調(diào)控牛CEBPA基因表達(dá)的miRNA篩選及對肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響

黃明捷，陳 祥*，張 勇*，陳 偉，

李 俊3，陸 靜1,2，張 雄4，何 琦5，吳 雨1,2

(1.貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025； 2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州省動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025； 3.貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心，貴陽 550018；4.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽 550025； 5.貴陽市花溪區(qū)農(nóng)業(yè)局，貴陽 550025)

許多干細(xì)胞或細(xì)胞亞群在不同的發(fā)育階段受到大量特定基因的調(diào)控，其關(guān)鍵是轉(zhuǎn)錄因子精準(zhǔn)調(diào)控基因表達(dá)的模式具有復(fù)雜性和特異性，而轉(zhuǎn)錄因子激活劑、阻遏物及其功能修飾劑之間相互作用的組合又進(jìn)一步增加了調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜多樣性[1]。CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白A(CCAAT/enhancer binding protein alpha,CEBPA)，別名C/EBP、RcC/EBP-1、C/EBPα[2]，該基因基序上存在激活劑/阻遏物結(jié)合位點(diǎn)，能通過組織特異性和信號依賴性精準(zhǔn)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat，IMF)含量是影響肉質(zhì)的重要因素，前體脂肪細(xì)胞分化則是IMF沉積不可或缺的步驟，其過程包括前體脂肪細(xì)胞指數(shù)擴(kuò)增和分化兩個階段。細(xì)胞分化屬于核心階段，其過程是一系列的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)事件[3]。在這個轉(zhuǎn)錄級聯(lián)系統(tǒng)中，CEBPA作為核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因相互作用共同調(diào)節(jié)其分化。CEBPA基因在脂肪和膽固醇代謝相對較旺盛的組織中有較高的表達(dá)水平[4-6]，參與細(xì)胞的信號傳導(dǎo)、增殖、分化、能量代謝、應(yīng)激反應(yīng)和血液生成等生命活動[7]。由于CEBPA基因在生命進(jìn)程中既能作為激活劑又有阻遏抑制功效，已有大量研究開始將其與人類肥胖癥、糖尿病和白血病等疾病進(jìn)行聯(lián)系[8]。

成熟miRNA和相關(guān)蛋白組合形成RISC復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC復(fù)合體與靶基因mRNA 3′UTR或5′UTR結(jié)合，以切割靶mRNA或抑制翻譯間接調(diào)節(jié)基因表達(dá)[9]，在RNA的基礎(chǔ)上行使自身的生物學(xué)功能，參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程，如早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、脂肪代謝和細(xì)胞分化等生命活動[10-11]。隨著研究的不斷深入，越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)在脂肪細(xì)胞分化過程中扮演著重要角色。miR-150能提高脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ASC)中C/EBPα的表達(dá)，促進(jìn)脂肪沉積[12]；而miR-326會直接抑制C/EBPα的表達(dá)，削弱該細(xì)胞的脂肪沉積能力[13]。綿羊基質(zhì)血管組分(stromal vascular fractions，SVFs)中的miR-124-3p能作為成脂過程中的調(diào)節(jié)劑，通過直接作用于C/EBPα來影響脂肪沉積[14]；miR-25通過直接結(jié)合C/EBPα抑制3T3-L1脂肪形成[15]。此外，CEBPA還能作為miRNA調(diào)節(jié)劑，通過與miRNA啟動子區(qū)特異性結(jié)合，間接調(diào)控脂肪的生成[16]。當(dāng)前僅在人、綿羊脂肪干細(xì)胞以及3T3-L1細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)部分miRNA能直接結(jié)合CEBPA基因調(diào)控脂肪沉積過程，在牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中是否還存在其他能直接作用于CEBPA基因的miRNA，以及這部分miRNA對牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增值和分化的影響尚未見報道。

