水貂酪氨酸酶(TYR)基因克隆、SNPs篩查及其皮膚組織mRNA差異表達分析

宋興超，劉琳玲，潘虹軍，趙家平，賈 赟，楊福合*，徐 超*

(1.銅仁學院，銅仁 554300； 2.中國農業(yè)科學院特產研究所，長春 130112； 3.大連海關技術中心，大連 116001)

水貂(Neovisonvison)屬于鼬科鼬屬，肉食性珍貴毛皮動物，貂皮為其主要產品，被稱作“軟黃金”，是水貂經濟價值的重要體現(xiàn)，用作貂皮服裝及服飾制品的主要原料[1]。隨著人們生活水平和消費質量的不斷提高與改善，越來越多的消費者轉向需求優(yōu)質、綠色和環(huán)保的毛皮產品，不經過化學染色的純天然彩色毛皮產品逐漸受到更多消費者的關注[2-3]。因此，生產優(yōu)質、綠色和環(huán)保的毛皮產品已成為水貂新品種培育的前提，更是產業(yè)需要緊迫解決的核心問題[4]。毛色是關聯(lián)水貂毛皮品質及價值的重要質量性狀，也是其優(yōu)良品種培育過程中需要制定的一項關鍵育種目標，要求具有本品種的毛色特征，全身一致，無雜色毛，頜下或腹部白斑不超過1.0 cm2或無白斑，并且個體間色調均勻[5]。因此，探明水貂毛色性狀分子遺傳機理，進而培育具有天然色彩的優(yōu)異個體對其品種推廣利用工作尤為重要，具有較大的科研與經濟價值。

已有研究表明，脊椎動物膚色、毛色及羽色主要取決于皮膚、毛發(fā)及羽毛中黑色素種類、數(shù)量及比例，目前，研究相對清楚的有真黑色素(黑與褐)和褐黑色素(紅與黃)[6]。在黑色素形成過程中，酪氨酸酶的活性決定了黑色素合成量的多少，因此，編碼該酶的酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)基因已成為解析色素沉積性狀分子機理的關鍵突破口。在TYR基因SNPs篩查方面，Anistoroaei等[7]研究發(fā)現(xiàn)，TYR基因編碼區(qū)變異(138.TGT→TGA)可能導致蛋白結構功能域縮短，與丹麥水貂白化被毛性狀相關。Blaszczyk等[8]利用Southern雜交表明，TYR基因外顯子4缺失與雪貂白化相關。Damé等[9]研究表明，白化水牛TYR基因位點g.1403G>A引起終止密碼子形成，導致無活性蛋白合成，與水牛被毛白化性狀關聯(lián)較大。在TYR基因mRNA與蛋白表達方面，Anello等[10]通過qPCR研究表明，白色被毛羊駝皮膚組織TYR基因mRNA表達量顯著低于稀釋和非稀釋被毛個體(P<0.05)，分析揭示，TYR基因表達水平在羊駝被毛色素沉積中具有重要調控功能。趙若陽等[11]利用qPCR和Western blot研究均表明，越背花毛蒙古馬黑色被毛對應皮膚中TYR基因mRNA與蛋白表達量極顯著高于白色毛對應皮膚(P<0.001或P<0.01)，綜合推測，過量且具有活性的TYR是促進越背花毛蒙古馬黑色被毛部位皮膚合成較多真黑色素的主要因素。目前，僅見水貂TYR基因部分cDNA序列報道[12]，而該基因完整編碼區(qū)序列(coding sequence，CDS)的結構特性、SNPs及其皮膚組織mRNA表達規(guī)律與水貂毛色性狀的關系尚不明晰。

為進一步解析水貂被毛色素沉積分子調控機制，本研究通過克隆水貂TYR基因完整編碼區(qū)序列，分析CDS分子結構特性，篩查部分外顯子SNPs及明確該基因在不同毛色水貂皮膚組織mRNA差異表達規(guī)律，探究變異位點和mRNA差異表達與毛色性狀的關系，旨在深入解析TYR基因調控水貂毛色表型的功能，為加快分子標記輔助選擇技術應用于優(yōu)質毛色水貂品種的選育與改良提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

