miR-186-5p與α-MSH互作對綿羊黑素細(xì)胞黑色素生成的影響

許冬梅，朱芷葳，唐中偉，李鵬飛，董常生，趙宇軍

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

皮膚是人體的第一道屏障，具有重要的保護(hù)功能，其中黑素細(xì)胞產(chǎn)生的皮膚色素除了可以對抗高溫和吸收紫外線外，還具有抗氧化劑和清除自由基的作用，黑色素由黑素細(xì)胞中的細(xì)胞器黑素體產(chǎn)生。黑色素的生成、轉(zhuǎn)運(yùn)和沉著除了由遺傳物質(zhì)決定外，還受環(huán)境和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的影響[1]。酪氨酸酶(tyrosinase， TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(tyrosinase related protein 1, TYRP1)和酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(tyrosinase related protein 2, TYRP2)是催化黑色素生成的關(guān)鍵因子，其中TYR是限速酶[2]。小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia-associated transcription factor，MITF)是調(diào)控黑色素形成關(guān)鍵酶的重要轉(zhuǎn)錄因子[3]。促黑素細(xì)胞激素 (alpha-melanocyte stimulating hormone, a-MSH)是一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，由皮膚的黑素細(xì)胞和角化細(xì)胞合成和分泌[4]，α-MSH與黑素皮質(zhì)素受體1(melanocortinreceptor-1, MC1R)結(jié)合是皮膚色素合成與沉著起始的關(guān)鍵步驟，二者的結(jié)合不僅能激活和提高TYR的酶活性，上調(diào)其表達(dá)，促進(jìn)真黑素的生物合成[5]，還能促進(jìn)黑素細(xì)胞樹突的形成，使黑素小體更易轉(zhuǎn)運(yùn)到角化細(xì)胞，促進(jìn)黑色素的沉著[6]。a-MSH/MC1R是黑色素生成的主要信號(hào)通路，可通過上調(diào)MITF的表達(dá)促進(jìn)TYR、TYRP1和TYRP2 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)黑色素的合成[7]。

據(jù)報(bào)道，大約98%的基因組被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA[8]，microRNAs (miRNA, miR) 是大約18～25個(gè)堿基對的非編碼單鏈RNA分子，主要在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因表達(dá)發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，通常miRNA與靶標(biāo)基因的3′-非翻譯區(qū)(UTR)不完全結(jié)合，抑制靶標(biāo)基因蛋白質(zhì)的翻譯，其功能涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、血管生成以及癌癥和糖尿病等疾病的進(jìn)程[9]，如miR-186與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡有關(guān)，且在各種癌癥組織中表達(dá)異常，具有類似抑癌基因的作用，研究表明，miR-186與多種癌細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞的增殖和遷移有關(guān)[10-13]。近年來發(fā)現(xiàn)，miRNAs與黑色素的生成和皮膚的色素沉著有關(guān)，且一些miRNAs如miR-25、miR-137、miR-145、miR-148-3p、miR-218等通過調(diào)控MITF參與毛色形成[14-17]，許冬梅等[18]也發(fā)現(xiàn)，miR-186可能通過調(diào)控MITF影響綿羊黑素細(xì)胞的增殖、遷移和黑色素的合成。

一般對miRNA的研究都與其靶基因聯(lián)系在一起，而且miRNA都是負(fù)調(diào)控其靶標(biāo)基因的表達(dá)，本研究為了揭示miR-186-5p與α-MSH共同作用對綿羊黑素細(xì)胞及黑色素生成的影響，在綿羊黑素細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-186-5p，同時(shí)添加α-MSH因子使二者共同作用綿羊黑素細(xì)胞，為更深入地探討miRNAs 的調(diào)節(jié)作用提供有力的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 載體構(gòu)建與引物合成

本試驗(yàn)所用真核表達(dá)載體為帶有綠色熒光蛋白的pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR (Invitrogen)載體，包括miR-186-5p表達(dá)載體和陰性對照(negative control, NC)表達(dá)載體。所用引物均由北京六合華大公司合成，所有引物序列見表1。綿羊黑素細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定培養(yǎng)。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequences of target genes

