如圖3所示:與對照組相比,淫羊藿苷12.5 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞凋亡率及凋亡標記相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3表達均無明顯變化,淫羊藿苷 25 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞凋亡率及凋亡標記相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3和Bax表達增加(P<0.05)、凋亡標記相關(guān)蛋白Bcl-2表達下調(diào)(P<0.05),淫羊藿苷 50 μmol/L和順鉑10 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞凋亡率及凋亡標記相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3和Bax表達顯著增加(P<0.01)、凋亡標記相關(guān)蛋白Bcl-2表達顯著下調(diào)(P<0.01)。

    圖3 不同濃度淫羊藿苷對胰腺癌BxPC-3細胞凋亡的影響

    2.3淫羊藿苷上調(diào)胰腺癌BxPC-3細胞miR-9的表達 如圖4A所示:與對照組相比,淫羊藿苷12.5 μmol/L 和順鉑 10 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞miR-9表達無明顯變化,淫羊藿苷 25 μmol/L 組胰腺癌BxPC-3細胞miR-9表達上調(diào)(P<0.05),淫羊藿苷50 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞miR-9表達明顯上調(diào)(P<0.01)。如圖4B所示:與對照組相比,淫羊藿苷 50 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞miR-9表達明顯上調(diào)(P<0.01),miR-9 inhibitor組胰腺癌BxPC-3細胞miR-9表達明顯下調(diào)(P<0.01);與miR-9 inhibitor組相比較,淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor組胰腺癌BxPC-3細胞miR-9表達明顯上調(diào)(P<0.01)。

    圖4 RT-qPCR檢測不同濃度淫羊藿苷對miR-9 mRNA表達影響

    2.4淫羊藿苷對胰腺癌BxPC-3細胞增殖抑制作用與miR-9上調(diào)有關(guān) 如圖5所示:與對照組相比,淫羊藿苷 50 μmol/L組克隆胰腺癌BxPC-3細胞數(shù)目顯著減少(P<0.01)、增殖標記蛋白PCNA和Ki67表達顯著下調(diào)(P<0.01),miR-9 inhibitor組克隆胰腺癌BxPC-3細胞數(shù)目顯著增加(P<0.01)、增殖標記相關(guān)蛋白PCNA和Ki67表達顯著上調(diào)(P<0.01);與miR-9 inhibitor組相比較,淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor組克隆胰腺癌BxPC-3細胞數(shù)目顯著減少(P<0.01)、增殖標記相關(guān)蛋白PCNA和Ki67表達顯著下調(diào)(P<0.01)。

    圖5 淫羊藿苷對胰腺癌BxPC-3細胞增殖抑制作用與miR-9上調(diào)有關(guān)

    2.5淫羊藿苷對胰腺癌BxPC-3細胞凋亡誘導作用與miR-9上調(diào)有關(guān) 如圖6所示:與對照組相比,淫羊藿苷 50 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞凋亡率及凋亡標記相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3和Bax表達顯著增加(P<0.01)、凋亡標記相關(guān)蛋白Bcl-2表達顯著下調(diào)(P<0.01),miR-9 inhibitor組胰腺癌BxPC-3細胞凋亡率及凋亡標記相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3和Bax表達顯著減少(P<0.01)、凋亡標記蛋白Bcl-2表達顯著上調(diào)(P<0.01);與miR-9 inhibitor組相比較,淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor組胰腺癌BxPC-3細胞凋亡率及凋亡標記相關(guān)蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達顯著增加(P<0.01)、凋亡標記相關(guān)蛋白Bcl-2表達顯著下調(diào)(P<0.01)。

