鑒別非洲豬瘟病毒和豬瘟病毒野毒株二重TaqMan MGB實(shí)時熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

王淑娟，班付國，王東方，劉 影，趙雪麗，謝彩華，王 翠，馬震原，楊海波，柴 茂，閆若潛

(河南省動物疫病預(yù)防控制中心， 鄭州 450008)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF) 是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的一種急性、高度接觸性傳染疫病[1]，可引起豬高熱、精神沉郁、皮膚發(fā)紺、食欲廢絕、出血性病變和共濟(jì)失調(diào)，并伴有嚴(yán)重的血小板和淋巴細(xì)胞減少，感染動物通常在感染后10～14 d內(nèi)死亡，病死率可達(dá)100%[2]。ASFV基因組為雙鏈DNA，大小170～194 kb[3]。病毒基因可編碼200多種蛋白質(zhì)，其中，結(jié)構(gòu)蛋白有54種，P72是一種結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒衣殼的主要組成部分，P72基因序列保守，不同毒株之間都有相同的保守序列[4]。

豬瘟(classical swine fever, CSF)是由豬瘟病毒(CSFV) 引起的一種高致死性、烈性傳染病[5]，以稽留高熱、出血、母豬流產(chǎn)為主要特征。該病主要通過呼吸道和消化道傳染，傳播速度快，發(fā)病率和死亡率都很高，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。CSFV 屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，為單股正鏈RNA病毒。CSFV基因組全長12.3 kb，主要由5′非編碼區(qū)(5′UTR)、開放閱讀框(ORF)和 3′非編碼區(qū)(3′UTR)3部分組成，5′UTR 由360～374個堿基組成，具有很高的保守性，能夠形成復(fù)雜穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)[8]。

非洲豬瘟和豬瘟引起的臨床癥狀極為相似，必須借助實(shí)驗(yàn)室檢測進(jìn)行鑒別診斷。目前，非洲豬瘟病毒的檢測方法很多，血清學(xué)方法有間接 ELISA、阻斷 ELISA和間接熒光抗體試驗(yàn)；病原學(xué)方法有病毒的細(xì)胞培養(yǎng)和分離、直接免疫熒光、雙抗體夾心ELISA、普通PCR和熒光定量PCR (FQ-PCR) 等，其中，OIE 推薦的普通PCR和熒光定量 PCR 是最為常用的實(shí)驗(yàn)室檢測方法[9]?，F(xiàn)有的CSFV診斷方法有免疫熒光、ELISA、病毒分離、RT-PCR等，但這些方法都存在敏感性、特異性低及耗時等不足，且不能區(qū)分野毒株和疫苗株[10-12]。

在已有的研究基礎(chǔ)上，作者根據(jù)ASFV的P72基因和CSFV的5′UTR非編碼區(qū)序列保守的特點(diǎn)，分別設(shè)計1對特異性引物和1條TaqMan MGB探針，可在一個反應(yīng)體系內(nèi)同時檢測ASFV和CSFV野毒株，為ASFV和CSFV野毒株的鑒別診斷提供了快速、敏感、特異的臨床檢測方法。

1 材料與方法

1.1 陽性物質(zhì)和毒(菌)株

ASFV目的基因由寶生物工程(大連)有限公司合成；豬瘟活疫苗購自廣東永順生物制藥股份有限公司；滅活的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬乙型腦炎病毒(JEV)、副豬嗜血桿菌(HPS)等均由河南省動物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器設(shè)備與主要試劑

全自動核酸提取儀，美國Thermo公司產(chǎn)品；熒光PCR儀，美國ABI公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀，德國Biometra公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Alpha Innotech公司產(chǎn)品；臺式高速冷凍離心機(jī)，美國Heraeus公司產(chǎn)品；核酸提取試劑盒購自西安天隆科技有限公司；PrimeScript RT Master Mix、ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、酶抑制劑等均購自寶生物工程(大連)有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、pGEM-T Easy載體等購自Promega公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

利用全自動核酸提取儀從ASFV人工合成片段中提取核酸，即為ASFV DNA，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。利用全自動核酸提取儀從CSFV野毒株陽性樣品中提取核酸，并用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩２捎肞CR方法分別擴(kuò)增ASFV的P72基因和CSFV野毒株的5′UTR非編碼區(qū)目的基因，并將陽性擴(kuò)增產(chǎn)物分別克隆入pGEM-T Easy載體中，篩選陽性重組質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司，采用T7和SP6引物進(jìn)行測序。測序正確的ASFV的P72基因和CSFV的5′UTR非編碼區(qū)基因的陽性重組質(zhì)粒(分別命名為pGEM-ASFV、pGEM-CSFV)，應(yīng)用分光光度計測定其OD260 nm和OD280 nm值及OD260 nm/OD280 nm值，共重復(fù)5次，參考Kim等[13]介紹的方法計算其濃度，獲得ASFV和CSFV陽性標(biāo)準(zhǔn)品，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物和探針的設(shè)計和合成