1.2 主要試劑和儀器

反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(TaKaRa, 大連)，Trizol試劑(Invitrogen，美國)，黑素細(xì)胞培養(yǎng)基(ScienCell，美國)，RIPA裂解液(碧云天，上海)，SYBR Prime Script TMRT PCR KIT (TaKaRa，大連)，TYR抗鼠多克隆抗體(abcam，美國)，TYRP1抗鼠多克隆抗體(abcam，美國)，TYRP2抗鼠多克隆抗體(abcam，美國)，MITF抗鼠多克隆抗體(Thermo，美國)，抗 β-actin 兔多克隆抗體(CWBIO，北京)，質(zhì)粒中提試劑盒(QIAGEN，美國)；高速低溫冷凍離心機(jī)(Sigma，德國)，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-CO，蘇州)，7500 Fast Real time PCR System(Life technologies，美國)，核酸蛋白測定儀(Thermo，美國)。

1.3 黑素細(xì)胞的復(fù)蘇、轉(zhuǎn)染、添加與劃痕處理

液氮中取出保存的綿羊黑素細(xì)胞，在37 ℃預(yù)熱的水浴中溶解復(fù)蘇后接種于6孔培養(yǎng)板中， 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h更換培養(yǎng)基，細(xì)胞密度長到80%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染、添加與劃痕處理[18]。

試驗(yàn)共分為3組，分別為miR-86-5p組(綿羊黑素細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-86-5p真核表達(dá)載體)、陰性對照組(negative control,NC,轉(zhuǎn)染NC真核表達(dá)載體)、miR-86-5p+α-MSH互作組(黑素細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-86-5p的同時(shí)添加α-MSH，α-MSH的添加濃度為10-9mol·L-1[19])。

1.4 qRT-PCR檢測相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平

收集轉(zhuǎn)染、添加后培養(yǎng)48 h的綿羊黑素細(xì)胞，通過Trizol法提取細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，根據(jù)NCBI上發(fā)布的序列設(shè)計(jì)綿羊MITF、TYR、TYRP1、TYRP2與18S的qRT-PCR擴(kuò)增引物(表1)，以濃度統(tǒng)一后的cDNA為模板，按照熒光定量試劑盒說明進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.5 Western blotting檢測相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平

收集轉(zhuǎn)染、添加后培養(yǎng)48 h的黑素細(xì)胞，使用蛋白提取試劑盒提取綿羊黑素細(xì)胞總蛋白，各組蛋白濃度統(tǒng)一后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，5%脫脂牛奶封閉轉(zhuǎn)到NC膜上的蛋白質(zhì)1 h，然后，將載有蛋白質(zhì)的NC膜放入抗體孵育盒中一抗孵育4 ℃過夜，第2天TBST緩沖溶液洗滌NC膜3次，37 ℃搖床孵育二抗1 h，TBST洗滌3次，最后，通過Ecl發(fā)光液試劑盒，在凝膠成像系統(tǒng)中蛋白條帶掃描成像。

1.6 分光光度法測定黑色素含量

轉(zhuǎn)染、添加后培養(yǎng)48 h的黑素細(xì)胞PBS (磷酸緩沖液)洗滌3次，0.25%胰酶消化，PBS混懸細(xì)胞，取其中一部分細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，剩余部分加入0.2 mol·L-1NaOH裂解液，在80 ℃金屬浴中裂解5～10 min，細(xì)胞裂解液加入96孔的酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀測量475 nm 波長時(shí)的吸光值，最后根據(jù)吸光值和細(xì)胞計(jì)數(shù)值計(jì)算各組細(xì)胞的黑色素含量(μg/106個(gè)細(xì)胞)。

1.7 免疫組織化學(xué)檢測MITF的表達(dá)與定位

轉(zhuǎn)染、添加后培養(yǎng)48 h的黑素細(xì)胞PBS (磷酸緩沖液)洗滌3次，4%多聚甲醛固定30 min，3% H2O2孵育10 min去除內(nèi)源性過氧化酶，血清封閉液中37 ℃孵育30 min，一抗稀釋液中4 ℃靜置孵育過夜(陰性對照PBS緩沖液代替一抗)，次日復(fù)溫后去除一抗，37 ℃恒溫箱中二抗孵育30 min，避光條件下DAB顯色，最后顯微鏡觀察、拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次以上，利用SPSS 19.01進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)間比較使用單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-186-5p與α-MSH對相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

