皰疹病毒ICP22蛋白研究進展

李陽光，吳 英，汪銘書，程安春*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院禽病防治研究中心，成都 611130； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 預(yù)防獸醫(yī)研究所，成都 611130； 3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130)

皰疹病毒科病毒是一類雙鏈DNA病毒，其典型結(jié)構(gòu)包括120～245 kb長的雙鏈DNA基因組、20面體核衣殼(caspid)、皮層(tegument)和囊膜(envelope)[1]。根據(jù)第10次ICTV報告，皰疹病毒家族分為α、β和γ 3個亞科[2]，α皰疹病毒主要包括單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus 1, HSV-1)[3]、水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus, VZV)[4]、牛皰疹病毒(bovine herpesvirus 1, BHV)[5]、馬立克病毒(Marek’s disease virus, MDV)[6]、馬皰疹病毒1型 (equine herpesvirus 1, EHV-1)[7]、偽狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)[8]、鴨腸炎病毒(duck enteritis virus, DEV)[9-12]等。典型β、γ類皰疹病毒分別是人巨細胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)和愛潑斯坦-巴爾病毒(epstein-barr virus, EBV)。眾多研究表明皰疹病毒ICP22蛋白及其同源物對潛伏感染的建立、病毒復(fù)制、細胞凋亡、成熟病毒粒子出芽等多方面至關(guān)重要，現(xiàn)對其研究進展做簡要概述，以期為ICP22及同源物基本特性以及參與病毒生命周期的深入研究提供參考。

1 皰疹病毒US1基因及其同源基因特點

皰疹病毒基因組一般由長獨特區(qū)(unique long, UL)、短獨特區(qū)(unique short, US)、末端重復(fù)序列(terminal repeat sequence, TRS)以及內(nèi)部重復(fù)序列(internal repeat sequence, IRS)組成，構(gòu)成UL-IRS-US-TRS形式[13]。當(dāng)病毒粒子進入感染細胞后，開始啟動病毒基因的串聯(lián)表達與蛋白翻譯表達，根據(jù)轉(zhuǎn)錄順序可分成立即早期(IE)、早期(E)和晚期(L)3類[14-15]。IE基因轉(zhuǎn)錄不需要依賴于新合成的DNA或蛋白質(zhì)，其編碼蛋白在病毒感染過程中起廣泛的調(diào)控作用，E基因表達需要IE基因激活，通常編碼病毒基因復(fù)制相關(guān)蛋白，L基因主要編碼囊膜糖蛋白，其表達依賴于病毒DNA的復(fù)制[16]。皰疹病毒US1基因及其同源物序列或結(jié)構(gòu)有所差異，如HSV-1僅含1個1 260 bp的US1基因，類屬立即早期基因[17]，HCMVUS1屬于早期基因[18]，MDVUS1基因最初被定義為IE基因，隨后被證明是L基因，感染后期才能被檢測到[6]。大多數(shù)皰疹病毒US1基因以對稱雙拷貝形式位于內(nèi)部重復(fù)區(qū)和末端重復(fù)區(qū)，且轉(zhuǎn)錄方向相反。如VZV ORF63/70為834 bp的立即早期基因[19]，其編碼蛋白常稱之為IE63。1 050 bp長的PRVRsp40基因類型較為特殊，文獻報道該基因非典型性動力學(xué)表達，不屬于IE基因[20]。BHV-1 US區(qū)域沒有US1基因，但是由112 768—113 670 bp和124 548—125 450 bp[21]轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生、同時具有IE與L動力學(xué)的1.7 kb轉(zhuǎn)錄本編碼蛋白定義為立即早期蛋白BICP22[5]。EHV-1中US1同源基因是長為1 410 bp的IR4基因，其差異表達1.4 kb的早期和1.7 kb的晚期轉(zhuǎn)錄本，編碼的早期蛋白EICP22蛋白相對分子質(zhì)量介于42～47 ku[22]。最新報道表明DEVUS1基因為990 bp的反向重復(fù)的IE基因[23-25]。此外，HSV-1中存在一個US1 N端1—146 AA截短表達的基因——US1.5，在感染晚期才會被檢測到，UL13蛋白激酶對US1.5蛋白進行翻譯后修飾，從而正常表達UL38和US11等晚期基因子集[17]，但是US1.5的具體功能以及與US1的關(guān)聯(lián)目前還不清楚[17]。

