暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽脫苦前后苦味物質(zhì)的變化

樂(lè)彩虹，陶寧萍, 2*，徐逍

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)3(江蘇中洋生態(tài)魚(yú)類股份有限公司，江蘇 南通, 226600)

河豚是鲀形目、鲀科各屬魚(yú)類的統(tǒng)稱[1]。河豚魚(yú)又名氣泡魚(yú)，其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受人們喜愛(ài)，但野生河豚體內(nèi)所含有的河豚毒素化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，難以破壞[2]。經(jīng)過(guò)20多年的發(fā)展，我國(guó)養(yǎng)殖技術(shù)逐漸成熟，養(yǎng)殖的河豚大多數(shù)已達(dá)無(wú)毒級(jí)，主要養(yǎng)殖暗紋東方鲀與紅鰭東方鲀兩種類型。據(jù)2020年漁業(yè)年鑒[3]可知，2019年河豚淡水養(yǎng)殖和海水養(yǎng)殖產(chǎn)量分別為0.99萬(wàn)t和1.75萬(wàn)t，是國(guó)外主要的無(wú)毒河豚供應(yīng)源[4]。魚(yú)皮是魚(yú)類加工副產(chǎn)物，含有大量膠原蛋白，但只有一小部分比例魚(yú)皮用于生產(chǎn)皮革材料和動(dòng)物飼料等，大部分被丟棄而造成浪費(fèi)與污染[5]。暗紋東方鲀魚(yú)皮膚分內(nèi)外兩層，體表有刺，同大多數(shù)魚(yú)皮一樣，含有大量的膠原蛋白，是提取膠原蛋白肽理想的原料[6]。

膠原蛋白肽是以膠原蛋白為原料，在酸、堿、熱處理或酶解的作用下得到的一種產(chǎn)物[7]，具有良好的生物活性[8-9]。1952年有研究者首次提出蛋白酶解物具有苦味，這種苦味是由多肽引起的而不是游離氨基酸[10]。GORDON等[11]在1965年第一次報(bào)道了在乳清培養(yǎng)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生具有苦味的肽?？辔峨囊彩且环N生物活性肽[12]，但苦味很難讓人接受，其苦的呈現(xiàn)味主要與肽的疏水性氨基酸有關(guān)，由肽中疏水性氨基酸的組分和序列決定[13]。目前對(duì)苦味進(jìn)行脫苦的方法主要有選擇分離法[14]、掩蓋法[15]、酶法[16]和微生物法[17]，其中活性炭吸附法屬于選擇分離法類，活性炭比表面積大、微孔數(shù)量多、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、pH范圍廣，且完全不溶于水和其他溶劑[18]，常被用于作為吸附劑脫苦。硅藻土具有較大的表面積和孔體積，因而具有較強(qiáng)的吸附能力，其作為助濾劑，還有去除異味的功能[19]。MURRAY等[20]最先采用活性炭對(duì)酪蛋白水解物進(jìn)行苦味的脫除。徐錦等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在活性炭添加量為0.6%，時(shí)間為1.5 h，溫度50 ℃條件下，草魚(yú)蛋白水解液的苦味能很好的去除。張瑞瑞等[22]用硅藻土作為助濾劑對(duì)羅非魚(yú)酶解液進(jìn)行脫苦取得了一定的效果。

本文選用暗紋東方鲀魚(yú)皮，用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy,SEM)對(duì)其微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并在前期優(yōu)化提取和脫苦工藝的基礎(chǔ)上，采用復(fù)合蛋白酶提取膠原蛋白肽，用活性炭和硅藻土對(duì)其酶解液進(jìn)行吸附脫苦，以感官評(píng)價(jià)結(jié)合電子舌、氨基酸組成和氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析評(píng)價(jià)脫苦效果，以期為暗紋東方鲀魚(yú)皮的精深加工以及膠原蛋白肽酶解液苦味的脫除提供理論依據(jù)，從而創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用原料暗紋東方鲀魚(yú)皮[獲得時(shí)間2020年6月13日，魚(yú)皮長(zhǎng)(22.46±0.73) cm，重(28.33±5.12) g，背面呈褐色，腹面呈白色，周圍呈黃色]，由江蘇中洋生態(tài)魚(yú)類股份有限公司提供。

