基于H蛋白表位合成肽的小反芻獸疫病毒抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立

錢 榜，李彥敏,2，朱學(xué)亮，張學(xué)燕，Niyokwishimira Alfred，竇永喜*，張志東,2

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046；2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041)

小反芻獸疫(peste des petits ruminants，PPR)是由副黏病毒科麻疹病毒屬小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)所引起的一種對(duì)小反芻類動(dòng)物具有高度致死性的病毒病[1-2]，主要通過直接接觸經(jīng)呼吸系統(tǒng)傳播，亦可通過精液、胚胎和乳汁等途徑傳播，是一種高度接觸性傳染病。PPRV主要宿主為山羊和綿羊等小反芻類動(dòng)物，報(bào)道表明駱駝[3-4]、牛和水牛等大型反芻動(dòng)物也可被感染[5-6]，但通常為亞臨床癥狀。此外，獅子、犬[7]、瞪羚、大羚羊、藍(lán)羚羊[8]以及野豬[9]也可感染PPRV。PPRV感染后臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、肺炎、腹瀉，呼吸道和消化道黏膜炎癥等[10]。PPR被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病[2,11-12]。自2007年在我國(guó)首次報(bào)道以來，該病在我國(guó)西藏、山東、內(nèi)蒙古等省(區(qū))蔓延傳播[13-15]，對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)的健康、有序發(fā)展造成嚴(yán)重挑戰(zhàn)[16]。

PPRV只有1個(gè)血清型，根據(jù) F蛋白及N蛋白基因序列將PPRV分為4個(gè)譜系(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)[17-19]，其中，我國(guó)流行的主要為Ⅳ系。該病毒為單股負(fù)鏈RNA病毒，共編碼8個(gè)蛋白，分別為融合蛋白(F)、血凝集素蛋白(H)、基質(zhì)蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白以及2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(C、V)[20-21]。N蛋白是病毒中含量最為豐富且免疫原性最強(qiáng)的蛋白，基于N蛋白的PPRV診斷技術(shù)已被廣泛開發(fā)應(yīng)用。H蛋白為病毒囊膜蛋白，分為膜內(nèi)區(qū)和膜外區(qū)，是麻疹病毒屬保守性最差的蛋白之一，該蛋白通過與宿主細(xì)胞受體結(jié)合從而決定病毒的細(xì)胞嗜性[22]，其為誘導(dǎo)宿主保護(hù)性免疫反應(yīng)的主要蛋白[23-24]。目前，針對(duì)PPRV的血清學(xué)檢測(cè)大部分以N和H蛋白產(chǎn)生的抗體為基礎(chǔ)。由于N蛋白不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)病毒的免疫保護(hù)且在麻疹病毒屬病毒中具有高度保守性，以N蛋白為基礎(chǔ)建立的檢測(cè)方法會(huì)產(chǎn)生一定的交叉反應(yīng)[25]；H蛋白在麻疹病毒屬所有成員中最為多樣化，種屬特異性強(qiáng)，且可誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)，因此該蛋白在DIVA(區(qū)分疫苗免疫和自然感染動(dòng)物)和免疫保護(hù)率檢測(cè)上具有一定的優(yōu)勢(shì)。

準(zhǔn)確地對(duì)PPR進(jìn)行診斷和疫苗免疫效果檢測(cè)有利于該病的預(yù)防控制，因此，本研究在PPRV H蛋白B細(xì)胞抗原表位篩選鑒定的基礎(chǔ)上，選擇與PPRV特異性抗體具有較好反應(yīng)原性的B細(xì)胞抗原表位片段，然后將其串聯(lián)后進(jìn)行合成，以合成的多肽作為包被抗原，建立PPRV H蛋白抗體iELISA檢測(cè)方法，對(duì)現(xiàn)有PPR檢測(cè)方法進(jìn)行補(bǔ)充，為該病的控制和消除提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 病毒株、血清及主要試劑