金州黑水貂(黑色，JZH，120只)、名威銀藍水貂(灰色，MWYL，95只)和紅眼白水貂(白色，HYB，86只)共計301只7月齡雄性個體的血液取自中國農業(yè)科學院特產研究所特種畜禽實驗基地(吉林，左家)和大連名威貂業(yè)有限公司(遼寧，金州)。于毛皮成熟期(12月初)，選擇黑、灰與白色被毛水貂各3只， 采集背中部皮膚1 cm2左右，液氮保存。

1.2 主要試劑

全血DNA提取試劑盒、ExTaqDNA聚合酶、Trizol Reagent和反轉錄試劑盒均購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司；SYBR?Select Master Mix購自Thermo Fisher公司。

1.3 水貂血液基因組DNA與皮膚RNA的提取

利用全血DNA提取試劑盒獲得水貂基因組DNA，采用Trizol法提取皮膚RNA，參考反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA，保存于-20 ℃冰箱。

1.4 引物設計、PCR擴增與克隆測序

參考GenBank數(shù)據庫中雪貂(EF405957)、海豹(XM_004412938)、綿羊(HQ875337)和家兔(NM_001082077)等哺乳動物的TYR基因編碼區(qū)全序列，經過BioEdit 7.2軟件進行比對后，利用Primer Primier 5.0軟件在5個外顯子兩端的保守區(qū)域分別設計5對擴增完整外顯子的引物，以TYR-1、TYR-4和TYR-5作為檢測SNPs的引物，根據前期獲得的水貂皮膚轉錄組測序數(shù)據中TYR基因mRNA序列[13]設計qRT-PCR引物T-1，選取β-actin作為qRT-PCR內參基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成，相關信息見表1。

PCR體系為25 μL：模板DNA 1.0 μL，ExTaqDNA 聚合酶(5 U·μL-1)0.25 μL，dNTPs 2.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，上、下游引物(10 pmol·μL-1) 各1.0 μL，滅菌超純水17.25 μL。PCR程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火(溫度見表1)30 s，72 ℃延伸(時間見表1)，共38個循環(huán)；72 ℃延伸8 min；4 ℃保存。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，并送上海生工生物工程有限公司進行克隆、測序。

1.5 水貂TYR基因編碼區(qū)序列生物信息學分析

測序數(shù)據經NCBI在線BLAST比對，以確定是否為目標序列；參照GenBank數(shù)據庫中雪貂TYR基因信息確定水貂該基因序列結構；參考莫家遠等[14]、杜鵬飛等[15]、周志楠等[16]和王斌等[17]的方法，通過BioEdit 7.2軟件統(tǒng)計TYR基因編碼序列核苷酸含量；利用SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM Server 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測水貂TYR蛋白信號肽與跨膜區(qū)，采用SMART(http://smart.embl.de/)和Motif Scan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)在線軟件分別分析TYR蛋白結構功能域和潛在功能基序。

1.6 水貂TYR基因SNPs篩查

SNPs篩查選用的PCR體系及程序同1.4。采用BioEdit 7.2軟件ClustalW Multiple alignment程序分析水貂TYR基因外顯子1、4和5的序列，篩查SNPs；通過測序峰圖軟件Chromas 5.0定義SNPs位點的基因型：單峰表示純合基因型，套峰表示雜合基因型。

1.7 皮膚組織TYR基因mRNA差異表達分析

以不同毛色水貂皮膚組織cDNA為模板進行qRT-PCR，根據SYBR?Select Master Mix說明書優(yōu)化qRT-PCR體系，利用Step One PlusTM系統(tǒng)設置反應程序。反應體系20.0 μL：cDNA 2.0 μL，上、下游引物各1.5 μL，SYBR?Select Master Mix 10.0 μL，滅菌超純水5.0 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性20 s，退火(溫度見表1)30 s，72 ℃ 延伸1 min，40個循環(huán)；95 ℃ 1 min；退火(溫度見表1)30 s；95 ℃ 30 s。每個樣品設置3個重復，β-actin基因為內參，白色被毛個體表達水平標定為1，作為對照組，參考2-ΔΔCt分析方法[18]進行TYR基因相對表達量計算，以“平均數(shù)±標準差”表示，采用SAS 9.0進行單因素方差(One-way ANOVA)分析和多重比較(LSD)。