2 皰疹病毒ICP22蛋白的翻譯后修飾

序列比對發(fā)現(xiàn)已有報道的皰疹病毒ICP22蛋白含有一個涉及蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控等重要功能的保守結(jié)構(gòu)域IE_68(圖1)。已有報道的ICP22蛋白合成加工過程涉及多種修飾，各類修飾往往導(dǎo)致相對分子質(zhì)量變大。例如，HSV-1 UL13與US3病毒蛋白以及未知的細胞蛋白可以磷酸化ICP22，其中，Thr-116和Thr-193位點的磷酸化與病毒毒力相關(guān)[26-27]，另外還存在經(jīng)細胞酪蛋白激酶介導(dǎo)的核苷酸化修飾，眾多修飾導(dǎo)致ICP22表觀相對分子質(zhì)量為68 ku[28]。VZV ORF63基因編碼的IE63蛋白可被細胞酪蛋白和ORF47激酶以及CDK 1、CDK 2磷酸化，最終呈現(xiàn)45 ku的表觀相對分子質(zhì)量[29]。其中，CDK 1磷酸化Ser-224涉及IE63細胞定位以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，CDK 2磷酸化Thr-171、Ser-181和Ser-186從而介導(dǎo)IE63與ASF-1的相互作用[30]以及VZV潛伏感染的建立[31]。近期研究表明，DEV ICP22相對分子質(zhì)量比預(yù)期偏大22 ku，生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，DEV ICP22含眾多磷酸化和糖基化位點，推測其表觀相對分子質(zhì)量偏大是各類細胞激酶作用所致[24]。

保守域HERPES_IE68以灰色突出顯示，保守氨基酸以黑色顯示The conserved HERPES_IE68 domain is highlighted in grey, and the conserved motifs are shown in black圖1 皰疹病毒ICP22蛋白序列比對Fig.1 Sequence analysis of herpesvirus ICP22 amino acids

3 皰疹病毒ICP22細胞內(nèi)定位

不同皰疹病毒ICP22細胞內(nèi)定位不盡相同，如MDV ICP22在DEF中定位于細胞質(zhì)[3]，而HSV-1 ICP22在感染細胞和轉(zhuǎn)染細胞中均定位細胞核。HSV-1 ICP22含有兩個獨立的核定位信號(nuclear localization sequence, NLS)，NLS1位于ICP22 16—31AA，NLS2位于ICP22 118—131AA[32]。然而N端缺失1—146AA的US1.5定位于核，推測ICP22還有未被鑒定出或入核能力較弱的核定位信號[33]。潛伏感染階段的IE63定位于細胞質(zhì)，體外裂解性感染時則定位細胞核，突變磷酸化位點后定位由核轉(zhuǎn)變?yōu)橘|(zhì)，表明激酶的磷酸化作用對IE63定位很重要[34]。研究表明，PRV ICP22定位于細胞核，其41—60AA為典型單分核定位信號，其49—50AA(KR)為關(guān)鍵氨基酸。同時，Cai等[8]發(fā)現(xiàn)PRV ICP22是通過Ran、importinα1-和α7介導(dǎo)途徑靶向細胞核。最新研究發(fā)現(xiàn)，DEV ICP22在感染或轉(zhuǎn)染情況下均定位于核，進一步發(fā)現(xiàn)305—314AA為一典型單分核定位信號，其中，309R為關(guān)鍵位點，然而突變該位點的重組病毒感染DEF后ICP22仍定位于核，推測感染情況下有其他病毒蛋白或ICP22本身還未鑒定出的NLS帶動其入核[24]。