收集并提取各試驗(yàn)組細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板通過qRT-PCR檢測各試驗(yàn)組TYR、TYRP1、TYRP2和MITF基因轉(zhuǎn)錄水平的差異。結(jié)果顯示，miR-186-5p轉(zhuǎn)染組中，4種基因的轉(zhuǎn)錄水平均有所下降，分別為對照組的31.1%(TYR)、38.4%(TYRP1)、57.5%(TYRP2)和24.7%(MITF)(圖1)，其中，TYR和MITF基因表達(dá)極顯著下降(P<0.01)，TYRP1表達(dá)顯著下降(P<0.05)。但當(dāng)miR-186-5p和α-MSH同時(shí)存在時(shí)，4種基因轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)趨勢均有所減緩但未恢復(fù)到對照水平，分別為對照組的70.5%(TYR)、84.4%(TYRP1)、68.9%(TYRP2)和68.3%(MITF)，說明α-MSH緩解了miR-186-5p對TYR、TYRP1、TYRP2和MITF表達(dá)的抑制作用。

*. P<0.05, **. P<0.01，***.P<0.001。下同*. P<0.05, **. P<0.01，***.P<0.001. The same as below圖1 miR-186-5p轉(zhuǎn)染組、miR-186-5p+α-MSH互作組和對照組中TYR、TYRP1、TYRP2 和MITF mRNA相對表達(dá)量Fig.1 Relative expression levels of mRNA for TYR, TYRP1, TYRP2 and MITF in miR-186-5p transfected group, miR-186-5p+α-MSH interaction group and negative control group

2.2 miR-186-5p與α-MSH對相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

收集各試驗(yàn)組細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，通過Western blotting檢測基因表達(dá)產(chǎn)物的變化情況。結(jié)果顯示，與對照NC組相比，miR-186-5p轉(zhuǎn)染組和miR-186-5p+α-MSH互作組中4種蛋白質(zhì)表達(dá)量都有所下降(圖2)。miR-186-5p轉(zhuǎn)染組中TYR、TYRP1、TYRP2和MITF蛋白表達(dá)分別為對照組的85%、68%、78%和62%，且差異均顯著(P<0.05)。與mRNA表達(dá)類似，miR-186-5p+α-MSH互作組中，α-MSH緩解了miR-186-5p對TYR、TYRP1、TYRP2和MITF蛋白表達(dá)的抑制作用，分別為對照組的96%(TYR)、81%(TYRP1)、85%(TYRP2)和86%(MITF)，且差異均顯著(P<0.05)。

A.TYR、TYRP1、TYRP2 和MITF蛋白免疫印跡圖；B. TYR、TYRP1、TYRP2 和MITF蛋白表達(dá)量A.Western blotting of TYR, TYRP1, TYRP2 and MITF; B. The relative protein expression of TYR, TYRP1, TYRP2 and MITF圖2 miR-186-5p轉(zhuǎn)染組、miR-186-5p+α-MSH互作組和對照組中TYR、TYRP1、TYRP2 和MITF的蛋白相對表達(dá)量Fig.2 The relative protein expression of TYR, TYRP1, TYRP2 and MITF in miR-186-5p transfected group, miR-186-5p+α-MSH interaction group and negative control group

2.3 miR-186-5p與α-MSH對綿羊黑素細(xì)胞中黑色素含量影響

為了進(jìn)一步檢測 miR-186-5p與α-MSH對綿羊黑素細(xì)胞中黑色素含量的影響，運(yùn)用分光光度法對各試驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行黑色素含量測定。結(jié)果顯示，miR-186-5p能極顯著的降低綿羊黑素細(xì)胞中的黑色素含量(P<0.001)，其含量僅為對照的50.8%(圖3)。而miR-186-5p+α-MSH互作組的黑色素含量較之顯著回升。由此可見， miR-186-5p通過抑制靶基因及相關(guān)基因的表達(dá)，最終抑制了黑色素的生成。而α-MSH能緩解miR-186-5p對黑色素生成的抑制作用。

圖3 miR-186-5p轉(zhuǎn)染組、miR-186-5p+α-MSH互作組和對照組中黑色素含量Fig.3 The melanin content in miR-186-5p transfected group, miR-186-5p+α-MSH interaction group and negative control group

2.4 免疫組化檢測MITF在不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的表達(dá)差異

為了進(jìn)一步了解miR-186-5p對MITF蛋白表達(dá)的影響，對不同處理組細(xì)胞中MITF蛋白進(jìn)行了免疫組化定位。結(jié)果如圖4顯示，在陽性試驗(yàn)組中MITF都有表達(dá)，且分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。與對照組相比，miR-186-5p轉(zhuǎn)染組和miR-186-5p+α-MSH互作組中MITF蛋白著色都變淺，其中miR-186-5p轉(zhuǎn)染組著色最淺，miR-186-5p+α-MSH互作組略深，對照組著色最深。該結(jié)果再次證明，在綿羊黑素細(xì)胞中miR-186-5p抑制了MITF蛋白的表達(dá)，而α-MSH能緩解miR-186-5p對MITF蛋白表達(dá)的抑制作用。