表1 水貂TYR基因克隆、SNPs篩查及qRT-PCR引物Table 1 Primers for CDS clone, SNPs detection and qRT-PCR of mink TYR gene

2 結 果

2.1 水貂TYR基因克隆及序列分析

2.1.1TYR基因鑒定及分析 由圖1可知，擴增產物大小與設計長度一致，可進行后續(xù)克隆。擴增產物經純化、克隆及酶切鑒定、測序并拼接后獲得的序列長度為2 391 bp，以雪貂及其他物種TYR基因結構為參照，水貂TYR基因(登錄號：KJ716783)外顯子1、2、3、4和5大小分別為：819、217、148、182和230 bp， 編碼區(qū)序列長1 596 bp，編碼531個氨基酸。利用BLAST軟件進行同源性檢索表明，克隆序列與雪貂、海豹、犬及貓同源性分別為98%、94%、93%和92%，說明獲得序列為水貂TYR基因序列。堿基序列組成顯示，A=24.87%，C=25.75%，G=23.43%，T=25.94%，A+T含量與G+C基本一致，表明水貂TYR基因CDS區(qū)DNA雙鏈較穩(wěn)定。

M1、M2. DNA相對分子質量標準; 1～2、3～5、6～7、8～9和10～12分別為引物TYR-1、TYR-2、TYR-3、TYR-4和TYR-5擴增產物M1 and M2. DL 2000 and 1000 DNA marker; 1-2, 3-5, 6-7, 8-9 and 10-12 are the amplified products by primer TYR-1, TYR-2, TYR-3, TYR-4 and TYR-5圖1 水貂TYR基因擴增結果Fig.1 Amplification result of TYR gene in mink

2.1.2 TYR蛋白信號肽與跨膜結構預測 利用在線軟件SignalP-5.0 Server基于深度神經網絡(deep neural network)預測分析水貂TYR蛋白信號肽(圖2)表明，該蛋白的氨基末端至第18個氨基酸之間存在一段信號肽，屬于一種分泌型蛋白，剪切位點(cleavage site：CS)為18G-19H。采用TMHMM Server 2.0對TYR蛋白進行跨膜結構預測(圖3)顯示，水貂TYR蛋白第1～473位氨基酸位于膜外(outside)，497～531位氨基酸位于膜內(inside)，474～496位氨基酸為跨膜蛋白(TMhelix)。

圖2 水貂TYR蛋白信號肽預測分析Fig.2 Prediction analysis of the signal peptide of mink TYR protein

橫坐標表示氨基酸位點；縱坐標表示跨膜區(qū)概率Abscissa coordinate represents the position of amino acids；Longitudinal coordinate represent the probability of transmembrane domain圖3 水貂TYR蛋白跨膜結構分析Fig.3 Transmembrane domain analysis of mink TYR protein

