WT1聯(lián)合多參數(shù)流式在急性髓系白血病預(yù)后的臨床觀察

章志學(xué)，肖曉芳，謝 將，王 英，劉 云，肖 祎

WT1聯(lián)合多參數(shù)流式在急性髓系白血病預(yù)后的臨床觀察

*章志學(xué)1，肖曉芳1，謝 將1，王 英1，劉 云1，肖 祎2

（1.吉安市中心人民醫(yī)院血液科，江西，吉安 343000；2. 井岡山大學(xué)數(shù)理學(xué)院，江西，吉安 343000）

研究WT1基因定量聯(lián)合多參數(shù)流式（FCM）在急性髓系白血?。ˋML)預(yù)后的臨床觀察。62例AML患者分為低危組、中危組、高危組；治療上參照《成人急性髓系白血?。ǚ羌毙栽缬琢＜?xì)胞白血病）中國(guó)診療指南2017年版》，用RT-qPCR方法測(cè)定患者WT1基因表達(dá)水平；同時(shí)用多參數(shù)流式細(xì)胞分析技術(shù)（FCM）分析患者低水平微小殘留（MRD）水平；比較不同預(yù)后患者WT1表達(dá)及WT1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。觀察WT1基因定量聯(lián)合FCM對(duì)AML患者預(yù)后評(píng)估的臨床意義。對(duì)患者進(jìn)行隨訪不低于2年。AML患者WT1高表達(dá)比例為77.42%（48/62），不同預(yù)后分型的AML患者WT1高表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（< 0.05）。在中、高危組的患者WT1高表達(dá)明顯高于低危組。初發(fā)的WT1高表達(dá)與WT1低表達(dá)患者在誘導(dǎo)緩解率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），但WT1高表達(dá)患者的2年無(wú)病生存率、2年總生存率均WT1低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（35.41% vs 71.43%，47.92% vs 85.71%< 0.05）。WT1基因聯(lián)合FCM預(yù)測(cè)AML早期復(fù)發(fā)的敏感性、特異性均高于單獨(dú)WT1基因和單獨(dú)的FCM（< 0.05）。WT1在AML患者中高表達(dá)，與患者預(yù)后相關(guān)，聯(lián)合FCM可有效的預(yù)測(cè)患者早期復(fù)發(fā)，可作為臨床治療及預(yù)后判斷的靶點(diǎn)。

WT1；FCM；急性髓系白血病；預(yù)后；臨床觀察

我國(guó)急性髓系白血?。ˋML）患者年發(fā)病率1.62/10萬(wàn)，是最常見的源于造血干細(xì)胞惡性克隆性血液病，占成人急性白血病60%～70%，AML的診斷及治療方案是臨床討論熱點(diǎn)[1]。AML接受治療后誘導(dǎo)緩解率較高，但是復(fù)發(fā)仍然是影響AML患者長(zhǎng)期預(yù)后的重要因素。目前AML患者的低水平微小殘留（MRD）的檢測(cè)仍無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，大多數(shù)單位用多參數(shù)流式分析技術(shù)（FCM）監(jiān)測(cè)MRD。隨著基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，AML相關(guān)異?；虻难芯恳渤蔀榕R床關(guān)注的重點(diǎn)，Wilms瘤基因（WT1）基因是一種編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，具有轉(zhuǎn)錄激活與抑制作用，參與調(diào)控了造血細(xì)胞的增值與分化過程，可能與AML的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)，可用于識(shí)別高?；颊摺⒂行ьA(yù)測(cè)治療效果[2-3]。本研究旨在探討WT1聯(lián)合FCM在急性髓系白血病預(yù)后的臨床觀察，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取吉安市中心人民醫(yī)院血液科2017年4月至2020年4月收治的62例AML患者，其中男性32例，女性30例；年齡（28～67）歲，平均（53.12 ± 3.54）歲；據(jù)FAB將AML[4]分型M0 1例、M1 3例、M2 35例、M4 11例、M5 12例。根據(jù)MICM分型并預(yù)后分析，低危組11例、中危組35例、高危組16例。由本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)此研究。診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《成人急性髓系白血?。ǚ羌毙栽缬琢＜?xì)胞白血?。┲袊?guó)診療指南2017年版》[5]中的AML相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者；初治與未正規(guī)治療的首次復(fù)發(fā)急性髓系白血病者（非M3型）；患者及家屬對(duì)本研究均知情同意者等。排除標(biāo)準(zhǔn)：急性早幼粒細(xì)胞白血?。∕3型），合并其他血液疾病者；合并其他惡性腫瘤者；中途退出研究者，妊娠期、哺乳期婦女等。