PPRV Nigeria 75/1疫苗毒株、PPRV標(biāo)準(zhǔn)陰性和陽性血清、O型口蹄疫病毒(FMDV)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、羊痘病毒(GPV)陽性血清、羊臨床血清樣品由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備保存；藍(lán)舌病病毒(BTV)陽性血清由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所獨(dú)軍政博士惠贈(zèng)。PPRV cELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自法國(guó)ID-Vet公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG二抗購(gòu)自SIGMA公司；TMB底物溶液購(gòu)自Sumodics公司；BSA購(gòu)自ExCell Bio公司；Silk-milk購(gòu)自BD公司，酪蛋白(Casin)購(gòu)自SIGMA公司。

1.2 H蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽的設(shè)計(jì)合成

本實(shí)驗(yàn)室用IEDB、Immunomedicine Group以及BepiPred 3種生物信息學(xué)軟件對(duì)H蛋白的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，共得到27條抗原表位肽并合成這些多肽，然后通過iELISA方法篩選鑒定，鑒定出了8個(gè)H蛋白具有反應(yīng)原性的B細(xì)胞表位，具體見表1[26]。然后，選擇其中反應(yīng)原性最好的4個(gè)表位H123、H185、H362、H487，以GS作為接頭進(jìn)行串聯(lián)，送上海強(qiáng)耀生物有限公司合成該肽段。

表1 PPRV H蛋白具反應(yīng)原性的B細(xì)胞表位Table 1 B cell epitopes with reactionogenicity

1.3 PPRV H蛋白抗體檢測(cè)iELISA方法的建立

1.3.1 iELISA方法 將合成的表位肽用包被液稀釋后包被96孔酶標(biāo)板，放于4 ℃過夜孵育；取出PBST洗板3～5次后甩干，加入含2%BSA的PBST于37 ℃封閉1 h；洗板后加入經(jīng)稀釋后的血清，置于37 ℃溫箱中孵育1 h；PBST洗板3～5次后甩干，加入經(jīng)稀釋后的酶標(biāo)二抗，置于37 ℃溫箱中孵育1 h；PBST洗板3～5次后甩干，加入底物TMB，每孔100 μL， 置于37 ℃溫箱中孵育15 min；取出酶標(biāo)板，每孔加入100 μL 2 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀讀取OD450 nm值。每個(gè)做2個(gè)重復(fù)孔。

1.3.2 表位肽抗原最適包被量和血清稀釋度的優(yōu)化 將表位肽抗原按照3×10-5、2.5×10-5、2.0×10-5、1.5×10-5、1.0×10-5、0.5×10-5μg·mL-1的濃度以pH9.6的碳酸氫鹽緩沖溶液為包被液包被96孔酶標(biāo)板，每孔100 μL, 4 ℃過夜孵育。PPRV標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清分別用PBST按照1∶25、1∶50、1∶100、1∶200稀釋，每孔100 μL，酶標(biāo)二抗用PBST按照說明書推薦稀釋度1∶40 000稀釋，底物為100 μL TMB溶液，終止液為100 μL 2 mol·L-1的H2SO4溶液，按照iELISA操作方法進(jìn)行試驗(yàn)，讀取OD450 nm值，選取P/N值較大的組合對(duì)應(yīng)的抗原包被量及血清稀釋度作為最佳抗原包被量和最佳血清稀釋度。

1.3.3 酶標(biāo)二抗稀釋度及其稀釋液的篩選和確定 在確定表位肽包被量及血清稀釋度的基礎(chǔ)上，保持底物及終止液不變，將酶標(biāo)二抗按1∶40 000及1∶80 000進(jìn)行稀釋，稀釋液分別用5% Silk-Milk-PBS、0.5%BSA-PBS、PBST進(jìn)行稀釋，按照iELISA操作方法進(jìn)行試驗(yàn)，讀取OD450 nm值，選擇P/N值最大的數(shù)值對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)二抗稀釋度和稀釋液種類作為最適稀釋度及其稀釋液。