HCl、H2SO4、高氯酸均為分析純，上?？蚂`斯試劑有限公司；NaOH、硼酸、石油醚、氯胺T(3H2O·N-氯-對(duì)甲苯磺酰胺鈉鹽)、一水檸檬酸、無(wú)水乙酸鈉、正丙醇、異丙醇、檸檬酸鈉、苯酚均為分析純，羥脯氨酸(4-羥基-α-吡咯甲酸)標(biāo)準(zhǔn)品為色譜級(jí)，活性炭、硅藻土為食品級(jí)，上海麥克林生物科技有限公司；復(fù)合蛋白酶(酶活1.5 AU/g，由地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵而得)，諾維信生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Kjeltec 8400全自動(dòng)凱氏定氮儀，丹麥FOSS公司；Soxtec 2050自動(dòng)索式抽提儀，丹麥FOSS公司；HP10電熱板，德國(guó)艾卡公司；FineBox-6100 馬弗爐，浙江泛泰儀器有限公司；UV-2200 紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Unico公司；TG16-WS 臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；HWS-24 電熱恒溫水浴鍋，上海恒科學(xué)儀器有限公司；Hitachi S-3400 N 掃描電鏡，日立高新技術(shù)公司；L-8800 氨基酸自動(dòng)分析儀，日本日立公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海慧泰儀器制造有限公司；FD-80真空干燥箱，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；ASTREE電子舌，法國(guó)Alpha MOS公司；6 890-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 暗紋東方鲀魚(yú)皮基本營(yíng)養(yǎng)成分和膠原蛋白含量測(cè)定

1.3.1.1 樣品處理

暗紋東方鲀魚(yú)皮切成1 cm×1 cm左右大小粒狀，分裝于自封袋，置于-40 ℃冰箱保存待用。

1.3.1.2 基本營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

水分含量測(cè)定：參照GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》。蛋白質(zhì)含量測(cè)定：參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》。脂肪含量測(cè)定：參照GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》。灰分含量測(cè)定：參照GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》。

1.3.1.3 膠原蛋白含量測(cè)定

參照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測(cè)定》，采用分光光度法測(cè)定魚(yú)皮中羥脯氨酸含量，乘以系數(shù)11.1[23]便可得暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白含量。

1.3.2 暗紋東方鲀魚(yú)皮掃描電子顯微鏡結(jié)構(gòu)觀察

參照王超[24]的方法并稍作修改，將潔凈的鋁箔片粘于樣品盤(pán)上，選取均勻的暗紋東方鲀魚(yú)皮內(nèi)外兩層皮膚分別粘于鋁箔片上，將樣品盤(pán)置于離子濺射儀的樣品艙中，噴金5 min，將樣品盤(pán)放入掃描電子顯微鏡觀察室，選取清晰視野進(jìn)行觀察。

1.3.3 暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液的提取與脫苦

按照實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化提取工藝，在酶添加量為2%，溫度53 ℃的條件下用復(fù)合蛋白酶處理暗紋東方鲀魚(yú)皮1.5 h，即為脫苦前膠原蛋白肽酶解液。移取一部分酶解液用于脫苦，按照實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化脫苦條件，在活性炭與硅藻土添加量為6%，活性炭與硅藻土添加比例為1∶5(質(zhì)量比)，溫度65 ℃，時(shí)間20 min的條件下對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液進(jìn)行脫苦，即為脫苦后多肽酶解液。

1.3.4 暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后滋味感官分析

參照潘印卿[25]的方法并稍作修改，選取檸檬酸、蔗糖、咖啡粉、食鹽和味精分別作為酸、甜、苦、咸和鮮的標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)應(yīng)的濃度及分值如表1所示。

表1 不同濃度滋味標(biāo)準(zhǔn)品評(píng)分值Table 1 Standard tasting scores of different concentrations of taste