圖4 miR-186-5p轉(zhuǎn)染組、miR-186-5p+α-MSH互作組和對照組中綿羊黑素細(xì)胞MITF的免疫組化染色 (200×)Fig.4 Immunohistochemical staining of sheep melanocytes MITF protein in miR-186-5p transfected group, miR-186-5p+α-MSH interaction group and negative control group(200×)

2.5 miR-186-5p與α-MSH對黑素細(xì)胞遷移的影響

傳代培養(yǎng)的綿羊黑素細(xì)胞長到80%左右進(jìn)行處理(轉(zhuǎn)染miR-186-5p和添加α-MSH)，同時(shí)用10 μL槍頭在培養(yǎng)板中間輕輕劃出痕跡。每隔一段時(shí)間進(jìn)行觀察并拍照，觀察不同處理對黑素細(xì)胞遷移能力的影響。由圖5可看出，無論是對照組還是miR-186-5p轉(zhuǎn)染組或miR-186-5p+α-MSH互作組，在處理后24 h劃痕處細(xì)胞增殖、遷移均不明顯，而36 h 后劃痕處細(xì)胞生長出現(xiàn)差異。此時(shí)，對照組劃痕處細(xì)胞密度最大，而miR-186-5p轉(zhuǎn)染組和miR-186-5p+α-MSH互作組細(xì)胞密度相近。48 h后，對照組劃痕已完全被細(xì)胞覆蓋，而miR-186-5p轉(zhuǎn)染組和miR-186-5p+α-MSH互作組仍能看到劃痕痕跡。這些結(jié)果表明，miR-186-5p過表達(dá)能抑制綿羊黑素細(xì)胞的遷移，miR-186-5p與α-MSH協(xié)同作用時(shí)細(xì)胞的遷移能力沒有明顯變化，由此說明，α-MSH對綿羊黑素細(xì)胞的增殖、遷移影響不大。

圖5 miR-186-5p轉(zhuǎn)染組、miR-186-5p+α-MSH互作組和對照組中綿羊黑素細(xì)胞的遷移能力 (40×)Fig.5 The migration capability of melanocyts in miR-186-5p transfected group, miR-186-5p+α-MSH interaction group and negative control group (40×)

3 討 論

Tsatmali等[20]研究表明，動(dòng)物外周皮膚中存在α-MSH的表達(dá)，且與皮膚色素沉著有關(guān)，α-MSH/MC1R與黑素細(xì)胞分化和黑色素的合成有關(guān)，MC1R是黑色素合成的開關(guān)基因，MC1R突變會(huì)使動(dòng)物毛色性狀改變。研究表明，黑素細(xì)胞中添加α-MSH可上調(diào)TYR的表達(dá)，促進(jìn)黑色素的生成[21]；Furumura等[22]發(fā)現(xiàn)，在人黑素細(xì)胞中，α-MSH/MC1R通過調(diào)控螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控MITF的表達(dá)，MITF通過與黑色素生成關(guān)鍵酶TYR、TYRP1和TYRP2的啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控TYR、TYRP1和TYRP2的表達(dá)，進(jìn)而影響黑色素的生成。楊柳和呂榮鋒[23]通過免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，α-MSH在白色毛皮的小鼠和豚鼠中呈陰性表達(dá)，而在黑色小鼠和棕黃色豚鼠的表皮中呈陽性表達(dá)；Hunt等[24]發(fā)現(xiàn)，α-MSH能促進(jìn)黑素細(xì)胞樹突的增加；Suzuki等[25]報(bào)道，紫外線照射能使黑素細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的G1期, 但α-MSH能緩解紫外線的抑制作用而使細(xì)胞進(jìn)入S期。Dorr等[26]報(bào)道，皮膚注射合成的強(qiáng)效促黑色素皮質(zhì)激素[Nle4-D-Phe7]-α-MSH，能促進(jìn)面部及前臂皮膚黑色素的沉著，且主要表現(xiàn)在真黑素合成比率增加。