本研究綜合運(yùn)用多個生物信息學(xué)軟件篩選調(diào)控牛CEBPA基因的miRNA，結(jié)合qRT-PCR、雙熒光素酶報告系統(tǒng)、Western blot、CCK-8等生物學(xué)試驗(yàn)探究候選miRNA對牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化與增殖的影響,明確miRNA與CEBPA基因調(diào)控關(guān)系對肌內(nèi)脂肪沉積效果的遺傳基礎(chǔ)，為加速關(guān)嶺牛品種改良、提高關(guān)嶺牛肌內(nèi)脂肪含量、生產(chǎn)高檔牛肉奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)動物為貴州省關(guān)嶺牛，選取飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同且健康的關(guān)嶺牛7頭(2歲公、母牛各3頭，1日齡犢牛1頭)，屠宰前停料、停水12 h，屠宰后迅速采集心、肝、脾、肺、腎、脂肪、腰大肌、背最長肌、股二頭肌、大腸、小腸、下丘腦、睪丸、卵巢和子宮共15個組織(用于提取RNA)，1日齡關(guān)嶺牛犢牛耳靜脈注射速眠新麻醉處死后，取背最長肌(用于提取RNA和分離培養(yǎng)肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞)。用于提取RNA的樣品放入液氮罐中凍存，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于-80 ℃冰箱保存；用于分離培養(yǎng)肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的背最長肌，經(jīng)75%酒精和PBS清洗后，浸泡在含1%雙抗的PBS中并置于冰盒，3 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室立刻進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 氯仿購自宏達(dá)爾生物科技有限公司；pmir GLO載體購自Promgea 公司；HEK-293T購自ATCC；pMD-19 T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司；PBS、Ⅰ型膠原酶、DMEM/F12培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰島素、地塞米松、油紅O染料、胰蛋白酶、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、BCA蛋白定量試劑盒、Opti-MEMTM培養(yǎng)基均購自上海索萊寶生物科技有限公司；Trizol 試劑、無水乙醇、DL2000 DNA Marker、2×Es Taq MasterMix、核酸染料、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiFiScript cDNA Synthesis Kit)均購自康為世紀(jì)生物有限公司；SYBR Green qPCR Master Mix (No ROX)購自美國MCE公司；miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit)和熒光定量試劑盒(miRcute Plus miRNA qPCR Kit)均購自天根生化科技(北京)有限公司；蛋白Marker、蛋白上樣緩沖液、PVDF膜均購自北京碧云天公司；山羊抗兔IgG購自中杉公司；發(fā)光試劑購自德國roche公司；GAPDH(KC-5G5)購自康成公司；CCK-8檢測試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；miRNA模擬物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；LipofectamineTM3000試劑購自Thermo Fisher。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)預(yù)測與分析 利用Starbase[17]、MiRWalk[18]、miRSystem[19]和TargetScan[20]4個在線軟件預(yù)測能直接調(diào)節(jié)CEBPA基因的miRNA。用Venny 2.1對4個軟件的預(yù)測結(jié)果做韋恩圖取交集，以聚焦調(diào)節(jié)CEBPA基因的miRNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的牛CEBPAmRNA序列(登錄號：NM_176784.2)，利用 Primer 3.0和NCBI設(shè)計(jì)CEBPA基因熒光定量引物；利用miRprimer軟件設(shè)計(jì)miRNA熒光定量引物(miRNA下游引物為試劑盒自帶的通用下游引物)；以牛GAPDH基因(登錄號：NM _001034034)作為CEBPA基因內(nèi)參，參照王軍等[21]使用的U6基因作為miRNA內(nèi)參，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.3CEBPA-3′UTR雙熒光素酶報告載體構(gòu)建及雙熒光素酶活性檢測 為確定用于構(gòu)建載體的序列，先以關(guān)嶺牛背最長肌cDNA為模板，通過普通PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出miRNA結(jié)合區(qū)域的CEBPA-3′UTR-1片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司測序，根據(jù)測序結(jié)果截取適當(dāng)長度用于構(gòu)建CEBPA-3′UTR雙熒光素酶報告載體。序列由北京擎科生物科技有限公司合成，在5′和3′分別添加SacI和XhoI酶切位點(diǎn)(酶切位點(diǎn)用下劃線斜體標(biāo)注，miRNA結(jié)合位點(diǎn)用下劃線加粗標(biāo)注)。