    圖6 淫羊藿苷對胰腺癌BxPC-3細胞凋亡誘導作用

    3 討論

    胰腺癌是最致命的惡性腫瘤之一,由于其表現(xiàn)較晚,癥狀不明確,缺乏有效的篩查手段,確診時已經(jīng)為晚期[6]。手術(shù)切除是胰腺癌的常用療法,但是,只有大約20%的胰腺癌可以手術(shù)切除,其余的胰腺癌患者不得不依靠放射線和化學療法,但是這些療法產(chǎn)生的治療效果小,存活率低[7]。胰腺癌預后很差,總體5年生存率只有5%~6%[8]。因此,急需開發(fā)治療胰腺癌的新藥物。淫羊藿苷是一種從中藥材淫羊藿中提取的植物類黃酮苷,具有調(diào)節(jié)免疫、抗抑郁、改善心血管功能等多種藥理活性。且已有眾多研究表明,淫羊藿苷具有廣泛的抗癌活性,可以有效地靶向癌癥干細胞和耐藥癌細胞,其作用機制包括細胞增殖凋亡及周期的調(diào)節(jié)、細胞侵襲遷移的調(diào)節(jié)、抗血管生成、抗轉(zhuǎn)移和免疫調(diào)節(jié)等[9]。如,淫羊藿苷通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的凋亡信號,對人食管癌細胞具有抗癌作用[10];淫羊藿苷通過激活AKT/mTOR/ATG5途徑抑制自噬,增強順鉑耐藥卵巢癌細胞的化學敏感性[11]。本研究發(fā)現(xiàn),淫羊藿苷呈劑量依賴性抑制胰腺癌BxPC-3細胞增殖,并誘導BxPC-3細胞凋亡。

    腫瘤細胞具有增殖速度快并無限復制的特性,抑制腫瘤細胞的增殖能力可有效抑制腫瘤的發(fā)展。已有報道,淫羊藿苷可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路激活來抑制非小細胞肺癌A549細胞的增殖[12]。PCNA和Ki67是目前運用最為廣泛的增殖標記蛋白,其表達量和細胞的增殖能力成正比[13]。本研究發(fā)現(xiàn),淫羊藿苷減少胰腺癌BxPC-3細胞克隆細胞數(shù)目,下調(diào)增殖標記蛋白PCNA和Ki67表達。因此,淫羊藿苷抑制胰腺癌BxPC-3細胞增殖。在正常機體中,細胞增殖與凋亡是處于動態(tài)平衡的,而在腫瘤細胞中,細胞增殖與凋亡是失衡的[14]。凋亡是一種程序性細胞死亡的形式,具有復雜多樣的潛在機制。當細胞受到物理刺激、藥物或放射線刺激時,它們會通過受體將這些信號轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)環(huán)境中。惡性腫瘤通常表現(xiàn)出凋亡失調(diào)現(xiàn)象。已有研究表明,淫羊藿苷通過mTOR信號通路抑制卵巢癌SKVCR細胞自噬,并促進細胞凋亡[15]。本研究表明,淫羊藿苷增加胰腺癌BxPC-3細胞凋亡率及凋亡標記蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達,下調(diào)凋亡標記蛋白Bcl-2表達。Caspase-3是最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者[16]。Bcl-2可抑制細胞色素C的釋放及caspase-3的激活,并可拮抗促凋亡基因Bax,抑制細胞的凋亡[17-18]。因此,淫羊藿苷誘導胰腺癌BxPC-3細胞凋亡。

    眾所周知,miRNA在細胞遺傳學中起著重要的作用。在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程,其與腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化和轉(zhuǎn)移有關(guān)。最近的研究報道,淫羊藿苷通過下調(diào)甲狀腺癌細胞中miR-625-3p來抑制細胞增殖、遷移和侵襲[19]。已有研究報道,miR-9-5p在胰腺癌組織和細胞系中顯著下調(diào),過表達miR-9-5p可以顯著抑制胰腺癌BxPC-3細胞的增殖和侵襲[20]。本研究發(fā)現(xiàn),淫羊藿苷上調(diào)胰腺癌BxPC-3細胞miR-9的表達,抑制miR-9表達可逆轉(zhuǎn)淫羊藿苷對胰腺癌BxPC-3細胞增殖和凋亡的作用。而陽性對照藥物順鉑對胰腺癌BxPC-3細胞miR-9的表達并無影響。這說明雖然陽性對照藥物順鉑與淫羊藿苷對胰腺癌BxPC-3細胞增殖和凋亡具有類似的作用效果,但是其作用機制卻有所不同。淫羊藿苷可通過上調(diào)miR-9抑制胰腺癌BxPC-3細胞增殖,并誘導BxPC-3細胞凋亡。