選取10名(5男5女)經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的感官品評(píng)員進(jìn)行感官分析，10名感官品評(píng)員在感官評(píng)價(jià)過(guò)程中全程無(wú)交流。取其中一個(gè)味道的低濃度標(biāo)準(zhǔn)品放入口中感受其滋味，5 s后吐出，用水漱口，接著品嘗下一個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品，至全部濃度感受完成；取樣品少量放入口中感受其滋味，5 s后吐出，用水漱口，3 min后品嘗下一個(gè)樣品。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)應(yīng)的分值對(duì)樣品進(jìn)行對(duì)照打分，得到樣品的分值。剩余味道分析同上。

1.3.5 暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后電子舌分析

本實(shí)驗(yàn)所用電子舌傳感器能直接檢測(cè)出酸、咸、鮮3種滋味響應(yīng)值，苦和甜響應(yīng)值需以標(biāo)準(zhǔn)添加的方式獲得，具體添加方法如下：稱取不同質(zhì)量咖啡粉和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品分別加入暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽脫苦前酶解液中，使得苦味和甜味濃度梯度均為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 g/100mL。參照周紛等[26]的方法稍作修改，各移取2 mL脫苦前后暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液和苦味、甜味不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)添加樣品于離心管中，加入25 mL超純水，超聲5 min，在冷凍離心機(jī)中以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，過(guò)濾至100 mL容量瓶，用超純水定容，移取5 mL于電子舌專用進(jìn)樣杯中，超純水定容至80 mL，室溫條件下進(jìn)行測(cè)定。電子舌傳感器每次檢測(cè)后均用去離子水進(jìn)行清洗，清洗周期10 s。

1.3.6 暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后氨基酸組成分析

參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定進(jìn)行測(cè)定》，分別稱取暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽脫苦前后酶解液各0.300 0 g于水解管中，加入10 mL 6 mol/L HCl，再加入3滴苯酚，抽真空，立即封口，放入110 ℃干燥箱中水解22 h，取出冷卻至室溫，打開(kāi)水解管，酶解液過(guò)濾至50 mL容量瓶中，少量水沖洗水解管，合并水解液，用水定容，吸取1 mL濾液于15 mL試管中，放入50 ℃真空干燥箱中真空干燥，蒸干，殘留物再用1 mL水溶解，再放入50 ℃真空干燥箱中真空干燥，蒸干，加入2 mL pH 2.2檸檬酸鈉緩沖液溶解，振蕩混勻，用0.22 μm水相膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中，采用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后GC-MS分析

參照TAN等[27]的方法并稍作修改，采用65 μm DVB/ PDMS萃取頭，各吸取暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽脫苦前后酶解液5 mL于頂空瓶中，再加入5 mL 0.18 mol/L NaCl以促進(jìn)揮發(fā)，在50 ℃水浴鍋中萃取45 min,迅速將SPME針插入GC-MS進(jìn)樣口進(jìn)行分析。

色譜條件：HP-5 ms彈性毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；程序升溫：初始溫度30 ℃，保持3 min，以8 ℃/min升至70 ℃，5 ℃/min升至150 ℃，5 ℃/min升至260 ℃保持5 min，載氣(He)流速1.5 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子電離源；解吸時(shí)間5 min；電子能量70 eV；燈絲發(fā)熱電流200 μA；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；傳輸線溫度280 ℃；檢測(cè)器電壓1.2 kV；質(zhì)量掃描范圍m/z50～350。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±S.D.)的形式表示。采用SPSS 23.0軟件，根據(jù)單因素方差(One-Way ANOVA)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性比較分析，電子舌結(jié)果采用Alpha Soft 軟件進(jìn)行分析；Origin 8.6(Origin Lab，USA)軟件用于處理和生成圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 暗紋東方鲀魚(yú)皮基本營(yíng)養(yǎng)成分和膠原蛋白含量