根據(jù)ASFV的P72基因和CSFV的5′UTR非編碼區(qū)序列保守的特點(diǎn)，分別比對GenBank中ASFV的P72基因和CSFV的5′UTR非編碼區(qū)序列，應(yīng)用Primer Premier6.0基因分析軟件，設(shè)計兩對特異性引物對和兩條TaqMan MGB探針，分別命名為ASFV-P1、ASFV-P2、ASFV-Probe-P3、CSFV-P4、CSFV-P5、CSFV-Probe-P6，引物序列見表1。引物和探針均由Invitrogen公司合成。

表1 二重TaqMan MGB FQ-PCR引物和探針序列Table 1 The primers and probes sequences of duplex TaqMan MGB FQ-PCR

1.5 反應(yīng)體系與條件的優(yōu)化

pGEM-ASFV、pGEM-CSFV重組質(zhì)粒分別稀釋至終濃度1.0×105拷貝·μL-1作為檢測模板，P1/P2、P4/P5引物對分別稀釋至終濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.0 μmol·L-1，Probe-P3、Probe-P6探針分別稀釋到終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.0 μmol·L-1，應(yīng)用熒光PCR儀采用矩陣法篩選不同濃度的針對pGEM-ASFV和pGEM-CSFV擴(kuò)增的引物/探針組合；在56、57、58、59、60、61和62 ℃的退火溫度下進(jìn)行擴(kuò)增。篩選鑒別ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR最佳引物濃度、探針濃度和最佳反應(yīng)條件。

1.6 敏感性試驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將pGEM-ASFV和pGEM-CSFV陽性重組質(zhì)粒分別進(jìn)行10倍系列稀釋，2種質(zhì)粒按1∶1比例混合，每種質(zhì)粒終濃度調(diào)整為1.0×106～1.0×100拷貝·μL-1， 共7個稀釋度，以純水為陰性對照，按優(yōu)化好的FQ-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR敏感性試驗(yàn)。分別以pGEM-ASFV和pGEM-CSFV陽性重組質(zhì)粒起始模板濃度的對數(shù)為X軸，以FQ-PCR循環(huán)次數(shù)Ct值為Y軸作回歸曲線，建立ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 特異性試驗(yàn)

對豬瘟病毒疫苗株(CSFV-Vac)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬乙型腦炎病毒(JEV)、副豬嗜血桿菌(HPS)、陰性對照等提取核酸并將CSFV-Vac、PRRSV、JEV核酸進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，同時，以ASFV和CSFV陽性標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對照，按優(yōu)化好的反應(yīng)條件進(jìn)行二重FQ-PCR擴(kuò)增以驗(yàn)證該方法的特異性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

分別將3個濃度的10倍系列稀釋的pGEM-ASFV和pGEM-CSFV陽性重組質(zhì)粒等量混合物(每種質(zhì)粒終濃度1.0×105～1.0×103)按照優(yōu)化的FQ-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，每個系列設(shè)定3個重復(fù)，分成3個批次進(jìn)行驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。

1.9 應(yīng)用試驗(yàn)

對20份疑似CSFV感染樣品(樣品編號：1～20)、10份臨床疑似ASFV感染樣品(樣品編號：21～30)和20份健康豬樣品(樣品編號：31～50)分別采用本研究建立的鑒別ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR方法和豬瘟國標(biāo)方法及OIE推薦的非洲豬瘟檢測方法檢測進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測，同時，以ASFV和CSFV陽性標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對照，以純水為陰性對照。對這些方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品濃度測定

計算pGEM-ASFV、pGEM-CSFV質(zhì)粒DNA溶液的濃度分別為8.75×1010、7.96×1010拷貝·μL-1，分別定量稀釋至1.0×100～1.0×106拷貝·μL-1。

2.2 鑒別ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR方法反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化

本研究對引物與探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，以提高反應(yīng)的擴(kuò)增效率與敏感度。優(yōu)化出25 μL反應(yīng)體系：ASFV-P1、ASFV-P2、CSFV-P4、CSFV-P5終濃度各為0.4 μmol·L-1，探針ASFV-Probe-P3終濃度為0.4 μmol·L-1，探針CSFV-Probe-P6終濃度為0.6 μmol·L-1，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，10×ExTaq酶緩沖液2.5 μL，5 U·μL-1ExTaqDNA聚合酶0.3 μL，1.0×105拷貝·μL-1的質(zhì)粒模板各2 μL，去離子水補(bǔ)足至總體積25 μL。最佳反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。最佳反應(yīng)條件下的二重FQ-PCR結(jié)果見圖1。