1.3.4 包被液的篩選 在確定表位肽包被量、血清稀釋度、酶標(biāo)二抗稀釋度及其稀釋液的基礎(chǔ)上，以pH7.3的PBS溶液、pH7.6的碳酸鹽緩沖液以及pH9.6的碳酸氫鹽緩沖液分別作為包被液包被表位肽抗原，保持其他條件不變，按照iELISA操作方法進(jìn)行試驗(yàn)，讀取OD450 nm值，選取P/N值最大的數(shù)值對(duì)應(yīng)的包被液作為最佳包被液。

1.3.5 封閉液的篩選 在確定表位肽包被量、包被液、血清稀釋度、酶標(biāo)二抗稀釋度及其稀釋液的基礎(chǔ)上，保持其他條件不變，以10%的酪蛋白(Casin)-PBS、5%Silk-Milk-PBS、2%BSA-PBS分別作為封閉液，其他條件不變，按照iELISA操作方法進(jìn)行試驗(yàn)，讀取OD450 nm值，選取P/N值最大的數(shù)值對(duì)應(yīng)的封閉液作為最佳封閉液。

1.3.6 血清稀釋液的篩選 在確定表位肽包被量、包被液、封閉液、血清稀釋度、酶標(biāo)二抗稀釋度及其稀釋液的基礎(chǔ)上，以5%Milk-PBS、2%BSA-PBS及PBST作為血清稀釋液，保持其他條件不變，按照iELISA操作方法進(jìn)行試驗(yàn)，讀取OD450 nm值，選取P/N值最大的數(shù)值對(duì)應(yīng)的血清稀釋液作為最佳血清稀釋液。

1.4 重復(fù)性及特異性的測(cè)定

1.4.2 特異性試驗(yàn) 按照優(yōu)化的iELISA操作方法，分別對(duì)PPRV標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清、O型口蹄疫病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、羊痘病毒陽性血清及藍(lán)舌病病毒陽性血清樣品各3份進(jìn)行檢測(cè)，以此判斷此方法的特異性。

1.5 靈敏度分析

用該方法對(duì)稀釋后的血清進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定陽性血清最大稀釋倍數(shù)，從而評(píng)價(jià)所建立的iELISA檢測(cè)方法的靈敏度。

1.6 臨床血清樣本符合率檢測(cè)

分別用建立的iELISA方法和ID-Vet公司PPRV cELISA檢測(cè)試劑盒同時(shí)檢測(cè)臨床采集的306份羊血清樣本，統(tǒng)計(jì)計(jì)算兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 多表位肽抗原串聯(lián)及合成

表位肽串聯(lián)結(jié)果如表2所示，串聯(lián)后送上海強(qiáng)耀生物有限公司進(jìn)行合成，總量10 mg。合成肽產(chǎn)物經(jīng)HPLC及MS分析，結(jié)果如圖1A、B所示，顯示串聯(lián)后的表位肽成功合成，純度為90.57%。

A. HPLC分析；B. MS分析A. HPLC analysis; B. MS analysis圖1 合成多肽的HPLC、MS分析結(jié)果Fig.1 A HPLC and MS analysis report of synthetic multi-peptide

表2 H蛋白部分B細(xì)胞表位串聯(lián)的表位肽序列Table 2 A part of Series connection B cell epitopes sequence of H protein

2.2 表位肽抗原最適包被量及血清稀釋度的優(yōu)化

以不同量表位肽抗原包被96孔酶標(biāo)板，陰、陽性血清做1∶25、1∶50、1∶100、1∶200稀釋，按iELISA操作方法進(jìn)行多次方陣滴定試驗(yàn)，結(jié)果如圖2，通過比較可知在表位肽包被量為1.5×10-6μg·孔-1、血清1∶100稀釋時(shí)P/N值最高，因此確定1.5×10-6μg·孔-1為表位肽抗原最適包被量，1∶100為血清最佳工作濃度。

圖2 最適抗原包被量和血清最佳稀釋度的確定Fig.2 Determination of optimal amount of antigen coating and kind of serum dilution

