兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中ABCB1 C3435T位點(diǎn)基因多態(tài)性對(duì)大劑量甲氨蝶呤血藥濃度及不良反應(yīng)的影響

孟 岑，徐 剛

0 引言

急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)是最常見(jiàn)的一種兒童惡性腫瘤,其死亡率在兒童惡性腫瘤中居首位，嚴(yán)重威脅著兒童的生命[1]。目前，ALL主要的治療方式為化學(xué)治療，其中甲氨蝶呤是關(guān)鍵藥物之一。在ALL的維持治療和髓外防治中，大劑量甲氨蝶呤(High-dose methotrexate,HD-MTX)的應(yīng)用對(duì)疾病的治療起到了非常重要的作用。

甲氨蝶呤是一種葉酸抑制劑，對(duì)二氫葉酸還原酶(Dihydrofolate reductase，DHFR)的親和性更高，可與二氫葉酸競(jìng)爭(zhēng)，使其無(wú)法還原成有活性的四氫葉酸，而四氫葉酸的缺乏會(huì)使DNA、RNA的合成過(guò)程受阻，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞快速增殖，導(dǎo)致其死亡。MTX進(jìn)入細(xì)胞主要通過(guò)溶質(zhì)載體(SLC) 19A1轉(zhuǎn)運(yùn)體(RFC1)介導(dǎo)，MTX進(jìn)入細(xì)胞后，經(jīng)過(guò)由多種代謝酶參與的復(fù)雜的代謝后，由ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP-binding cassete，ABC)泵出。包括ABCB1和ABCC1-4等8個(gè)亞家族，其中ABCB1又名多藥耐藥基因1(MDR1)，ABCB1基因的編碼產(chǎn)物是P-糖蛋白,能夠介導(dǎo)甲氨蝶呤的外向排出，阻礙藥物的吸收[2]。

MTX可引起多種不良反應(yīng)，如肝臟毒性、腎臟毒性、血液毒性及皮膚黏膜毒性等，其中肝臟毒性最為常見(jiàn)。在臨床應(yīng)用中，其療效與不良反應(yīng)存在個(gè)體差異，其機(jī)制尚不明確。有研究認(rèn)為，這種多樣性可能和參與藥物代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)的基因序列改變有關(guān)[3]。目前，研究者對(duì)MTX代謝酶相關(guān)的基因多態(tài)性與其化療不良反應(yīng)之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，但結(jié)論未能達(dá)成一致。

本文選取2015年8月至2019年6月于我院小兒血液內(nèi)科住院治療的ALL患兒為研究對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)患兒ABCB1基因多態(tài)性，并監(jiān)測(cè)其甲氨蝶呤治療后的不良反應(yīng)及血漿MTX濃度，探討兩者之間是否存在相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年8月至2019年6月于我院小兒血液內(nèi)科住院治療的ALL患兒132例，選取的患兒需完善骨髓穿刺并根據(jù)形態(tài)學(xué)(M)、免疫學(xué)(I)、細(xì)胞遺傳學(xué)(C)及細(xì)胞分子生物學(xué)(M)檢測(cè)并確診為ALL患者。按照《兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療規(guī)范(2018版)》的危險(xiǎn)度標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)。所有納入患兒通過(guò)前期化學(xué)治療后，骨髓完全緩解，化驗(yàn)血常規(guī)、肝功能、腎功能等指標(biāo)基本正常，均符合進(jìn)一步化療標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 化療方案 在給予所有納入研究患兒誘導(dǎo)緩解及早期強(qiáng)化治療后，予HD-MTX方案治療(低危組3 g/m2，中危組及高危組5 g/m2)，首先將MTX總量的1/6(≤500 mg)作為突擊量，在30 min內(nèi)快速靜脈滴注，余量于23.5 h內(nèi)泵，化療期間予水化和堿化治療，并對(duì)重要臟器進(jìn)行保護(hù)治療。在突擊量MTX滴入后0.5～2 h內(nèi)，給予1次化療藥物的鞘內(nèi)注射：低危組鞘內(nèi)注射二聯(lián)藥物(甲氨蝶呤、地塞米松)，中、高危組鞘內(nèi)注射三聯(lián)藥物(甲氨蝶呤、阿糖胞苷、地塞米松)。MTX滴注開(kāi)始后42 h，予亞葉酸鈣(CF)解救，劑量為每次15 mg/m2，每6 h解救1次，具體次數(shù)根據(jù)MTX血藥濃度變化動(dòng)態(tài)調(diào)整，直到MTX血藥濃度<0.1 μmol/L。