    綜上所述,淫羊藿苷抑制胰腺癌BxPC-3細胞增殖,并誘導BxPC-3細胞凋亡,這與miR-9上調(diào)有關(guān)。本研究僅為體外細胞實驗和機制的初步探討,體內(nèi)實驗和更為詳細的相關(guān)分子通路機制有待進一步研究。

    猜你喜歡
    藿苷貨號胰腺癌
    淫羊藿中朝藿苷A、B和C的酶轉(zhuǎn)化及其稀有箭藿苷的制備
    胰腺癌治療為什么這么難
    鞋品牌新品爆單“故事匯”
    作者更正致歉說明
    新型雙相酶水解體系制備寶藿苷I
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:26:00
    雙藿苷A分子印跡聚合物的制備及應用
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:49
    STAT1和MMP-2在胰腺癌中表達的意義
    早診早治趕走胰腺癌
    上海工運(2015年11期)2015-08-21 07:27:00
    中西醫(yī)結(jié)合護理晚期胰腺癌46例
    淫羊藿苷與過氧化氫酶相互作用的熒光光譜法和分子對接研究
    日本一本二区三区精品| 69av精品久久久久久| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲五月婷婷丁香| 性欧美人与动物交配| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 99久久精品国产亚洲精品| cao死你这个sao货| 狠狠狠狠99中文字幕| 黄色视频,在线免费观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲五月天丁香| 久99久视频精品免费| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲精华国产精华精| 天天添夜夜摸| 免费观看人在逋| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 99久久无色码亚洲精品果冻| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产精品av久久久久免费| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 午夜福利免费观看在线| 成在线人永久免费视频| av视频在线观看入口| 99久久无色码亚洲精品果冻| av有码第一页| 午夜亚洲福利在线播放| 俺也久久电影网| svipshipincom国产片| 久久久久久久久中文| 国产一区二区三区视频了| 欧美黑人精品巨大| 禁无遮挡网站| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲熟女毛片儿| 18禁国产床啪视频网站| 欧美黑人巨大hd| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产免费男女视频| 亚洲美女黄片视频| 夜夜爽天天搞| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 无限看片的www在线观看| 嫩草影视91久久| 床上黄色一级片| 亚洲欧美日韩高清专用| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产精品99久久99久久久不卡| 美女大奶头视频| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 免费在线观看黄色视频的| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产av在哪里看| 国产在线观看jvid| 国产成人精品无人区| xxxwww97欧美| 国产亚洲精品一区二区www| 少妇粗大呻吟视频| 最近视频中文字幕2019在线8| 又大又爽又粗| 免费在线观看日本一区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 男女下面进入的视频免费午夜| 极品教师在线免费播放| 成人国语在线视频| 欧美性长视频在线观看| 亚洲国产精品999在线| or卡值多少钱| 欧美丝袜亚洲另类 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| www.999成人在线观看| 久久久久国内视频| 国产99久久九九免费精品| 成人特级黄色片久久久久久久| av欧美777| 免费搜索国产男女视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美乱色亚洲激情| 少妇被粗大的猛进出69影院| 十八禁人妻一区二区| 99热这里只有精品一区 | 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产av又大| 欧美最黄视频在线播放免费| 日韩免费av在线播放| 十八禁网站免费在线| 高清毛片免费观看视频网站| 91大片在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲精品色激情综合| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲在线自拍视频| 嫩草影视91久久| 99国产综合亚洲精品| 精品欧美国产一区二区三| xxx96com| 波多野结衣高清无吗| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 91国产中文字幕| 免费观看精品视频网站| 成人国产一区最新在线观看| 极品教师在线免费播放| 老司机福利观看| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲片人在线观看| 午夜精品在线福利| 一级毛片精品| 欧美在线黄色| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日韩欧美在线二视频| 曰老女人黄片| 长腿黑丝高跟| x7x7x7水蜜桃| 国产免费男女视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 日本一二三区视频观看| 麻豆一二三区av精品| 午夜福利高清视频| 免费观看人在逋| 99热这里只有精品一区 | 91字幕亚洲| 99国产综合亚洲精品| e午夜精品久久久久久久| 黑人操中国人逼视频| 日本五十路高清| 男女之事视频高清在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 日本黄大片高清| 