1.ASFV重組質(zhì)粒; 2. CSFV重組質(zhì)粒; 3. 陰性對照; 4～10. CSFV-Vac、PRRSV、PRV、PCV2、PPV、JEV和HPS1. Recombinant plasmid of ASFV; 2. Recombinant plasmid of CSFV; 3. Negative control; 4-10. CSFV-Vac, PRRSV, PRV, PCV2, PPV, JEV and HPS圖1 鑒別ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR方法建立及特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Establishment and specificity analysis of duplex TaqMan MGB FQ-PCR

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立、敏感性試驗(yàn)和判定標(biāo)準(zhǔn)的初步確定

二重FQ-PCR對pGEM-ASFV和pGEM-CSFV陽性重組質(zhì)粒的最低檢出限均為1.0×101拷貝·μL-1(圖2)。由敏感性檢測結(jié)果建立ASFV標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R2為0.996，斜率為-4.161， 截距為39.17，從而得出拷貝數(shù)(x)與Ct值之間的線性關(guān)系表達(dá)式：y=-4.161lgx+39.17(圖3A)；由敏感性檢測結(jié)果建立CSFV型標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R2為0.997，斜率為-3.582，截距為37.87，從而得出拷貝數(shù)(x)與Ct值之間的線性關(guān)系表達(dá)式：y=-3.582lgx+37.87(圖3B)。

A. ASFV；B. CSFV；1～7. 分別對應(yīng)的質(zhì)粒濃度1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100拷貝·μL-1；8、9.陰性對照A. ASFV; B. CSFV; 1-7. The plasmid concentrations is 1.0×106, 1.0×105, 1.0×104, 1.0×103, 1.0×102, 1.0×101, 1.0×100copies·μL-1, respectively; 8, 9. Negative control圖2 ASFV、CSFV FQ-PCR方法的敏感性試驗(yàn)Fig.2 Sensitivity tests of ASFV, CSFV FQ-PCR

A. ASFV；B. CSFV; x為拷貝數(shù)A. ASFV; B. CSFV; x. Copies number圖3 ASFV、CSFV FQ-PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of ASFV, CSFV FQ-PCR

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，初步將判定標(biāo)準(zhǔn)定為如果被檢樣本的PCR反應(yīng)體系通道出現(xiàn)2條特定的擴(kuò)增曲線，且Ct值≤33.0，則可判定為非洲豬瘟病毒及豬瘟野毒株核酸陽性；如果被檢樣本的PCR反應(yīng)體系通道無特定的擴(kuò)增曲線，且Ct值>35.0或無，則判定為非洲豬瘟病毒及豬瘟野毒株核酸陰性；如果被檢樣本的PCR反應(yīng)體系通道出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，且33.0

2.4 特異性試驗(yàn)

ASFV、CSFV陽性標(biāo)準(zhǔn)品FQ-PCR擴(kuò)增Ct值分別為17.02和19.87且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線；陰性對照和CSFV-Vac、PRRSV、PRV、PCV2、PPV、JEV、HPS等均未出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(圖1)，說明本方法特異性良好。

2.5 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)

ASFV FQ-PCR方法和CSFV FQ-PCR方法批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)(CV值)均在3%以下，擴(kuò)增效率穩(wěn)定，表明建立的鑒別ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR方法具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

表2 ASFV FQ-PCR方法穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)Table 2 The results of ASFV FQ-PCR stability and repeatability

表3 CSFV FQ-PCR方法穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)Table 3 The results of CSFV FQ-PCR stability and repeatability

2.6 應(yīng)用試驗(yàn)

采用本研究建立的鑒別ASFV、CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法對50份臨床樣品進(jìn)行檢測，共檢測出17份CSFV陽性、3份ASFV陽性，檢測結(jié)果與豬瘟國標(biāo)方法及OIE推薦的非洲豬瘟檢測方法檢測結(jié)果完全一致，表明本研究建立的鑒別ASFV、CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法具有較高的特異性和敏感性，可用于臨床ASFV和CSFV野毒株的鑒別診斷。