2.3 酶標(biāo)二抗稀釋度及稀釋液的篩選和確定

固定包被抗原量和血清稀釋度，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG二抗篩選結(jié)果如圖3A所示，表明1∶80 000為該酶標(biāo)二抗的最佳稀釋度；對(duì)酶標(biāo)二抗稀釋液篩選結(jié)果如圖3B，則PBST為最佳酶標(biāo)二抗稀釋液。

A. 稀釋濃度的確定；B. 稀釋液的篩選A. Determination of antibody concentration; B. Determination of antibody diluent圖3 酶標(biāo)二抗稀釋濃度、稀釋液的篩選Fig.3 Determination of antibody concentration and antibody diluent of enzyme labeled secondary antibody

2.4 包被液、封閉液、血清稀釋液的篩選

對(duì)3種包被液、3種封閉液和3種血清稀釋液的篩選結(jié)果分別見圖4～6，通過篩選可知：碳酸氫鹽緩沖液為此方法最適包被液，2%BSA-PBS為最適封閉液，PBST溶液為最適血清稀釋液。

圖4 包被液的篩選Fig.4 Determination of coated buffer

圖5 封閉液的篩選Fig.5 Determination of blocking buffer

圖6 血清稀釋液的篩選Fig.6 Determination of serum dilution buffer

2.5 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

表3 237份PPRV陰性血清樣本檢測(cè)OD450 nm值統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 3 Detection results of 237 serum samples of PPRV negative

2.6 重復(fù)性分析結(jié)果

批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)如表4所示，結(jié)果顯示所檢測(cè)的4份血清同批次不同酶標(biāo)板之間變異系數(shù)最大的為8.3%，最小的為3.47%，均小于10%，說明該方法具有良好的批內(nèi)重復(fù)性；不同批次間重復(fù)性結(jié)果如表5所示，不同批次包被抗原檢測(cè)的4份血清各批次之間的變異系數(shù)均小于10%，說明該方法不同批次之間具有良好的重復(fù)性。

表4 批內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果Table 4 Results of batch repeatability detection

表5 批間重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果Table 5 Results of different batch repeatability detection

2.7 特異性分析

通過對(duì)PPRV標(biāo)準(zhǔn)陰性和陽性血清、O型口蹄疫病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、羊痘病毒陽性血清以及藍(lán)舌病病毒陽性血清各3份進(jìn)行檢測(cè)，各種血清的OD450 nm平均值結(jié)果如圖7所示，除3份PPRV陽性血清平均值為陽性外，其他血清平均值均為陰性，說明建立的iELISA檢測(cè)方法與O型口蹄疫病毒、羊痘病毒和藍(lán)舌病病毒的陽性血清均無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。

圖7 特異性檢測(cè)Fig.7 The results of specificity detection

2.8 靈敏度分析

用建立的iELISA檢測(cè)方法對(duì)稀釋后的PPRV陽性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，當(dāng)陽性血清稀度為1∶200 時(shí)，OD450 nm值仍大于臨界值0.25(圖8)，說明建立的iELISA檢測(cè)方法具有較好的靈敏度。

圖8 靈敏度檢測(cè)Fig.8 Sensitivity detection

2.9 臨床血清樣本符合率檢測(cè)

本研究建立的iELISA方法與ID-Vet公司的商品化PPRV cELISA檢測(cè)試劑盒平行檢測(cè)306份臨床羊血清，檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表6所示，cELISA檢測(cè)陽性血清為69份，陰性血清237份；iELISA檢測(cè)陽性51份，可疑17份，陰性238份，兩者相對(duì)符合率為92.81%。

表6 相對(duì)符合率統(tǒng)計(jì)Table 6 Statistics of relative coincidence rate

3 討 論

小反芻獸疫為一種急性、烈性的國(guó)家一類動(dòng)物傳染病，目前，尚無有效的治療方法[27]，這為該病的有效防控增加了難度，因此，建立快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)該病的防控尤為重要。ELISA因其快速、靈敏等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于PPRV抗原和抗體的檢測(cè)。