4 皰疹病毒ICP22功能研究進展

4.1 ICP22影響病毒潛伏感染的建立

潛伏感染是病毒持續(xù)性感染的狀態(tài)，病毒基因存在于組織或細胞中，既不產(chǎn)生感染性疾病也不出現(xiàn)臨床癥狀，在某些條件下可被激活，急性發(fā)作而出現(xiàn)癥狀，此時可以檢測出病毒[35]。HSV-1 ICP22在潛伏感染階段不表達，但是缺失ICP22可顯著降低病毒復(fù)制水平以及在感染小鼠三叉神經(jīng)中建立潛伏感染的能力[3]。目前，已確定HSV-1 ICP22 Thr-193、Tyr-116的磷酸化與病毒毒力相關(guān)[27]，Ser-34或Tyr-116單突變即可減弱HSV-1引起的眼疾嚴重程度。最新研究發(fā)現(xiàn)，ICP22與CD80啟動子直接結(jié)合可抑制眼部免疫反應(yīng)，同時該抑制能力取決于再激活病毒的復(fù)制水平，因此作者推測，Ser-34或Tyr-116位點突變不影響ICP22與CD80啟動子的結(jié)合，ICP22對CD80的抑制作用可保護宿主免受病原引起的病理侵害[3]。

VZV可表達VZV-潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(VZV latency transcript, VLT)和ORF63兩種轉(zhuǎn)錄本[4]。ORF63是VZV復(fù)制必需基因，其編碼蛋白IE63不僅作為激活E基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，還能改變神經(jīng)元對細胞凋亡的敏感性以及減弱Ⅰ型干擾素(interferon, IFNs)信號傳導(dǎo)的免疫反應(yīng)，在潛伏期作為主要表達產(chǎn)物可被檢測到[36]，ORF63缺失導(dǎo)致VZV在人黑素瘤細胞中的復(fù)制以及嚙齒動物中潛伏期的建立受到損害[29]。此外，ORF61編碼蛋白IE61是豚鼠腸道神經(jīng)元中IE63入核的必需蛋白，推測VLT通過對ORF61轉(zhuǎn)錄和翻譯的阻遏作用將IE63攔截在細胞質(zhì)并阻止病毒的反式激活[37]，這可能是潛伏感染期間IE63定位于細胞質(zhì)的原因之一。

MDV ICP22參與病毒潛伏感染的研究已有較多報道。潛伏期間MDV-miR-M1-5P和MDV-miR-M5-3p能下調(diào)潛伏期MDV ICP22 mRNA水平，而MDV-miR-M4-5P和細胞同源物GGA mir-155-3p可以上調(diào)ICP22表達[6，38]。Boumart等[6]提出一個假設(shè)模型，首先是GGA miR-155-3P促進ICP22表達，稍后GGA miR-155-3P以尚不清楚的分子機制被抑制表達。然后，被感染細胞中MDV-miR-M4-5P促進ICP22表達，由于MDV-miR-M4-5P在感染的各個階段都表達，因此，潛伏階段MDV-miR-M1-5P和MDV-miR-M5-3P會抑制ICP22表達從而保證潛伏感染細胞的存活[6]。

4.2 ICP22的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用

細胞RNA聚合酶Ⅱ (RNA polymerase Ⅱ, RNA Pol Ⅱ)大亞基的保守C端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain, CTD)由Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7 7肽序列重復(fù)組成，在所有真核生物中均保守，能為RNA Pol Ⅱ復(fù)合物招募mRNA加工和染色質(zhì)修飾所需因子從而參與基因轉(zhuǎn)錄[39]。