2.1.3 TYR蛋白關鍵功能域及位點 通過Simple modular architecture research tool(SMART)預測蛋白關鍵功能域(圖4)表明，水貂TYR蛋白包含1個信號肽(signal peptide)，1個EGF結構域(EGF domain)，1個酪氨酸酶家族共有核心結構域(tyrosinase)，1個跨膜結構域(transmembrane region)和1個低復雜度結構域(low complexity region)，分別位于1～18、84～113、171～403、474～496和497～506位氨基酸，其中，信號肽和跨膜結構域與2.1.2預測結果相符。利用NCBI蛋白保守結構域在線分析軟件發(fā)現(xiàn)，克隆的水貂TYR基因也具有酪氨酸酶超家族(tyrosinase superfamily)結構域?；贛yHits在線軟件中Motif Scan程序預測關鍵功能位點表明，水貂TYR蛋白包括41個潛在的功能基序位點，6個N-糖基化位點：86～89(NRTC)、111～114(NCTE)、161～164(NGST)、230～233(NFTI)、337～340(NFSF)和371～374(NGTM)位氨基酸；13個II型酪蛋白激酶磷酸化位點(casein kinase II phosphorylation site，CK2)：29～32(SLME)、72～75(TGVD)、127～130(SVPE)、145～148(TSPD)、226～229(TGDE)、277～280(TRLE)、314～317(SSAD)、325～328(TQYE)、380～383(SAND)、391～394(TFVD)、395～398(SIFE)、441～444(SSRD)和455～458(SERD)位氨基酸；7個豆蔻?；稽c(N-myristoylation site，MYRISTYL)：43～48(GSPCGQ)、53～58(GACQNI)、93～98(GNFMGF)、157～162(GQMNNG)、243～248(GCDICT)、353～358(GIADAS)和485～490(GSVLTL)位氨基酸；9個蛋白激酶C磷酸化位點(protein kinase C phosphorylation site，PKC)：12～14(SFR)、26～ 28(SSK)、38～40(TWR)、50～52(SGR)、113～115(TEK)、309～311(TPR)、339～341(SFR)、441～443(SSR)和455～457(SER)位氨基酸；1個微體細胞C端靶向信號：529～531(THL)位氨基酸；1個細胞輔助序列位點：40～42(RGD)位氨基酸；1個表皮生長因子樣結構域信號I(EGF-like domain signature I，EGF-I)：89～100位氨基酸(CHCFGNFMGFNC)；1個層粘連蛋白型表皮生長因子樣結構域信號(laminin-type EGF-like domain signature，EGF_LAM_1)：89～112位氨基酸(CHCFGNFMGFNCGNCKFGFWGPNC)；1個酪氨酸酶銅-A結合位點信號因子(tyrosinase CuA-binding region signature，TYROSINASE 1)：202～219位氨基酸(HEAPGFLPWHRLFLLLWE)；1個酪氨酸酶銅-B結合位點信號因子(tyrosinase CuB-binding region signature，TYROSINASE 2)：383～394位氨基酸(DPIFLLHHTFVD)；170～403位氨基酸為1個酪氨酸酶家族共有核心結構域(common central domain of tyrosinase)。

圖4 水貂TYR蛋白關鍵功能域分析Fig.4 Key functional domains analysis of mink TYR protein

2.2 水貂TYR基因SNPs篩查

利用BioEdit 7.2 軟件ClustalW multiple alignment程序將不同毛色水貂TYR基因外顯子1、4和5的PCR產物直接測序結果進行比對，篩查SNPs。SNPs命名原則：每個外顯子的第1個起始堿基標記為“1”。結果表明，301個樣本外顯子4和5序列不存在變異位點，外顯子1存在2個SNPs位點(圖5)，分別命名為：c.138T>A和c.441G>A，c.138T>A僅存在于名威銀藍水貂和紅眼白水貂群體中，形成3種基因型：TT、TA和AA，該位點為無義突變，由TGT編碼的半胱氨酸突變?yōu)榻K止密碼子TGA。c.441G>A位點僅存在于金州黑水貂群體中，為沉默突變，發(fā)生在密碼子第3位堿基，CCG和CCA均編碼脯氨酸(Pro)。

A. c.138T>A位點測序峰圖：a. 純合子TT基因型；b. 雜合子TA基因型；c. 純合子AA基因型。B. c.441G>A位點測序峰圖：d. 純合子GG基因型；e. 雜合子GA 基因型；f. 純合子AA基因型。突變位點用箭頭標明A.DNA sequencing map of c.138T>A site：a. homozygote TT; b. heterozygote TA; c. homozygote AA. B. DNA sequencing map of c.441G>A site:d. homozygote GG; e. heterozygote GA; f. homozygote AA. Arrows indicate muataion sites圖5 水貂TYR基因外顯子1的2個突變位點Fig.5 Two mutation sites of the mink TYR gene exon 1