1.3 MTX血藥濃度測(cè)定 在HD-MTX化學(xué)治療開(kāi)始后的48 h，采集納入研究患兒的靜脈血2 ml，送至藥理實(shí)驗(yàn)室，利用均相酶免疫分析法(EMIA)，用快速血藥質(zhì)量濃度測(cè)定儀檢測(cè)MTX的血藥濃度。若48 h的MTX血藥濃度≥1 μmol/L，則可稱(chēng)為排泄延遲。

1.4 不良反應(yīng)評(píng)價(jià) 首次HD-MTX治療后7 d對(duì)不良反應(yīng)進(jìn)行統(tǒng)一評(píng)價(jià),觀察患兒是否出現(xiàn)骨髓抑制、肝腎功能損傷或其他不良反應(yīng)，并按照美國(guó)衛(wèi)生及公共服務(wù)部國(guó)立衛(wèi)生研究院國(guó)家癌癥研究所的不良事件常用術(shù)語(yǔ)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)(NCI-CTCAE V5.0),對(duì)化學(xué)治療所致不良反應(yīng)進(jìn)行分級(jí)。若不良反應(yīng)等級(jí)超過(guò)II級(jí)，則認(rèn)為該化學(xué)治療發(fā)生了不良反應(yīng)。

1.5 基因型測(cè)定 在HD-MTX治療前，用EDTA管采集外周靜脈血2 ml用于基因檢測(cè)。首先采用天根磁珠法血液基因組提取試劑盒提取DNA。設(shè)計(jì)特異性引物，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃鏈延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃補(bǔ)充延伸10 min。然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物鑒定：用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，與目的條帶大小一致，進(jìn)行Sanger測(cè)序。最后進(jìn)行測(cè)序結(jié)果分析：用Chromas軟件打開(kāi)，與指定基因的特定位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比得出結(jié)果。上述過(guò)程由北京智因東方醫(yī)學(xué)研究中心有限公司協(xié)助完成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本次研究應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理研究數(shù)據(jù)，選擇卡方檢驗(yàn)或Fisher′s精確概率法分析組間的差異，進(jìn)而比較ABCB1不同基因型患兒經(jīng)過(guò)HD-MTX化學(xué)治療后MTX血藥濃度的差異及發(fā)生不良反應(yīng)的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患兒一般資料 本研究共納入ALL患兒132例，其中男78例，女54例，初診時(shí)年齡為8周～16歲，中位年齡4歲，低危組患兒56例，中高危組患兒76例。野生型CC53例，雜合突變型CT25例，純合突變型TT54例。應(yīng)用Hardy-Weinberg對(duì)本研究所有納入研究對(duì)象的基因型分布進(jìn)行分析，提示本研究檢測(cè)的ABCB1基因各基因型頻率達(dá)到遺傳平衡(P>0.05)?；純旱囊话阗Y料見(jiàn)表1。

表1 患兒一般資料

2.2ABCB1基因多態(tài)性與48 h MTX血藥濃度的關(guān)系 見(jiàn)表2,結(jié)果顯示,突變型TT型48 h MTX血藥濃度更高，ABCB1基因多態(tài)性與HD-MTX化療開(kāi)始后48 h的MTX血藥濃度間有相關(guān)性(P<0.05)，說(shuō)明ABCB1基因多態(tài)性與ALL患兒HD-MTX化療中MTX排匯延遲有關(guān)。