正向轉(zhuǎn)錄延伸因子b(positive transcription elongation factor b, P-TEFb) 是細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶9(cyclin-dependent kinases, CDK 9)和某些周期蛋白形成的復(fù)合物，可被募集到轉(zhuǎn)錄起始的啟動子區(qū)域磷酸化RNA Pol Ⅱ CTD Ser-2，進而促進轉(zhuǎn)錄延長。HSV-1感染后，ICP22與P-TEFb亞基CDK 9直接結(jié)合，阻斷其募集從而抑制基因轉(zhuǎn)錄，該過程還可能有US3的參與[40]。RNA Pol Ⅱ可與ICP22、CDK 9共定位[41]，猜測ICP22以某種未知方式調(diào)節(jié)CDK 9活性。此外，ICP22表達可使RNA Pol Ⅱ CTD Tyr-1、Ser-2磷酸化丟失[42]，推測ICP22可參與HSV-1感染細胞中RNA Pol Ⅱ的修飾進而抑制病毒與宿主基因的轉(zhuǎn)錄。針對上文所述的轉(zhuǎn)錄抑制情況，HSV-1病毒蛋白VP16能夠聯(lián)合宿主細胞因子1(host cell factor-1, HCF-1)、八聚體轉(zhuǎn)錄因子(octamer transcription factor, Oct-1)等識別IE基因啟動子上游區(qū)域的TAATGARAT特定序列元件，從而打破ICP22對IE基因轉(zhuǎn)錄的限制，有利于E和L基因的轉(zhuǎn)錄表達[40]。此外，ICP22可導(dǎo)致促染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子(facilitates chromatin transcription, FACT)在細胞核中重新定位，還可招募其與轉(zhuǎn)錄延伸因子Spt5(Supt5 h)、Spt6(Supt6 h)等至病毒基因組以促進病毒γ基因的轉(zhuǎn)錄表達[43]。綜上表明，ICP22能參與HSV-1劫持宿主細胞RNA Pol Ⅱ以高效轉(zhuǎn)錄病毒基因。然而關(guān)于病毒感染后宿主基因轉(zhuǎn)錄受抑制模型仍需更多討論，1)許多細胞系中HSV-1病毒基因轉(zhuǎn)錄以及L基因表達不絕對需要ICP22，例如在Vero細胞系中ICP22缺失株與野生株表型幾乎一致。2)無論是否發(fā)生磷酸化修飾，RNA Pol Ⅱ均可被募集到病毒的轉(zhuǎn)錄/復(fù)制區(qū)室[44]。3)常規(guī)轉(zhuǎn)錄因子TFⅡE是未感染細胞中轉(zhuǎn)錄起始所必需的，感染HSV-1后在IE蛋白作用下丟失，有可能因此而導(dǎo)致細胞基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制[45]。但是ICP22缺失株并不能消除這一現(xiàn)象[45]，說明ICP22可能不參與這一路徑。

VZV IE63可以與病毒反式激活因子IE62、RNA Pol Ⅱ和感染細胞核中的細胞延伸因子EF-1α啟動子相互作用而參與VZV基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，其中，IE63可以結(jié)合與EF-1α啟動子相互作用的細胞因子，從而反式激活其表達[46]。IE63強烈抑制IE62表達，也可以與IE62結(jié)合上調(diào)gI糖蛋白啟動子的表達，還可以作為VZV和異源病毒許多啟動子的轉(zhuǎn)錄阻遏物[29]。已經(jīng)明確IE63可通過1—142AA序列與IE62相互作用并在感染細胞中部分共定位，還可與RNA Pol Ⅱ復(fù)合存在于感染細胞中，但是IE63-ORF47復(fù)合物能否改變RNA Pol Ⅱ的磷酸化進而影響VZV基因調(diào)控尚不清楚[47]。此外，干擾素(interferon，IFNs)在VZV致病機制中起重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，IE63可通過抑制真核翻譯起始因子2(eukaryotic initiation factor 2, eIF2)的磷酸化從而抑制IFN下游信號通路，同時，IE63還可介導(dǎo)eIF2脫磷酸化，具體作用機制也還未知[45]。這些發(fā)現(xiàn)表明，VZV可能已進化出復(fù)雜機制來逃避細胞保護路徑，IE63在VZV致病過程中具有重要作用。