1.2 方法

患者均根據(jù)《成人急性髓系白血?。ǚ羌毙栽缬琢＜?xì)胞白血?。┲袊?guó)診療指南2017年版》中標(biāo)準(zhǔn)治療方案進(jìn)行治療。在患者誘導(dǎo)治療前測(cè)定WT1基因定量，在患者誘導(dǎo)緩解后1、3、6、12、18、24月分別抽取患者WT1基因定量檢測(cè)和FCM檢測(cè)。

1.2.1 WT1檢測(cè)方法

抽取患者空腹靜脈血3 mL，分離單個(gè)核細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，使用美國(guó)Life Technologies Applied Biosystems（ABI）公司的7500熒光定量PCR儀檢測(cè)患者WT1基因表達(dá)水平，用PCR擴(kuò)增方法，及用cDNA天然復(fù)制過程，由變性、退火、延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成，三個(gè)過程不斷循環(huán)，能夠?qū)⒛康腄NA片段擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍，PCR擴(kuò)增時(shí)，用特異性PCR引物和探針檢測(cè)WT1基因表達(dá)。PCR完畢后，根據(jù)實(shí)際情況設(shè)置閾值線，分析擴(kuò)增曲線，分別以WT1和ABL1標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定具體標(biāo)本的WT1拷貝數(shù)和ABL1拷貝數(shù)。用WT1/（1×104ABL1）方法計(jì)算表達(dá)量，WT1的相對(duì)表達(dá)水平以表達(dá)百分?jǐn)?shù)來(lái)表示，當(dāng)表達(dá)百分?jǐn)?shù)≤ 50%時(shí)，該樣本W(wǎng)T1為低表達(dá)；當(dāng)表達(dá)百分?jǐn)?shù) > 50%時(shí)，該樣本W(wǎng)T1為高表達(dá)。

1.2.2 FCM檢測(cè)技術(shù)

以 Diva 6. 1軟件對(duì)數(shù)取樣，每管獲取 100 000 個(gè)細(xì)胞，均通過 CD45 和側(cè)向角散射( side scatter，SSC) 設(shè)門，根據(jù)患者初診時(shí)的白血病相關(guān)免疫表型，選擇特異性8 ～12 種抗體，每種單抗加入 20μL，震蕩混勻后，室溫避光溫育20 min，加入溶血素以裂解紅細(xì)胞，離心去除上清液，用 PBS 洗滌后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。檢測(cè)靈敏度是0.01%，骨髓中白血病細(xì)≤ 0. 01% 為 MRD 陰性；骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)或FCM 檢測(cè)白血病細(xì)胞≥5%為復(fù)發(fā)，多個(gè)抗體組合以數(shù)值最大者為 MRD 值。

1.3 觀察指標(biāo)

①WT1表達(dá)情況：記錄AML患者治療前不同年齡、性別、AML分型、白細(xì)胞計(jì)數(shù)患者WT1表達(dá)情況。②WT1表達(dá)情況與預(yù)后的關(guān)系：觀察不同WT1表達(dá)患者1個(gè)療程后完全緩解率、2年無(wú)病生存率、2年總生存率，完全緩解定義為無(wú)AML所致癥狀、體征，血紅蛋白、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值、血小板復(fù)常，原始細(xì)胞小于百分之五，外周血中未發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞，紅細(xì)胞及巨核細(xì)胞系正常，患者生活正常[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[(%)]表示，及2檢驗(yàn)。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同預(yù)后初發(fā)AML患者WT1表達(dá)情況

AML初發(fā)患者WT1高表達(dá)比例為77.42%（48/62）。根據(jù)WHO分型將患者分為低、中、高危，低?；颊遅T1高表達(dá)比例45.45%（5/11），中?；颊遅T1高表達(dá)比例80.0%（29/35），高?；颊遅T1高表達(dá)比例93.75%（15/16），結(jié)果見表1。中、高?；颊叩腤T1高表達(dá)水平顯著高于低?；颊撸鋀T1高表達(dá)水平高于中?；颊?，三者比較均有顯著差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.05）。結(jié)果提示，初發(fā)患者WT1表達(dá)水平可以幫助判斷患者的預(yù)后。

表1 不同預(yù)后初發(fā)的AML患者WT1表達(dá)情況[n(%)]

2.2 治療前WT1表達(dá)情況與預(yù)后的關(guān)系

WT1高表達(dá)患者誘導(dǎo)完全緩解率較WT1低表達(dá)誘導(dǎo)緩解率低，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（0.05）。WT1高表達(dá)患者2年無(wú)病生存率及2年總生存率均低于WT1低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（35.41% vs 71.43%，47.92% vs 85.71%<0.05），結(jié)果見表2。