2.3 水貂皮膚組織TYR基因mRNA差異表達

由圖6可知，TYR基因mRNA在3種毛色水貂皮膚中均存在表達，其表達量趨勢為：金州黑水貂>名威銀藍水貂>紅眼白水貂，金州黑水貂、銀藍水貂皮膚TYR基因mRNA相對表達量分別是紅眼白水貂的3.25和1.89倍，在金州黑水貂皮膚中的表達量極顯著高于名威銀藍水貂和紅眼白水貂(P<0.01)，在銀藍水貂皮膚中的表達量顯著高于紅眼白水貂(P<0.05)。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Different capital letters represent extremely significant difference (P<0.01)，and different lowercase letters represent significant difference (P<0.05)圖6 不同毛色水貂皮膚組織TYR基因mRNA相對表達量Fig.6 Relative expression of TYR gene mRNA in mink skin with different coat colors

3 討 論

3.1 TYR基因關鍵結構功能域及SNPs與色素沉積關系的探討

本研究通過比較基因組學方法，以雪貂和海豹等動物同源基因序列為模板，設計了5對特異性引物進行PCR擴增，成功克隆出水貂TYR基因。隨著基因組學和蛋白質組學研究的逐漸深入，特別是當今大數(shù)據組學的迅速發(fā)展，生物信息學理論及分析方法也得到了進一步的更新[19-21]。通過系統(tǒng)生物信息學分析，本研究獲得的水貂TYR基因長2 391 bp， 包含5個完整外顯子，編碼區(qū)長1 596 bp，編碼531個氨基酸，由信號肽(18個氨基酸)和成熟肽(513個氨基酸)組成。信號肽預測表明，水貂TYR蛋白屬分泌型蛋白，可以在細胞外發(fā)揮作用。研究表明，人[22]、食蟹猴[23]、犬[24]、山羊[25]和豬[26]等哺乳動物TYR蛋白編碼序列N端均含有信號肽，本研究結果與前人研究一致。研究發(fā)現(xiàn)，新合成蛋白在其N端信號肽的指引下到達細胞特定區(qū)域進行跨膜轉運[27]，TYR蛋白形成后只有與細胞膜中特定受體結合才發(fā)揮其調控作用，水貂TYR蛋白信號肽的存在可保證其功能正常發(fā)揮。信號肽一般存在于氨基酸序列的N端，是引導新生蛋白向分泌通路轉移的短肽鏈，長度為5～30個氨基酸不等[28]。不同物種的TYR蛋白信號肽在進化過程中剪切位點非常保守(18G…H19)，同時，拓撲結構域在線預測軟件也預測到水貂TYR蛋白C端存在一段包括23個氨基酸(474～496位)的跨膜結構域。研究表明，脊椎動物山羊[25]、朱鹮[29]和蛙[30]等物種均包括一個跨膜結構片段，暗示酪氨酸酶在色素合成過程中可能具有重要功能。除此之外，EGF結構域、酪氨酸酶家族共有核心結構域、酪氨酸酶銅-A和酪氨酸酶銅-B結合位點信號因子的關鍵功能結構域的預測結果再次證明了水貂TYR蛋白在調控色素沉積方面的重要作用。對于SNPs篩查結果，本研究發(fā)現(xiàn)了1個關鍵突變位點c.138T>A，具有白色被毛的紅眼白水貂在該位點全部為AA型，該無義突變導致TYR基因編碼蛋白結構域缺少了EGF domain、酪氨酸酶銅-A和酪氨酸酶銅-B結合位點，最終導致酪氨酸酶家族共有核心結構域缺失，黑色素合成生物學過程中斷，產生白色被毛。這一結果與Anistoroaei等[7]對美洲白化水貂和Blaszczyk等[8]對白化雪貂的研究結果一致。其中，丹麥白化水貂個體TYR基因外顯子1存在無義突變(138.TGT→TGA)位點，這與本研究中c.138T>A位點完全吻合，宋興超等[31]也發(fā)現(xiàn)，T138A位點的PCR-RFLP多態(tài)性與水貂毛色表型顯著關聯(lián)，表明紅眼白水貂與白化水貂毛色決定基因均為TYR基因。同時，Ito和Wakamatsu[32]研究也表明，若黑色素細胞中酪氨酸酶含量和活性降低，酪氨酸會經多巴和多巴醌生成半胱酰多巴，褐黑色素濃度增高，動物被毛表現(xiàn)為淺色或白色。上述研究結果提示，TYR基因c.138T>A位點是導致水貂白色被色表型形成的關聯(lián)SNPs。