EHV-1病毒基因組僅表達一個IE蛋白(IE protein, IEP)，可反式激活E和一些L基因以及異源病毒基因啟動子[48]。早期蛋白EICP22是不結(jié)合DNA的非必需基因，對EHV-1基因啟動子的反式激活作用很弱，不過EICP22 142-239AA序列可介導(dǎo)兩者相互作用形成EICP22P-IEP復(fù)合物提高IEP與其靶序列的結(jié)合速率以促進E以及L基因的表達，但是任何形式的EICP22P都不能克服IEP對自身啟動子的抑制作用[49]。此外，純化的GST-EICP22融合蛋白能夠恢復(fù)某些IEP突變體的DNA結(jié)合能力，推測EICP22與IEP的相互作用有助于招募轉(zhuǎn)錄因子和/或促進轉(zhuǎn)錄起始的細胞因子，增強IEP和病毒基因啟動子的結(jié)合活性以提高轉(zhuǎn)錄效率。另外，研究表明EICP22 124—143AA可介導(dǎo)自身相互作用形成二聚體甚至高階復(fù)合物，但僅有全長EICP22能與IEP協(xié)同作用促進反式激活[50]。Derbigny等[51]證明EICP22突變體的穩(wěn)定性，因此，猜測EICP22P突變體蛋白構(gòu)象發(fā)生改變使得與IEP的相互作用受損，相互作用的非必需序列有助于招募特定細胞因子到蛋白復(fù)合物中。然而EICP22調(diào)節(jié)病毒基因表達的確切機制仍然不清楚，后續(xù)可探究EICP22P與細胞轉(zhuǎn)錄因子有無相互作用和EICP22P-IEP復(fù)合物反式激活過程中EICP22參與調(diào)節(jié)的作用機制。

復(fù)制機制研究較為深入的是HSV-1和VZV，結(jié)果表明兩者都已進化出篡奪細胞基因復(fù)制系統(tǒng)以大量產(chǎn)生病毒后代的機制，均編碼與RNA Pol Ⅱ相互作用的IE蛋白ICP22和IE63。已經(jīng)明確ICP22蛋白及其同源物在基因調(diào)控中具有重要作用，但如何參與劫持細胞基因表達系統(tǒng)以促進病毒基因復(fù)制以及轉(zhuǎn)錄本的翻譯，如何在不同細胞系、不同病毒中發(fā)揮獨特作用還知之甚少，關(guān)于α皰疹病毒基因調(diào)控仍需更多探索。

4.3 ICP22調(diào)節(jié)病毒核出芽

皰疹病毒核衣殼太大不能自由穿過核膜。因此，細胞核內(nèi)的子代核衣殼首先通過內(nèi)核膜進入核周進行初級囊膜包膜，然后與外核膜融合進行去囊膜化從而進入細胞質(zhì)[52-55]。就HSV-1 而言，由UL31和UL34構(gòu)成的核出芽復(fù)合體(nuclear egress complex, NEC)對病毒核衣殼的初次包裝很關(guān)鍵[56]。ICP22可與UL31、UL34共定位于細胞核膜，缺失ICP22后UL31和UL34定位發(fā)生改變，反之UL31缺失亦可影響ICP22細胞內(nèi)定位[57]。此外，ICP22缺失可導(dǎo)致細胞核周初級囊膜包被病毒粒子數(shù)量大量減少，核中積累大量衣殼。以上資料表明ICP22是病毒核出芽的重要非必需蛋白，可能通過與UL31和/或UL34相互作用來發(fā)揮作用[58]。

4.4 ICP22參與細胞凋亡

一些病毒能致宿主細胞凋亡[59-61]，細胞凋亡是一種必不可少的復(fù)雜天然免疫機制，可以有效清除感染或衰老細胞[62]。HSV-1感染后期ICP22可通過US1.5激活半胱天冬酶3(caspase-3)而實現(xiàn)促凋亡作用[52]；隨后發(fā)現(xiàn)ICP22 蛋白具有抗細胞凋亡的作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)ICP22缺失可下調(diào)US5基因(具有抗細胞凋亡功能)表達水平，推測ICP22可通過影響US5表達進而發(fā)揮抗凋亡作用[63]，因而推斷ICP22參與細胞凋亡過程且發(fā)揮雙重作用。You等[52]、游韶平等[64]發(fā)現(xiàn)單獨表達HSV-2 ICP22蛋白只能較低程度地抵抗放線菌素D(act-dactinomycin D, ActD) 誘導(dǎo)的細胞凋亡，因而推測ICP22不是直接作用于細胞，而是通過調(diào)節(jié)病毒基因表達以及與病毒和/或細胞蛋白相互作用而發(fā)揮抗細胞凋亡作用，各類調(diào)節(jié)路徑相互作用導(dǎo)致HSV-1 ICP22對細胞凋亡有雙重作用。另一方面，p53可通過激活Bax或抑制Bcl-2來調(diào)節(jié)各種細胞途徑并控制細胞凋亡[65]，還可在感染后期可抑制ICP0表達，不過該抑制作用可被ICP22拮抗，從而促進細胞存活和病毒有效復(fù)制[28]。