將合成片段與雙酶切后的Pmir-GLO載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化和測序后得到野生型和突變型CEBPA-3′UTR雙熒光素酶報告質(zhì)粒。將HEK-293T細(xì)胞懸液等量接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時參照Thermo Fisher LipofectamineTM3000試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。LipofectamineTM3000 1 μL、重組質(zhì)粒500 ng、miRNA mimic或miRNA NC終濃度為50 nmol·L-1。試驗(yàn)分為兩組，每組設(shè)3個重復(fù)：CEBPA野生型組(共轉(zhuǎn)染Pmir-CEBPA-WT和miRNA mimic，以共轉(zhuǎn)染Pmir-CEBPA-WT和miRNA NC為對照組)、CEBPA突變型組(共轉(zhuǎn)染Pmir-CEBPA-MUT和miRNA mimic，以共轉(zhuǎn)染Pmir-CEBPA-MUT和miRNA NC為對照組)。共轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測，操作步驟參照Dual-Luciferase?雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測熒光活性變化。

1.2.4 牛肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化和轉(zhuǎn)染 參照張萌萌等[22]和苑洪霞[23]的方法進(jìn)行牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，以差速貼壁法純化肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞。參照相奧琪[24]的方法配制誘導(dǎo)分化和維持分化培養(yǎng)基，當(dāng)六孔板中F4代細(xì)胞培養(yǎng)完全匯合2 d后用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)2 d (記加誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基時為第0天)，再換成維持培養(yǎng)基培養(yǎng)至第8天。六孔板中細(xì)胞完全匯合2 d后，根據(jù)Thermo Fisher LipofectamineTM3000試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后分別提取細(xì)胞RNA和蛋白。

1.2.5CEBPA基因與miRNA熒光定量分析 利用Trizol 法提取組織、細(xì)胞總RNA，按照HiFiScript cDNA Synthesis Kit試劑盒與miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit試劑盒分別進(jìn)行普通反轉(zhuǎn)錄和miRNA反轉(zhuǎn)錄。CEBPA基因與miRNA基因熒光定量反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)置，每個樣品重復(fù)3次。

1.2.6 CEBPA蛋白表達(dá)量檢測 提取轉(zhuǎn)染miRNA模擬物48 h后的細(xì)胞蛋白，以每孔上樣量50 μg進(jìn)行SDS-PAGE。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜自然晾干后，置于95%乙醇中固定，再用0.01 mol·L-1PBST洗5 min。用5%脫脂奶粉封閉液中封閉非特異性蛋白，室溫下約4 h，再用0.01 mol·L-1PBST洗3次，每次15 min。加I抗體(1∶1 000，用0.01 mol·L-1PBST配制)，室溫下3～4 h，再用0.01 mol·L-1PBST洗3次，每次15 min。加HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000，用0.01 mol·L-1PBST配制)，室溫下1～2 h，再用0.01 mol·L-1PBST洗3次，每次15 min。將PVDF置于化學(xué)發(fā)光試劑中增強(qiáng)反應(yīng)1～3 min，Blo-RAO掃描拍照。

1.2.7 CCK-8檢測 將細(xì)胞懸液等量接種到96孔板中(每孔100 μL)，并置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后分別轉(zhuǎn)染miRNA mimic和miRNA NC，每組設(shè)置5個重復(fù)。在待測孔中加入10 μL CCK-8試劑后孵育2 h，再用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處吸光度。

2 結(jié) 果

2.1 調(diào)控CEBPA基因的miRNA預(yù)測

通過聚焦4個在線軟件的預(yù)測結(jié)果(圖1A)，發(fā)現(xiàn)miR-23、miR-181、miR-101、miR-144、miR-186和miR-326與CEBPA基因3′UTR存在潛在作用關(guān)系。C/EBPβ(CEBPB)、C/EBPδ(CEBPD)和PPARγ(PPARG)對前體脂肪細(xì)胞分化過程均發(fā)揮一定作用[25-28]，為提高篩選精度，排除這些基因中可能存在調(diào)控關(guān)系的miRNA，故選擇miR-23和miR-181進(jìn)行下一步試驗(yàn)。bta-miR-23和bta-miR-181家族中的miRNA種子序列里均有相似堿基能與CEBPA3′UTR相結(jié)合(圖1B)，最終以bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a、bta-miR-181b、bta-miR-181c、bta-miR-181d作為候選miRNA。

A. miRNA聚焦預(yù)測結(jié)果；B. 候選miRNA與CEBPA基因3′UTR結(jié)合位點(diǎn)A.miRNA focus prediction results; B. The binding site of candidate miRNA and CEBPA gene 3′UTR圖1 與CEBPA存在潛在調(diào)控關(guān)系的miRNA預(yù)測結(jié)果Fig.1 Prediction results of miRNA with potential regulatory relationship with CEBPA