Halaban[27]報(bào)道，在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，α-MSH與一些促分裂劑協(xié)同作用能促進(jìn)細(xì)胞DNA的合成，但不會(huì)造成細(xì)胞數(shù)量的變化；有研究證實(shí)，α-MSH對黑色素產(chǎn)生的調(diào)控作用主要通過促進(jìn)酪氨酸酶的合成及表達(dá)和黑素細(xì)胞有絲分裂，使其快速增殖來實(shí)現(xiàn)的[28]。于志慧等[19]報(bào)道，適當(dāng)濃度的α-MSH添加到體外培養(yǎng)的羊駝黑素細(xì)胞中，不僅黑素細(xì)胞的分裂、增殖加快，而且黑素細(xì)胞的樹突變得更細(xì)、更長；但Wakamatsu等[29]報(bào)道，α-MSH對人黑素細(xì)胞沒有顯著影響；Kim等[30]研究發(fā)現(xiàn)，α-MSH會(huì)抑制黑色素瘤細(xì)胞中酪氨酸酶的活性，但不影響細(xì)胞的分裂增殖；Swope和Abdel-Malek[31]研究報(bào)道，α-MSH、內(nèi)皮素-1(ET-1)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子共同作用人黑素細(xì)胞，不僅抑制UVR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而且刺激細(xì)胞的增殖和黑色素的生成。本研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊黑素細(xì)胞中添加α-MSH對細(xì)胞的增殖、遷移沒有明顯影響，但能促進(jìn)黑色素的生成，與以往報(bào)道的α-MSH能促進(jìn)黑色素生成一致，但在黑素細(xì)胞中添加α-MSH是否影響細(xì)胞增殖與細(xì)胞特性、培養(yǎng)條件、α-MSH的添加濃度等密切相關(guān)。

以往的研究表明，miR-186與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡有關(guān)。如miR-186通過結(jié)合不同的靶基因抑制多種癌細(xì)胞的增殖和遷移[10-12,32]；研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊黑素細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-186-5p能抑制黑素細(xì)胞的增殖和遷移[18]，本研究中，miR-186-5p與α-MSH共同作用時(shí)，對綿羊黑素細(xì)胞分裂增殖起抑制作用的主要是miR-186-5p。

Bemis等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在黑素細(xì)胞中miR-137抑制靶基因MITF的表達(dá)，而當(dāng)α-MSH與miR-137協(xié)同作用時(shí)，α-MSH能減緩miR-137對MITF表達(dá)的抑制作用，緩解因miR-137過表達(dá)引起的黑色素生成減少；MITF是miR-141-3p和miR-200a-3p的靶基因，在三維重建的人類皮膚組織中轉(zhuǎn)染miR-141-3p 和miR-200a-3p能抑制α-MSH刺激的黑色素生物合成[34]；姬凱元等[35]研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的羊駝黑素細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染 lpa-miR-nov-66 和添加α-MSH時(shí)， lpa-miR-nov-66能通過調(diào)控cAMP路徑抑制α-MSH對黑色素生成的正調(diào)控。

綜上，a-MSH/MC1R是黑色素生成的主要信號(hào)通路，是皮膚色素合成與沉著起始的關(guān)鍵步驟，二者的結(jié)合一方面激活和提高TYR家族的酶活性，促進(jìn)黑色素的合成[5]，還能促進(jìn)黑素細(xì)胞樹突的形成，加速黑素小體到角化細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)黑色素的沉著[6]，另一方面通過調(diào)控螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)MITF表達(dá)，促進(jìn)TYR、TYRP1和TYRP2的表達(dá)，進(jìn)而影響黑色素的生成[22]，而許冬梅等[18]發(fā)現(xiàn)，MITF是miR-186-5p的靶基因，且miR-186-5p能通過MITF抑制黑素細(xì)胞的增殖和遷移。本研究中，在綿羊黑素細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-186-5p的同時(shí)添加α-MSH，α-MSH能緩解miR-186-5p對靶基因MITF及黑色素生成關(guān)鍵基因家族TYR家族的抑制作用。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，在綿羊黑素細(xì)胞中miR-186-5p通過負(fù)調(diào)控MITF抑制相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制黑色素的生成，而添加α-MSH激活了α-MSH/MC1R信號(hào)通路，促進(jìn)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)以及黑色素的生物合成，因此，在綿羊黑素細(xì)胞中miR-186-5p和α-MSH協(xié)同作用時(shí)，α-MSH能減弱miR-186-5p對黑色素生成的抑制作用，由于α-MSH 對黑素細(xì)胞的增殖影響不大，因此，在細(xì)胞劃痕試驗(yàn)中α-MSH并不能緩解miR-186-5p對綿羊黑素細(xì)胞遷移的抑制作用。綜上，在綿羊黑素細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-186-5p的同時(shí)添加α-MSH抑制了MITF及TYR家族的表達(dá)，進(jìn)而抑制了黑色素的生成和細(xì)胞的遷移。