3.2 TYR基因皮膚組織mRNA表達量與水貂毛色性狀的關聯(lián)性

迄今為止，編碼酪氨酸酶蛋白的TYR基因已成為探究動物色素沉積分子機制的核心基因。TYR基因表達量升高會促進黑色素細胞生成并分泌更多的真黑色素，動物的毛色、羽色和膚色也就相應越深，若酪氨酸酶活性或表達量過低將阻斷黑色素合成，動物毛色、羽色和膚色將會變淺甚至呈現(xiàn)白化表型[33]。Paterson等[34]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠黑色素細胞中TYR基因高表達會導致酪氨酸酶活性增強。Zhang等[35]利用qRT-PCR技術研究發(fā)現(xiàn)，體色正常的黃顙魚皮膚組織TYR基因mRNA表達量顯著高于白化個體(P<0.05)，且該基因表達具有時空與組織特異性，表明TYR基因在色素沉積過程中具有重要功能，可在某種程度上決定體色的變異。高莉等[36]研究表明，棕色被毛羊駝皮膚TYR基因mRNA表達量極顯著高于白色個體，可進一步導致不同程度的色素沉積及多樣化毛色表型的形成。姜俊兵等[37]研究也發(fā)現(xiàn)，有色被毛羊駝TYR基因mRNA表達量顯著高于白色個體。Xu等[38]利用轉錄組測序獲得了五指山豬黑色與白色皮膚組織比較表達譜，其中，TYR基因mRNA表達水平在兩種皮膚中存在顯著差異(P<0.01)。Yao等[39]研究也表明，不同毛色綿羊皮膚TYR基因的相對表達量具有顯著差異。本研究結果表明，TYR基因在黑色、灰色和白色被毛水貂皮膚中均存在一定的表達，但其mRNA表達量則呈現(xiàn)一定的差異，該基因在黑色、灰色被毛水貂皮膚中的表達量分別是白色個體的3.25(P<0.01)和1.89(P<0.05)倍，該結果與羊駝[10,36-37]、馬[11]、黃顙魚[35]等脊椎動物獲得的相關結果一致，也與本研究篩查到的白色被毛水貂TYR基因外顯子1中c.138T>A突變相符合，推測該SNPs的存在導致終止密碼子的提前出現(xiàn)，形成一段截短蛋白，終止水貂TYR基因mRNA的合成，最終中斷真黑色素合成，從而形成白色被毛表型，有待于進一步通過細胞或動物水平RNA干擾或過表達試驗開展具體的分子調控機理研究，或者通過檢測水貂不同胚胎時期該基因的表達水平以進一步解析TYR基因的調控功能。前期研究發(fā)現(xiàn)，水貂作為一種典型季節(jié)性被毛脫換動物，其毛囊在換毛期間會有生長期、退行期與休止期等過程[40]，本研究中，試驗樣品采集時間在12月初，毛囊穩(wěn)定在退行期或即將進入靜止期，毛色關聯(lián)基因也可能會存在表達量的差異，因此，有必要檢測換毛期TYR基因的差異表達量來進一步完善水貂毛色性狀形成的分子調控機制。

4 結 論

本研究克隆獲得了水貂TYR基因完整編碼區(qū)，序列全長2 391 bp。生物信息學分析表明，水貂TYR蛋白共編碼531個氨基酸，關鍵功能結構域(EGF結構域、酪氨酸酶家族共有核心結構域、酪氨酸酶銅-A和酪氨酸酶銅-B結合位點信號因子)及外顯子1中SNPs(c.138T>A)對水貂被毛色素沉積具有重要調控功能；TYR基因皮膚組織mRNA差異表達水平與水貂毛色顯著關聯(lián)。