表2為暗紋東方鲀魚(yú)皮基本營(yíng)養(yǎng)成分和膠原蛋白含量。由表2可知，暗紋東方鲀魚(yú)皮水分含量為75.03%，灰分含量為1.14%，粗脂肪含量?jī)H為0.09%，粗蛋白含量為23.39%。其粗蛋白含量高于比目魚(yú)皮[28]、鳙魚(yú)魚(yú)皮[29]等；粗脂肪含量低于大西洋鮭魚(yú)魚(yú)皮[30]、鱈魚(yú)魚(yú)皮[31]、比目魚(yú)皮[32]等?？梢?jiàn)暗紋東方鲀魚(yú)皮是一種高蛋白低脂肪的原料，且膠原蛋白含量高達(dá)18.99%，占總蛋白含量的81.19%，其膠原蛋白含量高于鱈魚(yú)魚(yú)皮[31]、鯉魚(yú)皮、魷魚(yú)皮[32]。由此可知暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白含量豐富，是提取膠原蛋白肽理想的原料。

表2 暗紋東方鲀魚(yú)皮基本營(yíng)養(yǎng)成分和膠原蛋白含量 單位：g/100gTable 2 Nutrient composition and collagen content of Takifugu obscurus skin

2.2 暗紋東方鲀魚(yú)皮掃描電子顯微鏡結(jié)構(gòu)觀察

暗紋東方鲀魚(yú)皮體表有刺，皮膚分內(nèi)外2層。外層皮膚擴(kuò)展時(shí)很快變硬，身上的刺豎起，既能進(jìn)攻，也能防范；內(nèi)層皮膚能協(xié)助穩(wěn)固外皮層的刺和防止自身受傷害。暗紋東方鲀魚(yú)皮可以最大限度拉伸擴(kuò)展成一個(gè)球形，這可能是因?yàn)槠浜写罅康哪z原蛋白和彈性蛋白[33]。

暗紋東方鲀魚(yú)皮掃描電子顯微鏡微觀結(jié)構(gòu)如圖1所示。圖1-a是暗紋東方鲀魚(yú)皮外層皮膚在35×下的掃描電鏡圖，可以看到外層皮膚表面全是刺，這些刺呈規(guī)則排列，似釘子狀，這是暗紋東方鲀魚(yú)皮具有良好性質(zhì)的基礎(chǔ)；圖1-b是外層皮膚上的某一根刺在300×下的掃描電鏡圖，可以看到在刺的尖部有很多長(zhǎng)短不一的類似絨毛一樣的形狀，其具體成分和性質(zhì)有待進(jìn)一步研究；圖1-c是暗紋東方鲀魚(yú)皮內(nèi)層皮膚在100×下的掃描電鏡圖，可以看到內(nèi)層皮膚整體來(lái)看不平整，有褶皺，類似起伏不平的小山丘狀，這可能是因?yàn)榘导y東方鲀魚(yú)皮能夠自由收縮而導(dǎo)致的；圖1-d是內(nèi)層皮膚在300×下的掃描電鏡圖，可知內(nèi)層皮膚放大后呈排列不規(guī)則的纖維狀，還可見(jiàn)其中有一些大小不一的空隙。由暗紋東方鲀魚(yú)皮掃描電子顯微鏡圖可知，暗紋東方鲀魚(yú)皮具有很好的性質(zhì)，多纖維、褶皺、有彈性，是提取膠原蛋白肽的理想原料。

a-外皮，35×；b-外皮，300×；c-內(nèi)皮，100×；d-內(nèi)皮，300×圖1 暗紋東方鲀魚(yú)皮掃描電子顯微鏡圖Fig.1 SEM image of Takifugu obscurus skin

2.3 暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后滋味感官分析

本實(shí)驗(yàn)感官評(píng)分采用十分制，酸、甜、苦、咸、鮮標(biāo)準(zhǔn)品濃度越大，滋味評(píng)分越高。將10名感官品評(píng)員對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后5種滋味的感官評(píng)價(jià)平均分制得柱狀圖如圖2所示，可直觀看出脫苦前后5種滋味變化情況。