亚洲无线在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产成年人精品一区二区| 在线观看午夜福利视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产探花在线观看一区二区| 悠悠久久av| 嫩草影院精品99| 成人三级做爰电影| 熟女电影av网| 丝袜美腿诱惑在线| 最新美女视频免费是黄的| 欧美三级亚洲精品| 免费观看人在逋| 欧美中文综合在线视频| 国产一区二区三区视频了| 黄色视频不卡| 老司机午夜福利在线观看视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| www日本黄色视频网| 久久亚洲真实| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产三级中文精品| 国产成人精品无人区| 午夜成年电影在线免费观看| 两个人的视频大全免费| 国产精品爽爽va在线观看网站| 桃色一区二区三区在线观看| 手机成人av网站| 在线免费观看的www视频| 成年人黄色毛片网站| 在线播放国产精品三级| 欧美激情久久久久久爽电影| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 男人舔奶头视频| 久久精品影院6| 久久精品91无色码中文字幕| 男插女下体视频免费在线播放| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美3d第一页| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久人妻av系列| 亚洲av成人精品一区久久| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 精品电影一区二区在线| 久久天堂一区二区三区四区| 日韩欧美免费精品| 国产日本99.免费观看| 欧美一级a爱片免费观看看 | 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产欧美日韩一区二区三| tocl精华| 亚洲专区字幕在线| 国产91精品成人一区二区三区| 国产av又大| 国产成+人综合+亚洲专区| 丁香欧美五月| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 成人永久免费在线观看视频| avwww免费| 免费搜索国产男女视频| 婷婷丁香在线五月| 一本综合久久免费| 日本五十路高清| 久久精品成人免费网站| 成人欧美大片| 五月伊人婷婷丁香| 日本一区二区免费在线视频| 中文字幕久久专区| 12—13女人毛片做爰片一| 在线观看一区二区三区| 九色成人免费人妻av| 这个男人来自地球电影免费观看| 色av中文字幕| 天天一区二区日本电影三级| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产三级黄色录像| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产三级中文精品| 欧美乱妇无乱码| 99国产精品一区二区三区| 香蕉av资源在线| x7x7x7水蜜桃| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产黄a三级三级三级人| 女警被强在线播放| 欧美性长视频在线观看| 深夜精品福利| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 最近视频中文字幕2019在线8| www.精华液| 日韩免费av在线播放| 免费看美女性在线毛片视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 男人舔奶头视频| 日韩高清综合在线| 成人国产综合亚洲| 香蕉丝袜av| 国产成人av激情在线播放| 久久精品人妻少妇| 亚洲五月天丁香| 国产熟女xx| 亚洲精品色激情综合| 老司机午夜十八禁免费视频| 全区人妻精品视频| 最近最新免费中文字幕在线| 搡老熟女国产l中国老女人| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 最近在线观看免费完整版| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 草草在线视频免费看| 成人av在线播放网站| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲av美国av| svipshipincom国产片| 久久久久久九九精品二区国产 | 熟女电影av网| 精品久久久久久久末码| 久久久久免费精品人妻一区二区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美极品一区二区三区四区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 大型av网站在线播放| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲美女视频黄频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美三级亚洲精品| www.www免费av| 99国产精品一区二区三区| 亚洲18禁久久av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 999久久久国产精品视频| 欧美在线一区亚洲| 日韩国内少妇激情av| 欧美黑人欧美精品刺激| 日韩欧美在线二视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 一级片免费观看大全| 欧美最黄视频在线播放免费| 一进一出好大好爽视频| 91麻豆av在线| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 在线观看免费视频日本深夜| 免费观看人在逋| 国产av麻豆久久久久久久| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 精品久久蜜臀av无| 男人舔奶头视频| 男人的好看免费观看在线视频 | 免费搜索国产男女视频| netflix在线观看网站| 久久99热这里只有精品18| 99久久国产精品久久久| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲av电影在线进入| 国产人伦9x9x在线观看| 午夜福利欧美成人| 久久久久国产一级毛片高清牌| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产精品亚洲美女久久久| 