2.2 CEBPA mRNA在各組織中的差異表達(dá)

通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)(圖2)，CEBPAmRNA在肌肉組織(背最長肌、股二頭肌、腰大肌)、睪丸、卵巢中的相對表達(dá)量極顯著低于心、肝、脾、肺、脂肪等組織(P<0.01)；CEBPA基因在心中的表達(dá)量最高，極顯著高于除下丘腦外的其他組織(P<0.01)；CEBPA基因在下丘腦呈高表達(dá)，極顯著高于除心、肺、脂肪以外的組織(P<0.01)；同時，還發(fā)現(xiàn)CEBPA基因在2周歲關(guān)嶺牛背最長肌的表達(dá)量極顯著高于1日齡犢牛(P<0.01)；CEBPA基因在睪丸中表達(dá)量極顯著高于卵巢(P<0.01)，且在母牛不同生殖器官中的表達(dá)量存在極顯著差異，在子宮中表達(dá)量極顯著高于卵巢(P<0.01)。

上標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，上標(biāo)不同大寫字母或**表示差異極顯著(P<0.01)，上標(biāo)不同小寫字母或*表示差異顯著(P<0.05)，下同The same letter on the top indicates that the difference is not significant (P>0.05), the superscript different capital letters or ** means the difference is extremely significant (P<0.01), and the superscript different lowercase letters or * means the difference is significant(P< 0.05), the same as below圖2 CEBPA mRNA在關(guān)嶺牛不同組織中的表達(dá)差異性Fig.2 Expression differences of CEBPA Gene in different tissues of Guanling cattles

2.3 候選miRNA與CEBPA的調(diào)控關(guān)系

當(dāng)前，大量探究miRNA與目標(biāo)基因3′UTR作用關(guān)系的試驗(yàn)采用的均是雙熒光素酶報告系統(tǒng)[29-30]。雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測結(jié)果如圖3所示，miR-23a+CEBPA-3′UTR-WT組熒光活性極顯著低于miR-NC+CEBPA-3′UTR-WT組(P<0.01)，且顯著低于miR-23a+CEBPA-3′UTR-MUT組(P<0.05)，說明bta-miR-23a與CEBPA基因mRNA的3′UTR具有直接調(diào)控關(guān)系；miR-23b-3p+CEBPA-3′UTR-WT組、miR-181a+CEBPA-3′UTR-WT組轉(zhuǎn)染后熒光活性均極顯著低于miR-NC+CEBPA-3′UTR-WT組和miR-mimic+CEBPA-3′UTR-MUT組(P<0.01)，表明miR-23b-3p、miR-181a均能抑制CEBPA基因mRNA 3′UTR活性。

圖3 雙熒光素酶檢測結(jié)果Fig.3 Dual luciferase test results

2.4 CEBPA基因和miRNA在牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)趨勢分析

利用“雞尾酒法”誘導(dǎo)細(xì)胞分化，檢測誘導(dǎo)0、2、6、8 d時CEBPAmRNA、bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p和bta-miR-181a表達(dá)量，其結(jié)果見圖4。CEBPA基因在分化初期呈低表達(dá)，隨著分化時間逐漸升高，第8天的表達(dá)量極顯著高于第0、2、6天(P<0.01)，而bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a在細(xì)胞分化初期呈現(xiàn)高表達(dá)，極顯著高于其他時期(P<0.01)。在表達(dá)量變化趨勢上，bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a的在細(xì)胞不同分化時期的表達(dá)量與CEBPA基因的表達(dá)趨勢相反；bta-miR-23a除在分化初期高表達(dá)外，第2、6、8天處于較低表達(dá)水平，且這3個時間段間的表達(dá)水平差異不顯著(P>0.05)。

圖4 CEBPA、miR-23b-3p、miR-23a和miR-181a在牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞不同分化時期的表達(dá)量變化Fig.4 Changes in the expression levels of CEBPA, miR-23b-3p, miR-23a and miR-181a in cattle intramuscular precursor adipocytes at different stages of differentiation