IE63缺失病毒感染細胞的凋亡程度明顯增加，此外單獨表達IE63即可降低細胞凋亡水平，表明IE63具有抗細胞凋亡作用[66]。已經(jīng)明確磷酸化eIF2可以介導(dǎo)細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[67]，而IE63能抑制eIF2的磷酸化以及介導(dǎo)eIF2脫磷酸化[52]，因而推測IE63抑制細胞凋亡的作用路徑可能與eIF2(脫)磷酸化有關(guān)。不過還未發(fā)現(xiàn)IE63有HSV-1 ICP22的促凋亡作用，表明即使同源蛋白之間也可能存在不同功能與作用機制[52]。

4.5 ICP22參與細胞自噬與抗病毒反應(yīng)

自噬是一種溶酶體降解系統(tǒng)，可促進細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細胞器的分解，傳統(tǒng)上被認為是一種保護機制，然而在特定條件下也可以用作促死亡途徑[68-69]。HSV-1感染細胞中，核仁蛋白(protein interacting with carboxyl terminus 1, PICT-1)通過抑制核糖體RNA(ribosomal RNA, rRNA)轉(zhuǎn)錄和失活A(yù)KT/mTOR/p70S6K通路而觸發(fā)促死亡性自噬[70]，病毒蛋白伴侶ICP0和ICP22與PICT-1相互作用參與到上述過程，然而ICP22的具體作用機制尚不清楚[71]。

HSV-1感染后，細胞蛋白會發(fā)生劇烈的空間重組并錯誤折疊到細胞核中，形成病毒誘導(dǎo)分子伴侶富集域(virus-induced chaperone-enriched, VICE)，其中熱休克同源蛋白70(heat shock cognate protein 70, Hsc70)可介導(dǎo)抗原遞呈與細胞自噬過程，參與細胞抗病毒作用[72]。單獨表達ICP22即可形成ICP22、Hsc70和錯誤折疊蛋白質(zhì)構(gòu)成的核內(nèi)復(fù)合物，感染ICP22缺失病毒的情況下不會誘導(dǎo)VICE結(jié)構(gòu)域的形成，表明ICP22是誘導(dǎo)VICE所必需的[73]。最新研究表明，ICP22作為一種J樣蛋白，可能通過Hsc70與Hsp40/ Hsp70復(fù)合物相互作用，促使錯誤折疊蛋白向核聚集以降低細胞毒性來發(fā)揮抗病毒作用[74]。不過ICP22完整作用途徑以及為何Hsc70只能與ICP22突變體而非全長免疫共沉淀還不清楚[74]?？傊?，作為第一個病毒J樣分子伴侶蛋白以及抗病毒藥物開發(fā)的靶標[72]，ICP22在抗病毒科學(xué)研究與臨床應(yīng)用中具有重大意義。

5 小 結(jié)

皰疹病毒ICP22蛋白是一個翻譯后修飾的多功能蛋白，可以參與病毒潛伏感染的建立、調(diào)控病毒基因轉(zhuǎn)錄以及成熟病毒粒子出芽，也涉及細胞凋亡、自噬和抗病毒等生命周期重要過程，但其機制大多不明確，對其開展深入研究將有利于皰疹病毒感染疾病的治療與防控。此外，有關(guān)ICP22蛋白的報道大多源于人皰疹病毒，對動物皰疹病毒、特別是以ICP22作為靶標的新藥研究，應(yīng)該成為今后的研究重點之一。