由圖2可知，在5種滋味中，咸味感官評(píng)分最高，可能與人工養(yǎng)殖暗紋東方鲀水質(zhì)環(huán)境有關(guān)，且暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液在脫苦前后咸味無(wú)顯著性變化(P>0.05)；鮮味感官評(píng)分次之，且酶解液在脫苦前后鮮味也無(wú)顯著性變化(P>0.05)，可以看出暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液以咸鮮味為主；暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液在脫苦前苦味感官評(píng)分為4.8，脫苦后降低為3.3(P<0.05)，說(shuō)明用活性炭和硅藻土對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液進(jìn)行吸附脫苦取得了一定的效果，這與呂錦弟等[34]用復(fù)合吸附劑脫除酪蛋白磷酸肽的苦味結(jié)果一致；暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后酸味與甜味均不明顯，感官評(píng)分也較低，苦味的脫除使酸味與甜味感官評(píng)分均高于脫苦前(P<0.05)。

圖2 暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后滋味感官評(píng)分Fig.2 The taste sensory scores of collagen peptide enzymatic hydrolysate from Takifugu obscurus skin before and after debittering注:字母不同代表差異顯著(P<0.05)，字母相同代表差異不顯著(P>0.05)(下同)

2.4 暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后電子舌分析

電子舌人工傳感系統(tǒng)是一種新穎而快速的分析技術(shù)，受到了越來(lái)越多的關(guān)注[35]，可以對(duì)樣品的滋味差異進(jìn)行評(píng)定。

圖3為暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后滋味的主成分分析圖。由圖3可知，脫苦前后主成分PC1和PC2貢獻(xiàn)率分別為91.085%和8.79%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為99.875%，接近100%，表明主成分PC1、PC2包含了大量樣品原始數(shù)據(jù)，可以整體反映樣品信息[36]。判別指數(shù)(discrimination index，DI)是區(qū)分樣品之間差異的表征值，該值越大，區(qū)分效果越好，本實(shí)驗(yàn)DI為94%，表明樣品之間區(qū)分度大。不同樣品之間滋味差異可以通過(guò)樣品在主成分分析圖中的距離遠(yuǎn)近來(lái)表征，樣品間距離越遠(yuǎn)說(shuō)明樣品差異越大。由圖3可以看到，暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后分別分布于主成分分析圖中不同區(qū)域，脫苦前分布于2、3象限，脫苦后分布于1、4象限，且距離較遠(yuǎn)，表明脫苦前后樣品滋味差異較大，能起到很好的區(qū)分作用。

圖3 暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后滋味主成分分析Fig.3 Analysis of taste principal components of collagen peptide enzymatic hydrolysate from Takifugu obscurus skin before and after debittering

為了更直觀看出電子舌系統(tǒng)傳感器對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后滋味的響應(yīng)強(qiáng)度，制得雷達(dá)圖，如圖4所示(坐標(biāo)軸表示滋味響應(yīng)值)。由圖4可知，電子舌傳感器對(duì)脫苦前后2種酶解液的5種滋味均具有響應(yīng)，但敏感程度各不相同?？辔俄憫?yīng)值離散程度較大，說(shuō)明它能更好地區(qū)分不同樣品[37]。暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液在脫苦后苦味響應(yīng)值為5.2，低于脫苦前響應(yīng)值6.8，兩者存在顯著性差異(P<0.05)，說(shuō)明暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液經(jīng)活性炭和硅藻土吸附脫苦后取得了一定的脫苦效果，和感官評(píng)分結(jié)果相符。暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后咸味響應(yīng)值分別為 5.9和6.0，鮮味響應(yīng)值都為6.0，說(shuō)明酶解液在脫苦前后咸味和鮮味均無(wú)顯著性變化(P>0.05)，且酶解液脫苦后酸味和甜味響應(yīng)值均高于脫苦前(P<0.05)，這與感官評(píng)分結(jié)果一致。

圖4 暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后滋味雷達(dá)圖Fig.4 Taste radar image of collagen peptide enzymatic hydrolysate from Takifugu obscurus skin before and after debittering