2.5 過表達(dá)miRNA對CEBPA mRNA和蛋白表達(dá)以及細(xì)胞分化的影響

過表達(dá)miRNA 48 h后，miRNA、CEBPAmRNA 與蛋白變化情況分別見圖5、6。由圖5B可知，3個miRNA mimic均能極顯著降低CEBPAmRNA表達(dá)量(P<0.01)，其中，miR-23b-3p比miR-23a、miR-181a降低CEBPA表達(dá)效果更強(qiáng)，但未達(dá)顯著水平(P>0.05)。由圖6B可知，過表達(dá)miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a均能極顯著降低CEBPA蛋白表達(dá)(P<0.01)，在過表達(dá)后對CEBPA蛋白抑制效果最強(qiáng)的是miR-23b-3p組，表明miR-23a、 miR-23b-3p、miR-181a均能抑制牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中CEBPA基因的表達(dá)。由圖7可觀察到，分別過表達(dá)miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a后牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中脂滴數(shù)均少于miR-NC組，表明miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a均能降低牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中脂滴含量。由此可知，miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a均能通過抑制CEBPA基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化。

A. 過表達(dá)miRNA后熒光定量PCR檢測miRNA變化；B. 過表達(dá)miRNA后熒光定量PCR檢測CEBPA表達(dá)量A. Fluorescence quantitative PCR to detect changes in miRNA after overexpression of miRNA; B.Detection of CEBPA expression by fluorescence quantitative PCR after overexpression of miRNA圖5 過表達(dá)miRNA后牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞miRNA和CEBPA mRNA表達(dá)量變化Fig.5 Changes of miRNA and CEBPA mRNA expression in cattle intramuscular precursor adipocytes after overexpression of miRNA

A. 過表達(dá)miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a后CEBPA的Western blot條帶；B.過表達(dá)miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a后CEBPA蛋白的相對表達(dá)量A. Western blot band of CEBPA after overexpression of miR-23a, miR-23b-3p, miR-181a; B. Relative expression of CEBPA protein after overexpression of miR-23a, miR-23b-3p and miR-181a圖6 過表達(dá)miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a后CEBPA蛋白相對表達(dá)量變化Fig.6 Changes in relative expression of CEBPA protein after overexpression of miR-23a, miR-23b-3p and miR-181a

A～D.分別過表達(dá)miR-NC、miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a后油紅O染色圖A-D. Oil red O staining diagram after overexpression of miR-NC, miR-23a, miR-23b-3p, miR-181a圖7 在牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中過表達(dá)miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a后誘導(dǎo)分化8 d時油紅O染色結(jié)果(200×)Fig.7 Oil red O staining results after 8 days of overexpression of miR-23a, miR-23b-3p and miR-181a in cattle intramuscular precursor adipocytes (200×)

2.6 過表達(dá)miRNA對牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖的影響

運(yùn)用CCK-8檢測過表達(dá)miRNA后對細(xì)胞增的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，轉(zhuǎn)染24 h后，3個處理組細(xì)胞增殖效果較miRNA NC組無顯著變化(P>0.05)；轉(zhuǎn)染48 h后，3個處理組細(xì)胞增殖效果較轉(zhuǎn)染miRNA NC組呈極顯著增強(qiáng)(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染miR-23a mimic、miR-23b-3p mimic對細(xì)胞增殖效果顯著高于miR-181a mimic(P<0.05)；轉(zhuǎn)染72 h 后，3個處理組對細(xì)胞增殖影響差異不顯著(P>0.05)。 CCK-8檢測結(jié)果表明，bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a僅在關(guān)嶺牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖過程中階段性的發(fā)揮促進(jìn)作用。

圖8 過表達(dá)miRNA對牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖的影響Fig.8 Effect of overexpression of miRNA on the proliferation of cattle intramuscular precursor adipocytes

3 討 論

CEBPA基因作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，廣泛存在于機(jī)體各類組織中[31]。Williams等[32]研究表明，CEBPA基因在肝和脂肪組織中有較高表達(dá)水平，本研究也發(fā)現(xiàn)CEBPA基因在關(guān)嶺牛心、肝、脾、肺、脂肪中的表達(dá)水平極顯著高于肌肉(背最長肌、股二頭肌、腰大肌)組織(P<0.01)。此外，下丘腦是調(diào)控食欲和維持能量代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵區(qū)域[33]，本研究在下丘腦中檢測到CEBPA基因呈高表達(dá)，這與該基因的信號傳導(dǎo)功能有關(guān)[34]。CEBPA基因參與卵巢促性腺激素生成以及睪丸的損傷修復(fù)[35-36]，本試驗(yàn)在關(guān)嶺牛卵巢、子宮和睪丸中均檢測到CEBPA基因有不同程度的表達(dá)。這表明，CEBPA基因是機(jī)體正常生殖活動不可或缺的因子。