3 討 論

ASF最早于1921年在肯尼亞暴發(fā)，隨后相繼擴(kuò)散至歐洲、中美洲、非洲和亞洲的多個國家[14]，該病病程短、發(fā)病率和死亡率幾乎達(dá)100%，中國首例非洲豬瘟疫情于2018年8月在遼寧沈陽暴發(fā)[15]， 隨后疫情持續(xù)在我國迅速蔓延開來，嚴(yán)重威脅著我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。CSF傳播速度快，發(fā)病率和死亡率都很高，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。這兩種疫病都被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報告的動物疫病，也是中國動物病原微生物名錄中規(guī)定的一類動物傳染病[16-19]。

雖然距首次發(fā)現(xiàn)ASFV至今已將近百年，但目前世界上仍沒有可有效預(yù)防ASFV感染的疫苗，也無有效的治療藥物，僅能依賴有限的抗原檢測方法對ASFV感染開展早期診斷，進(jìn)而通過撲殺感染動物來實(shí)現(xiàn)對ASF疫情的控制。目前,我國也有針對豬瘟的疫苗，但疫苗生產(chǎn)企業(yè)眾多，疫苗質(zhì)量參差不齊，免疫失敗時有發(fā)生，且CSF的臨床表現(xiàn)趨于復(fù)雜化，典型性病例減少[20]，單憑臨床癥狀很難確診。且由于 ASF 與CSF等其他出血性豬病的發(fā)病癥狀非常相似，很難通過臨床診斷的方法進(jìn)行區(qū)分，只能依靠實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行鑒別診斷。因此，建立對 ASFV和CSFV野毒株快速、特異、敏感的鑒別診斷方法對疫情防控尤為重要。

國內(nèi)外很多學(xué)者建立了ASFV和CSFV的PCR或熒光定量PCR方法，Aguero等[21]根據(jù)ASFVVP72 基因設(shè)計引物，建立了用于ASFV早期感染的快速診斷方法；Basto等[22]建立了可用于檢測蜱蟲體內(nèi)ASFV的套氏PCR方法；崔尚金等[23]建立了ASFV的高效納米PCR檢測方法；King等[24]、黃萍等[25]、Tignon等[26]多個研究團(tuán)隊先后以ASFVVP72基因?yàn)榘谢蚪⒒赥aqMan的ASFV實(shí)時熒光定量PCR檢測方法；Mckillen等[27]根據(jù)9GL基因建立MGB探針實(shí)時熒光定量PCR檢測方法。Risatti等[28]首次建立了CSFV的FQ-PCR方法；Liu 等[29]將CSFV檢測一步RT-PCR方法與FQ-PCR方法進(jìn)行了比較，認(rèn)為前者適合低成本檢測，后者能實(shí)現(xiàn)高通量； Ciglenecki等[30]對染料法和MGB探針法進(jìn)行了比較，認(rèn)為MGB 探針法定量優(yōu)于前者。但是這些PCR檢測方法的靈敏度和特異性均相對偏低，且不能實(shí)現(xiàn)ASFV和CSFV的鑒別檢測。

本研究建立的鑒別ASFV、CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法是在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行ASFV和CSFV的擴(kuò)增反應(yīng)，同時收集不同的熒光信號，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時檢測，從而實(shí)現(xiàn)ASFV和CSFV野毒株的鑒別檢測。本研究建立的FQ-PCR方法采用TaqMan MGB探針，與傳統(tǒng)的TaqMan探針相比，TaqMan MGB探針縮短了探針的長度，大大提高了探針的Tm值，也降低了探針的合成成本，TaqMan MGB探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)，其本身不產(chǎn)生熒光信號，可大大降低本底信號的強(qiáng)度，使擴(kuò)增結(jié)果更加特異、敏感。本研究建立的方法操作簡便、速度快，可在1 h內(nèi)完成ASFV和CSFV野毒株的鑒別檢測。

本研究建立的鑒別ASFV、CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法是根據(jù)ASFV和CSFV野毒株基因序列保守區(qū)設(shè)計引物和探針，方法對ASFV和CSFV野毒株的最低檢測模板濃度均為10 拷貝·μL-1，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性和重復(fù)性良好；對50份臨床樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果與豬瘟國標(biāo)方法及OIE推薦的非洲豬瘟檢測方法結(jié)果完全一致。因此，本研究建立的鑒別ASFV、CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法為ASFV和CSFV野毒株的鑒別診斷提供了快速、敏感、特異且能滿足臨床檢測需求的新方法。

4 結(jié) 論

成功建立了可對非洲豬瘟病毒和豬瘟病毒野毒株鑒別檢測的二重TaqMan MGB實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，該方法敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，對臨床樣品的檢測結(jié)果與豬瘟國標(biāo)方法及OIE推薦的非洲豬瘟檢測方法結(jié)果完全一致。該方法的建立為ASFV和CSFV野毒株的鑒別診斷提供了新的檢測方法。