2.5 暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后疏水性氨基酸變化

有研究[38]表明在蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中,大部分疏水性氨基酸側(cè)鏈藏在內(nèi)部,而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水解成小分子肽時(shí),肽鏈中疏水性氨基酸殘基就暴露出來(lái),從而產(chǎn)生苦味。多肽中疏水基團(tuán)的數(shù)目會(huì)影響苦味閾值的大小，當(dāng)疏水性較大的氨基酸在肽段中所占的比例增大時(shí)，產(chǎn)生的苦味也會(huì)隨之變強(qiáng)[39-40]。

表3為暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后氨基酸含量的變化。由表3可知，暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液中甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸含量相對(duì)較高，這與RUI等[41]的研究結(jié)果一致，符合膠原蛋白氨基酸組成特征。本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)出18種氨基酸，其中有7種疏水性氨基酸，分別是苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和脯氨酸。圖5-a為暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后總氨基酸變化，可見(jiàn)18種氨基酸含量在脫苦前后均有顯著性變化(P<0.05)，表明暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液被活性炭和硅藻土吸附后會(huì)改變其氨基酸含量；圖5-b為暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后疏水性氨基酸變化，可以看到暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液在脫苦后7種疏水性氨基酸含量均有不同程度減少，且酶解液在脫苦前疏水性氨基酸總含量為33.63%，脫苦后下降到29.75%，具有顯著性差異(P<0.05)，說(shuō)明用活性炭和硅藻土對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液中的苦味物質(zhì)進(jìn)行吸附脫苦起到了一定的效果，這與解銘[42]的研究結(jié)果一致。且必需氨基酸含量在脫苦前后無(wú)明顯變化，說(shuō)明用活性炭和硅藻土對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液進(jìn)行脫苦不會(huì)影響其必需氨基酸含量。

表3 暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后氨基酸含量Table 3 The contents of amino acids of collagen peptide enzymatic hydrolysate from Takifugu obscurus skin before and after debitter

a-總氨基酸；b-疏水性氨基酸圖5 暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后氨基酸變化Fig.5 Amino acid changes of collagen peptide enzymatic hydrolysate from Takifugu obscurus skin before and after debittering

2.6 暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后揮發(fā)性物質(zhì)變化

呈苦味的揮發(fā)性物質(zhì)會(huì)隨著活性炭和硅藻土的添加而被吸附，從而導(dǎo)致脫苦前后含量變化。表4為暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量。由表4可知，暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后揮發(fā)性物質(zhì)共檢出29種，其中有11種相同的物質(zhì)。

表4 暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量Table 4 The relative contents of volatile substances of collagen peptide enzymatic hydrolysate from Takifugu obscurus skin before and after debittering

暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前共檢測(cè)出16種物質(zhì)。酚類物質(zhì)最多，共檢出6種，占總物質(zhì)含量的46.29%，其中對(duì)乙酰氨基酚呈苦味，相對(duì)含量較高，為26.58%，這可能是導(dǎo)致暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液呈苦味的原因之一，2,4-二叔丁基苯酚則呈甜香味[43]，相對(duì)含量較少，為2.08%；酯類物質(zhì)檢出3種，占總物質(zhì)含量的30.58%，主要是鄰苯二甲酸二異丁酯，含量為24.34%，呈芳香氣味[44]；醇類物質(zhì)檢出2種，占總物質(zhì)含量的5.06%，主要有1-辛烯-3-醇，呈蘑菇、薰衣草香[45]，2,6,6,8-四甲基三環(huán)[5.3.1.0]十一烷-8-醇(柏木腦)，有膏香及木香氣味[46]；醛類物質(zhì)檢出2種，占總物質(zhì)含量的6.24%，主要是壬醛，呈油脂香[46]，4-庚烯醛，呈青草香味；烴類物質(zhì)檢出1種，主要是α-柏木烯，相對(duì)含量為0.52%；芳香族類物質(zhì)檢出1種，主要是間二甲苯，相對(duì)含量為2.40%，具有甜香、花香氣味；同時(shí)還檢測(cè)出了2-乙基呋喃，相對(duì)含量為8.92%，呈焦香香味、辛辣味[46]。1-辛烯-3-醇、4-庚烯醛和2-乙基呋喃只在脫苦前暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液中檢出，且三者閾值(見(jiàn)表4)都很低，可見(jiàn)其對(duì)脫苦前暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。

暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦后共檢測(cè)出24種物質(zhì)。酚類物質(zhì)最多，共檢出6種，占總物質(zhì)含量的21.98%，其中對(duì)乙酰氨基酚相對(duì)含量為4.36%，較脫苦前來(lái)說(shuō)呈顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明用活性炭和硅藻土對(duì)乙酰氨基酚的脫除效果顯著；酯類物質(zhì)檢出4種，占總物質(zhì)含量的46.59%，較脫苦前增加了16%，可見(jiàn)用活性炭和硅藻土對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦后酯類物質(zhì)含量會(huì)增加，且檢出了脫苦前未有的癸二酸二異丙酯，相對(duì)含量為7.37%；醇類物質(zhì)檢出6種，占總物質(zhì)含量的27.26%，主要有脫苦前酶解液未有的異辛醇(呈玫瑰味[47])、十二醇(呈花香味和脂肪味[48])、1-庚醇，呈脂味和酒香味[49]，可見(jiàn)暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液在脫苦后醇類物質(zhì)也會(huì)相應(yīng)增加；醛類物質(zhì)檢出1種，主要是壬醛，相對(duì)含量為1.05%；烴類物質(zhì)檢出3種，占總物質(zhì)含量的1.81%，主要有脫苦前未有的正十三烷，呈柑橘香[50]；芳香族類物質(zhì)檢出1種，主要是1,4-二甲苯，相對(duì)含量為0.45%，具有芳香氣味；酮類物質(zhì)檢出2種，占總物質(zhì)含量的0.62%，主要有2-莰酮(呈樟木氣味)、香葉基丙酮(呈木蘭香氣和花香[44])，可見(jiàn)暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液在脫苦后會(huì)檢出了酮類物質(zhì)；同時(shí)還檢測(cè)出2,6-二叔丁基苯醌，相對(duì)含量為0.23%。十二醇、香葉基丙酮和1,4-二甲苯只在脫苦后暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液中檢出，且三者閾值也較低，可見(jiàn)其對(duì)脫苦后暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。

3 結(jié)論

本研究對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)皮基本營(yíng)養(yǎng)成分和膠原蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，暗紋東方鲀魚(yú)皮粗蛋白含量為23.39%，粗脂肪含量為0.09%，且膠原蛋白含量占總蛋白含量的81.19%，說(shuō)明暗紋東方鲀魚(yú)皮是提取膠原蛋白肽的理想原料。采用掃描電鏡對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)皮內(nèi)外2層皮膚微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，暗紋東方鲀魚(yú)皮外層皮膚的刺排列規(guī)則；內(nèi)層皮膚則有褶皺，不平整?；趯?shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化的提取和脫苦工藝，用復(fù)合蛋白酶在酶添加量為2%，溫度53 ℃，時(shí)間1.5 h的條件下提取暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽，并用活性炭和硅藻土在添加量為6%，質(zhì)量比為1∶5，溫度65 ℃，時(shí)間20 min的條件下對(duì)其酶解液進(jìn)行吸附脫苦，以感官評(píng)價(jià)結(jié)合電子舌、氨基酸組成和GC-MS分析評(píng)價(jià)脫苦效果。結(jié)果表明，暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液經(jīng)活性炭和硅藻土脫苦后，苦味感官評(píng)分為3.3，低于脫苦前4.8(P<0.05)；脫苦后經(jīng)電子舌分析苦味響應(yīng)值為5.2，低于脫苦前苦味響應(yīng)值6.8(P<0.05)；脫苦后疏水性氨基酸含量為29.75%，低于脫苦前疏水性氨基酸含量33.63%(P<0.05)；脫苦后呈苦味的物質(zhì)對(duì)乙酰氨基酚相對(duì)含量為4.36%，低于脫苦前相對(duì)含量26.58%(P<0.05)。本研究對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽進(jìn)行脫苦后，將進(jìn)一步模擬體外胃腸消化對(duì)膠原蛋白肽的消化性能進(jìn)行研究探討。