表2 ABCB1 基因多態(tài)性與化療后48 h MTX血藥濃度之間的關(guān)系

2.3ABCB1基因多態(tài)性與HD-MTX化療不良反應(yīng)的關(guān)系 本研究中共出現(xiàn)了15例HD-MTX相關(guān)的不良反應(yīng)，其中白細(xì)胞減少7例，中性粒細(xì)胞減少1例，血紅蛋白降低2例，腎功能異常5例，沒(méi)有出現(xiàn)血小板減少及肝功能異常的病例。進(jìn)一步分析ABCB1各基因型與HD-MTX化療不良反應(yīng)之間的相關(guān)性(見(jiàn)表3)，結(jié)果顯示ABCB1各基因型患兒HD-MTX化療所致各項(xiàng)不良反應(yīng)例數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 ABCB1基因多態(tài)性與HD-MTX 化療不良反應(yīng)的關(guān)系

在急性淋巴細(xì)胞白血病的化學(xué)治療中，不同危險(xiǎn)度ALL的甲氨蝶呤使用劑量并不相同，低?；純喊凑? g/m2，中危及高?；純喊凑? g/m2。因此，本研究將納入患兒分成低危組和中、高危組，并分別研究?jī)山M與HD-MTX化療毒副作用的關(guān)系。低危組中，ABCB1各基因型CMTX>1.0 μmol/L例數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),低危組以及中、高危組中，ABCB1各基因各患兒應(yīng)用HD-MTX后各項(xiàng)不良反應(yīng)例數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4、表5。

表4 低危組中ABCB1基因多態(tài)性與HD-MTX不良反應(yīng)之間的關(guān)系

表5 中、高危組中ABCB1基因多態(tài)性與HD-MTX不良反應(yīng)之間的關(guān)系

3 討論

ALL是B淋巴細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞在骨髓內(nèi)異常增生導(dǎo)致的惡性腫瘤性疾病，病因與發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為該病與家族遺傳因素、環(huán)境因素(化學(xué)物質(zhì)輻射、電離輻射、核輻射)、染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常等有關(guān)，使骨髓內(nèi)的原始細(xì)胞異常增生，增生的細(xì)胞沒(méi)有正常的細(xì)胞功能，在骨髓中抑制骨髓正常的造血功能，并抑制正常的造血，從而出現(xiàn)貧血、出血、感染等一系列臨床癥狀[4]。ALL多起病急驟，發(fā)病迅速，因此在治療中格外注重快速有效。

臨床上兒童ALL主要借助化學(xué)治療，隨著醫(yī)療水平及診療技術(shù)的快速發(fā)展，其5年無(wú)事件生存率(Event-free survival，EFS)逐漸升高，現(xiàn)已達(dá)到90%以上[5]。MTX是臨床治療ALL的關(guān)鍵性藥物之一。

MTX的療效與藥物不良反應(yīng)在臨床治療中存在個(gè)體差異。不同患者在接受相同劑量的MTX治療時(shí)，表現(xiàn)出不同的不良反應(yīng)，目前認(rèn)為，這種臨床差異與藥物吸收、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)的基因序列改變有關(guān)[6]。

MTX通過(guò)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體家族從細(xì)胞中排出,其中ABCB1在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。ABCB1基因位于人類(lèi)第7號(hào)染色體長(zhǎng)臂(7q21.1)，編碼p-糖蛋白(P-gp)。P-gp廣泛分布在與分泌、排泄相關(guān)的組織及器官中，如腸道、肝腎等，在P-gp中包含ATP結(jié)合區(qū)，當(dāng)ATP與ATP結(jié)合區(qū)結(jié)合、水解時(shí)，則可產(chǎn)生能量，為MTX排出細(xì)胞的過(guò)程供能，從而減少有毒物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損害。

ABCB1C3435T位點(diǎn)的基因多態(tài)性是由于發(fā)生C/T堿基替代所導(dǎo)致的，該突變是同義突變，不會(huì)導(dǎo)致其編碼的氨基酸發(fā)生改變，但可能導(dǎo)致編碼的P-gp結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響到其功能，導(dǎo)致MTX排出延遲，使發(fā)生不良反應(yīng)的可能性增高[7-8]。