国产精品一区二区三区四区久久| 在线播放国产精品三级| 欧美在线黄色| 精品午夜福利视频在线观看一区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 男人的好看免费观看在线视频 | 给我免费播放毛片高清在线观看| 欧美日韩精品网址| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | www.www免费av| 国产精品国产高清国产av| 黄色视频不卡| 国内精品久久久久精免费| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 日韩免费av在线播放| 久久精品成人免费网站| 国产精品乱码一区二三区的特点| 听说在线观看完整版免费高清| 观看免费一级毛片| 欧美黄色片欧美黄色片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 男女午夜视频在线观看| 久9热在线精品视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 99久久精品热视频| svipshipincom国产片| 亚洲乱码一区二区免费版| 后天国语完整版免费观看| 手机成人av网站| 搡老妇女老女人老熟妇| 黑人操中国人逼视频| 在线免费观看的www视频| 欧美中文日本在线观看视频| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲九九香蕉| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲国产欧美人成| 中文字幕高清在线视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 级片在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产精品永久免费网站| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 亚洲全国av大片| 麻豆国产av国片精品| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲午夜理论影院| 舔av片在线| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 99精品在免费线老司机午夜| 黄片小视频在线播放| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲国产精品sss在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产99白浆流出| www.www免费av| 一边摸一边做爽爽视频免费| av超薄肉色丝袜交足视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 精品久久久久久久毛片微露脸| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美黄色片欧美黄色片| 色尼玛亚洲综合影院| 一级a爱片免费观看的视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 老司机靠b影院| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久精品成人免费网站| 日本成人三级电影网站| 在线观看午夜福利视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 人成视频在线观看免费观看| 757午夜福利合集在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产成人av激情在线播放| 亚洲成人国产一区在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 欧美中文日本在线观看视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 精品久久蜜臀av无| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 色综合欧美亚洲国产小说| 精品久久久久久,| 欧美3d第一页| 午夜a级毛片| 国产激情久久老熟女| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 成熟少妇高潮喷水视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 成熟少妇高潮喷水视频| avwww免费| 高清在线国产一区| 99精品欧美一区二区三区四区| 级片在线观看| 哪里可以看免费的av片| 日日夜夜操网爽| 午夜福利免费观看在线| 黑人操中国人逼视频| 淫秽高清视频在线观看| 日韩欧美在线乱码| 亚洲七黄色美女视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 欧美大码av| 国产成年人精品一区二区| 最近最新中文字幕大全电影3| 一进一出好大好爽视频| 九色国产91popny在线| 免费av毛片视频| 精品第一国产精品| 久久精品综合一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区免费| 九九热线精品视视频播放| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久香蕉国产精品| 亚洲专区字幕在线| 色精品久久人妻99蜜桃| 小说图片视频综合网站| 国产精华一区二区三区| 久久精品91蜜桃| 精品熟女少妇八av免费久了| 好男人电影高清在线观看| 三级毛片av免费| 亚洲美女黄片视频| 日本三级黄在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 一本精品99久久精品77| 亚洲av美国av| 亚洲av片天天在线观看| 久久中文字幕一级| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 99riav亚洲国产免费| 亚洲熟女毛片儿| 国产真实乱freesex| 国产精品综合久久久久久久免费| 热99re8久久精品国产| 此物有八面人人有两片| 很黄的视频免费| 亚洲成人中文字幕在线播放| 女人被狂操c到高潮| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产高清videossex| 美女免费视频网站| 在线看三级毛片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 