多抗原表位進(jìn)行串聯(lián)合成時(shí)在連接處插入柔性氨基酸進(jìn)行連接，有利于促進(jìn)蛋白酶水解的效率，提高抗原表位的遞呈效率。在兩個(gè)抗原表位之間以“GPGPG”作為連接位點(diǎn)可以避免形成新的表位片段[28]；然而在抗原表位之間以“AAY”作為連接點(diǎn)則可在一定程度上提高抗原表位的切割效率[29]。甘氨酸和絲氨酸是所有氨基酸中最具柔性的氨基酸，在各個(gè)抗原表位之間插入柔性氨基酸進(jìn)行連接，不僅能夠避免在連接處形成新的抗原表位序列，而且能夠保證不同抗原表位充分暴露。本研究采用甘氨酸(G)和絲氨酸(S)作為多表位抗原片段之間串聯(lián)的連接位點(diǎn)，因此在各個(gè)B細(xì)胞抗原表位連接處加入了GS序列進(jìn)行間隔。

以PPRV H蛋白中和單克隆抗體為基礎(chǔ)的cELISA和阻斷ELISA的檢測(cè)方法也已經(jīng)建立[31-32]，且利用病毒H蛋白單克隆抗體建立的ELISA檢測(cè)方法能夠有效提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。研究顯示，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的PPRV H蛋白，作為抗原建立的iELISA檢測(cè)方法與ID-Vet公司的商品化PPRV cELISA試劑盒相比符合率達(dá)到93.75%[33]。PPRV N蛋白454—472位氨基酸序列具有針對(duì)PPRV非常強(qiáng)的免疫原性，452—472氨基酸區(qū)域?yàn)槠渚€性B細(xì)胞表位，PPRV能夠被該區(qū)域產(chǎn)生的多肽抗體特異性識(shí)別，利用這一優(yōu)勢(shì)建立的檢測(cè)方法可用于PPRV與RPV的鑒別診斷；以N蛋白為抗原建立的ELISA檢測(cè)方法需依賴該蛋白特定抗原表位產(chǎn)生的單克隆抗體與被檢樣品中相應(yīng)抗體之間的相互競(jìng)爭(zhēng)，由于與N蛋白交叉反應(yīng)的缺乏，在陰性對(duì)照中只能觀察到45%的競(jìng)爭(zhēng)率[34]。麻疹病毒H蛋白是細(xì)胞嗜性的主要決定因素，牛瘟病毒H蛋白是導(dǎo)致兔化弱毒株跨種致病的主要原因[35]，這些研究表明H蛋白為麻疹病毒屬病毒最重要的毒力蛋白。已有相應(yīng)研究對(duì)PPRV H蛋白的功能域進(jìn)行繪制，位于263—368位以及539—609位氨基酸位點(diǎn)的免疫顯性表位最多[36-37]，由于H蛋白在麻疹病毒屬成員中是最為多樣化的，所以以H蛋白作為靶標(biāo)進(jìn)行設(shè)計(jì)DIVA檢測(cè)方法具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢(shì)。

本研究以篩選的PPRV H蛋白B細(xì)胞抗原表位為基礎(chǔ)，將鑒定后反應(yīng)原性較好的4段抗原表位串聯(lián)后合成作為包被抗原建立針對(duì)H蛋白抗體的iELISA檢測(cè)方法，通過對(duì)306份臨床血清檢測(cè)證實(shí)其與ID-Vet公司的商品化PPRV cELISA檢測(cè)試劑盒相比符合率為92.81%，與羊痘、口蹄疫、藍(lán)舌病病毒陽性血清無交叉反應(yīng)，說明建立的檢測(cè)方法具有較好的敏感性和特異性，可用于臨床血清檢測(cè)，具有開發(fā)相關(guān)檢測(cè)試劑盒的可能性。

4 結(jié) 論

建立了針對(duì)PPRV H 蛋白抗體的iELISA檢測(cè)方法,該方法特異敏感，與ID-Vet公司的商品化PPRV cELISA檢測(cè)試劑盒相比符合率為92.81%，可用于臨床血清樣品檢測(cè)。