表2 WT1表達(dá)情況與預(yù)后的關(guān)系[n(%)]

2.3 誘導(dǎo)緩解的AML患者WT1定量檢測(cè)聯(lián)合FCM觀察患者復(fù)發(fā)情況

對(duì)誘導(dǎo)完全緩解的53例AML患者治療后2年的WT1和FCM隨訪分析顯示，WT1基因定量檢測(cè)AML復(fù)發(fā)敏感性為69.23%，特異性70.37%，有效性69.8%。FCM檢測(cè)MRD陽(yáng)性的敏感性為80.77%，特異性74.07%，有效性77.42%。兩種檢測(cè)方法在AML患者中無(wú)顯著差異（0.05）。兩種方法聯(lián)合檢測(cè)AML患者敏感性96.15%，特異性92.59%，有效性94.37%，明顯高于單一方法檢測(cè)，與WT1基因定量相比，有顯著差異（0.05）。

表3 53例AML患者隨訪的WT1基因定量與FCM監(jiān)測(cè)結(jié)果與復(fù)發(fā)診斷效能（%）

3 討論

目前AML患者誘導(dǎo)緩解率高，但仍有相當(dāng)一部分患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)而影響患者的長(zhǎng)期生存。動(dòng)態(tài)檢測(cè)MRD對(duì)于有效的識(shí)別高?；颊摺㈩A(yù)測(cè)復(fù)發(fā)、早期發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)并采取有效的措施就十分重要。國(guó)內(nèi)目前對(duì)于MRD的監(jiān)測(cè)仍沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。MRD監(jiān)測(cè)可以采用qRT-PCR、FCM以及熒光原位雜交等技術(shù)。目前臨床上多采用qRT-PCR以及FCM方法，F(xiàn)CM已在臨床廣泛使用并且成為監(jiān)測(cè)MRD的重要手段。由于AML患者的異質(zhì)性，缺乏特異性的融合基因。大量研究[6]顯示，WT1位于位于染色體11P13位點(diǎn)，因能調(diào)控造血細(xì)胞增生或分化，在血液腫瘤中研究較多。核因子κB、GATA結(jié)合蛋白1、GATA結(jié)合蛋白2、腦酸可溶性蛋白均可控制WT1的表達(dá)，而WT1的靶基因?yàn)楦蓴_素同源序列結(jié)合蛋白、鋅指蛋白224、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、TET2等，均為腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)靶基因[7]。在70%～90%AML患者中WT1基因顯示高表達(dá)[8]，可以作為監(jiān)測(cè)AML患者的MRD的有效方法。檢測(cè)WT1基因定量采用qRT-PCR方法，敏感度達(dá)到105，甚至可以達(dá)到106。因此WT1基因定量聯(lián)合FCM監(jiān)測(cè)MRD可成為AML患者預(yù)測(cè)早期復(fù)發(fā)的重要方法。

研究發(fā)現(xiàn)初發(fā)的AML患者（非M3）WT1高表達(dá)比例高達(dá)77.42%（48/62），比較不同預(yù)后分型的AML初發(fā)患者WT1表達(dá)水平，結(jié)果顯示預(yù)后越差的患者WT1高表達(dá)的比例越高，在中、高危組的表達(dá)明顯高于低危組，具有顯著差異（< 0.05）。此結(jié)果提示對(duì)初治的AML患者WT1的表達(dá)水平可以作為臨床危險(xiǎn)分級(jí)的指標(biāo)。對(duì)不同WT1表達(dá)情況的患者預(yù)后情況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)WT1高表達(dá)患者完全緩解率、2年無(wú)病生存率、2年總生存率均低于WT1低表達(dá)患者，提示W(wǎng)T1可作為近期及遠(yuǎn)期預(yù)后判斷指標(biāo)，WT1高表達(dá)可降低初治AML患者誘導(dǎo)化療緩解率，縮短生存時(shí)間。分析其原因?yàn)椋孩賅T1基因能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，為“泛白血病”基因，并抑制白血病癌細(xì)胞分化，因此高表達(dá)WT1基因可能存在癌基因特性，高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，能夠提高白血病細(xì)胞異型性[9-10]；②WT1基因特異性的表達(dá)多存在于未成熟原始幼稚細(xì)胞，具有轉(zhuǎn)錄激活與抑制作用，而在成熟細(xì)胞表達(dá)受到抑制，表達(dá)程度低，因此高表達(dá)WT1基因往往代表有更高的腫瘤負(fù)荷[11]；③WT1表達(dá)增加可能通過聚集去甲基化TET2、非洲爪蟾同系物1/2的相關(guān)因子進(jìn)而導(dǎo)致白血病細(xì)胞異常增殖，提高AML的惡性程度[12-14]。