動物基因3′UTR包含多個miRNA特定結(jié)合區(qū)域[37]，多個miRNA協(xié)同作用于靶基因，通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)影響基因功能，進(jìn)而調(diào)控信號傳導(dǎo)、增殖分化、IMF沉積等過程。已有大量研究采用“生物信息學(xué)+生物試驗(yàn)學(xué)”方法驗(yàn)證miRNA與其靶基因的調(diào)控關(guān)系[38-40]。本研究利用多個在線軟件篩選出6個與牛CEBPA基因具有潛在調(diào)控關(guān)系的miRNA，并通過雙熒光素酶活性檢測證實(shí)bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a能直接作用于CEBPAmRNA的3′UTR。Bi等[41]已證實(shí)巨噬細(xì)胞中的miR-181a能直接調(diào)節(jié)C/EBPα基因。

CEBPα表達(dá)水平與細(xì)胞分化時間呈線性增長關(guān)系[3]，本研究發(fā)現(xiàn)CEBPA基因在分化初期呈低表達(dá)，隨著分化時間逐漸升高，這與牟彥雙等[42]和張萌萌等[22]的研究結(jié)果一致。此外，CEBPα在分化初期表達(dá)水平較低，而bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a在分化初期呈現(xiàn)高表達(dá)且極顯著高于其他時期(P<0.01)，整個分化時期bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a與CEBPA基因的表達(dá)趨勢相反。Shen等[43]指出，miR-23a在3T3-L1細(xì)胞分化0 d時呈高表達(dá)狀態(tài)，而在分化期間miR-23a的表達(dá)降低了4倍以上。過表達(dá)miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a后，均能極顯著降低CEBPA基因mRNA和蛋白表達(dá)量(P<0.01)，3個miRNA僅在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮階段性促進(jìn)作用。miR-23a在脂肪細(xì)胞分化過程中起抑制作用[43-44]，miR-23b-3p、miR-181a通過直接作用于關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控多種細(xì)胞周期和分化[45-48]。

miRNA、轉(zhuǎn)錄因子以及調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的miRNA共同參與對CEBPA表達(dá)調(diào)控過程。一些miRNA能直接作用于CEBPA影響其表達(dá)，如miR-181a、miR-124-3p、miR-326、miR-182、miR-25是CEBPA基因的直接調(diào)控miRNA[41,49-51]；另一些miRNA則通過結(jié)合對CEBPA表達(dá)有影響的轉(zhuǎn)錄因子，間接介導(dǎo)對CEBPA的調(diào)控，如miR-342-3p、miR-204-5p、miRNA-7b-5負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子來影響CEBPA表達(dá)[52-54]。在脂肪細(xì)胞分化過程中，CEBPA與PPARγ相互促進(jìn)，形成一個正反饋環(huán)[55]。因此，miRNA對PPARγ的調(diào)節(jié)效果會間接影響CEBPA表達(dá)。已有研究表明，miR-454、miR-130a/b、miR-425-5p、miR-27b能直接或間接抑制PPARγ[56-59]。此外，CEBPA基因也能通過與miRNA基因啟動區(qū)結(jié)合，進(jìn)而積極調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)[16,60]。本研究確認(rèn)了miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a能負(fù)調(diào)控CEBPA基因，基于已有的報道和本研究結(jié)果，構(gòu)建出miRNA與CEBPA之間通路如圖9所示。

⊕表示正調(diào)控；?表示負(fù)調(diào)控⊕means positive regulation；?means negative regulation圖9 miRNA直接或間接調(diào)控CEBPA的通路圖Fig.9 Pathways of miRNA regulating CEBPA directly or indirectly

4 結(jié) 論

CEBPAmRNA在關(guān)嶺牛內(nèi)臟組織、肌肉組織、脂肪、下丘腦以及部分生殖器官中均有表達(dá)。生物信息學(xué)篩選和生物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a能階段性的促進(jìn)牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖，并負(fù)調(diào)控CEBPA基因抑制牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化。