91老司机精品| 欧美+亚洲+日韩+国产| 美女扒开内裤让男人捅视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品高清国产在线一区| 国产精品,欧美在线| 老司机午夜福利在线观看视频| ponron亚洲| 欧美乱妇无乱码| 一区二区三区激情视频| 亚洲黑人精品在线| 日韩国内少妇激情av| 91成年电影在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产区一区二久久| 999久久久国产精品视频| 国产精品 国内视频| 国产精品野战在线观看| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产三级中文精品| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产高清有码在线观看视频 | 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美在线一区亚洲| 日韩精品中文字幕看吧| a级毛片a级免费在线| 怎么达到女性高潮| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 级片在线观看| 免费av毛片视频| 伦理电影免费视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产区一区二久久| 久久人人精品亚洲av| 午夜精品在线福利| 国产一级毛片七仙女欲春2| 老鸭窝网址在线观看| 黑人操中国人逼视频| 妹子高潮喷水视频| 精品国产美女av久久久久小说| 精品久久久久久成人av| 99国产极品粉嫩在线观看| 毛片女人毛片| 人妻夜夜爽99麻豆av| 黄片大片在线免费观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久精品影院6| 国产1区2区3区精品| 国产三级黄色录像| 一级毛片精品| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美一级毛片孕妇| av中文乱码字幕在线| 成年人黄色毛片网站| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 中亚洲国语对白在线视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 大型av网站在线播放| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 又黄又粗又硬又大视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产1区2区3区精品| 十八禁网站免费在线| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲精品色激情综合| 脱女人内裤的视频| 国产av不卡久久| 日日夜夜操网爽| 免费高清视频大片| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲美女黄片视频| 在线看三级毛片| 三级国产精品欧美在线观看 | 一本大道久久a久久精品| 久久精品影院6| 日韩大尺度精品在线看网址| 免费av毛片视频| 国产精品永久免费网站| 亚洲自拍偷在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 97碰自拍视频| 女人被狂操c到高潮| 男女午夜视频在线观看| 国产视频内射| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产日本99.免费观看| 此物有八面人人有两片| 国产麻豆成人av免费视频| 波多野结衣高清无吗| 99热6这里只有精品| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产成人av教育| 无遮挡黄片免费观看| 日本a在线网址| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产午夜精品论理片| 最近最新中文字幕大全免费视频| 曰老女人黄片| 久久久久国内视频| 老司机靠b影院| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日韩有码中文字幕| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲av片天天在线观看| 97碰自拍视频| 男女午夜视频在线观看| 男女视频在线观看网站免费 | 嫩草影视91久久| 亚洲精品国产一区二区精华液| 18禁国产床啪视频网站| 日韩大尺度精品在线看网址| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 一本综合久久免费| 久久精品成人免费网站| 亚洲电影在线观看av| 久99久视频精品免费| 亚洲美女黄片视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久久久久国产a免费观看| 成人精品一区二区免费| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久性视频一级片| 搡老岳熟女国产| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美日韩乱码在线| 国产一级毛片七仙女欲春2| 后天国语完整版免费观看| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲人成77777在线视频| av免费在线观看网站| 午夜精品久久久久久毛片777| 无遮挡黄片免费观看| 国产高清videossex| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 又黄又爽又免费观看的视频| 欧美乱妇无乱码| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 露出奶头的视频| 亚洲熟女毛片儿| 欧美中文日本在线观看视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 看片在线看免费视频| 69av精品久久久久久| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲激情在线av| 久久精品国产综合久久久| 1024视频免费在线观看| 嫩草影视91久久| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲九九香蕉| 两个人的视频大全免费|