本研究中，對(duì)于誘導(dǎo)完全緩解的53例AML患者隨訪了至少2年，WT1基因表達(dá)與患者緩解狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)，對(duì)緩解后FCM持續(xù)陰性，而WT1持續(xù)高表達(dá)的患者復(fù)發(fā)可能性極大，需要盡早行造血干細(xì)胞移植。WT1基因定量和FCM水平都能單獨(dú)有效的預(yù)測(cè)AML的早期復(fù)發(fā)，監(jiān)測(cè)MRD的WT1基因定量特異性高于敏感性，而FCM水平的敏感性高于特異性，兩者有互補(bǔ)作用，兩者聯(lián)合分析的敏感性（96.15%）、特異性（92.59%）及有效性（94.37%）都明顯高于各自獨(dú)立的預(yù)測(cè)。此結(jié)果提示在AML患者中WT1聯(lián)合FCM可更有效地預(yù)測(cè)患者早期復(fù)發(fā)，這與國(guó)內(nèi)郝英嬋等[15]的研究是相符的。

綜上，WT1在AML患者中高表達(dá)，且與患者預(yù)后息息相關(guān)，聯(lián)合FCM可以監(jiān)測(cè)患者M(jìn)RD，預(yù)測(cè)早期復(fù)發(fā)，可作為臨床治療及預(yù)后判斷的靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。

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CLINICAL OBSERVATION OF WT1 COMBINED WITH UULTI-PARAMETER FLOW CYTOMETRY IN PROGNOSIS OF ACUTE MYELOID LEUKEMIA

*ZHANG Zhi-Xue1, XIAO Xiao-Fan1, XIE Jiang1, WANG Ying1, LIU Yun1，XIAO Yi2

（1. Department of Hematology , Central People’s Hospital of Ji’an , Ji’an, Jiangxi 343000, China; 2. School of Mathematics and Physics, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China）

:To study the prognosis of acute myeloid leukemia (AML) patients with WT1 gene combined flow cytometry method (FCM).: 62 AML patients were divided into low-risk group, intermediate-risk group and high-risk group, according to WHO MICM classification. All patients were treated under“the 2017 adult acute AML (non-Acute promyelocytic leukemia, non-APL) Chinese guidelines”.The expression level of WT1 gene was measured by RT-qPCR method. FCM was used to analyze the minimal residual disease（MRD）level of patients. It was contrasted the expressions of WT1 in patients with different prognoses and the relationship between WT1 expressions and prognoses. It was observed the clinical significance of WT1 gene quantitative combined with FCM in evaluating the prognoses of AML patients.: The high expression rate of WT1 in AML patients was 77.42% (48/62), and there was no statistical difference in WT1 expressions of AML patients with the complete response rate (>0.05). But the 2-year disease-free survival rate and 2-year overall survival rate of patients with the high WT1 expression were all lower than those with the low WT1 expression, and the differences were statistically significant (35.41% vs 71.43%，47.92% vs 85.71%,<0.05). The sensitivity and specificity of WT1 gene combined with FCM to predict early recurrence of AML were higher than those of single gene and individual FCM (<0.05).: WT1 is highly expressed in AML patients and is closely related to the prognoses of patients, and WT1 combined with FCM can be used as a target for clinical treatment and prognosis judgment.

WT1; FCM; acute myeloid leukemia; prognosis; clinical observation

168085（2021）06-0088-05

R733.7

A

10.3669/j.issn.1674-8085.2021.06.016

2021-07-23；

2021-08-23

江西省衛(wèi)生健康委科技計(jì)劃項(xiàng)目(20191430)

*章志學(xué)(1975-)，女，江西吉安人，副主任醫(yī)師，副教授，主要從事血液病的研究(E-mail:zzxliu.2007@163.com)；

肖曉芳(1984-)，女，江西吉安人，主治醫(yī)師，主要從事急性白血病、淋巴瘤等血液病研究(E-mail:happy1984fang@163.com)；

謝 將(1986-)，男，江西吉安人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事惡性血液病的研究(E-mail:330812850@qq.com)；

王 英(1986-)，女，江西吉安人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事惡性血液病的研究(E-mail:3464885407@qq.com)；

劉 云(1988-)，男，江西贛州人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事惡性血液病的研究(E-mail:lyssh99@163.com)；

肖 祎(1990-)，女，江西吉安人，副教授，博士，主要從事大數(shù)據(jù)分析的研究(E-mail:xiaoyi@jgsu.edu.cn).