有研究表明,ABCB1C3435T位點(diǎn)的突變基因T等位基因影響ABCB1基因的表達(dá)、產(chǎn)物的功能以及代謝[9]。本研究分析了132例ALL患兒ABCB1C3435T位點(diǎn)基因型與HD-MTX化療后產(chǎn)生的不良反應(yīng)及MTX血藥濃度的關(guān)系，結(jié)果提示，ABCB1C3435T基因多態(tài)性與HD-MTX化療開(kāi)始后48 h的MTX血藥濃度之間有相關(guān)性，突變型TT型48 hMTX血藥濃度更高，這與朱影[10]等得出的結(jié)論一致。Ramírez-Pacheco等[11]等對(duì)墨西哥兒童進(jìn)行的研究也得到了相似結(jié)論，結(jié)果顯示，CC型患兒出現(xiàn)血漿中高M(jìn)TX濃度和白細(xì)胞減少的風(fēng)險(xiǎn)較低。但是劉思婷等[12]的研究未發(fā)現(xiàn)ABCB1基因多態(tài)性與MTX排泄延遲具有相關(guān)性。王淑梅等[13]的研究也未發(fā)現(xiàn)兩者間有相關(guān)性。在本研究中，雜合突變型CT型相比于純合野生型CC型48 hMTX血藥濃度更低，考慮到本研究中雜合突變型CT型只有25例，顯著少于另外兩種基因里，樣本量少可能干擾研究結(jié)果。

另外在ALL的治療中，不同危險(xiǎn)度分級(jí)的患者應(yīng)用MTX的劑量不同，本研究進(jìn)一步分析了不同危險(xiǎn)度中ABCB1C3435T位點(diǎn)基因型與化療后MTX血藥濃度的關(guān)系，得到在低危組中兩者之間有相關(guān)性，而中、高危組中兩者間未見(jiàn)相關(guān)性。這可能由于中、高危ALL患兒應(yīng)用MTX的劑量大，化療后MTX血藥濃度高，產(chǎn)生的藥物毒性大，而ABCB1C3435T位點(diǎn)基因多態(tài)性對(duì)藥物代謝的影響力有限，使其與MTX排出延遲的相關(guān)性小。

在有關(guān)HD-MTX化療后產(chǎn)生的不良反應(yīng)如骨髓抑制、腎功能異常等方面，本研究發(fā)現(xiàn)ABCB1各基因型之間例數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Lopez-Lopez[14]等對(duì)西班牙的ALL兒童進(jìn)行研究得到相似結(jié)論，認(rèn)為ABCB1基因多態(tài)性與各種不良反應(yīng)及血漿藥物濃度無(wú)明顯相關(guān)性。但是一項(xiàng)對(duì)黎巴嫩患者的研究[15]得到的結(jié)論是中性粒細(xì)胞減少與ABCB1基因多態(tài)性之間存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。Gregers[16]等也認(rèn)為該基因突變與MTX在兒童ALL治療中的療效和毒性之間存在相關(guān)性。Samara等[17]的研究認(rèn)為肝臟損害與ABCB1基因多態(tài)性之間顯著相關(guān)。本研究中未發(fā)現(xiàn)肝功能異常病例，出現(xiàn)其他不良反應(yīng)病例同樣較少，這可能導(dǎo)致本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果不一致。隨著治療水平的日益提高，藥物治療越來(lái)越個(gè)體化、安全化、及時(shí)化，在化學(xué)治療的同時(shí)，會(huì)給予充足的水化堿化加速M(fèi)TX代謝及排出[18]，給予保肝、止吐等藥物支持治療，這可能是導(dǎo)致不良反應(yīng)較少的原因，此外，本研究樣本量小，也可能影響研究結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究認(rèn)為，ABCB1C3435T位點(diǎn)基因多態(tài)性與兒童ALL HD-MTX化學(xué)治療后的MTX血藥濃度之間具有相關(guān)性，而與HD-MTX化療所產(chǎn)生的各種不良反應(yīng)不相關(guān)。本研究的不良反應(yīng)例數(shù)較少，這可能與化療的同時(shí)應(yīng)用水化堿化、保肝、止吐等輔助治療有關(guān)，此外，聯(lián)合其他化療藥物等其他因素都有可能造成干擾，可以通過(guò)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步分析其他MTX代謝相關(guān)酶的基因多態(tài)性聯(lián)合作用等因素，為臨床個(gè)體化治療提供更為可靠的依據(jù)。