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    左歸丸對腎病綜合征模型大鼠NF-κB和TNF-α表達的影響

    2021-03-01 07:57:08嘉,李
    實用藥物與臨床 2021年1期
    關(guān)鍵詞:左歸丸空白對照腎小球

    李 嘉,李 想

    0 引言

    腎病綜合征是由于腎小球毛細血管壁結(jié)構(gòu)被破壞使濾過膜失去屏障作用而發(fā)生蛋白尿[1]、低蛋白血癥[2]及高脂血癥[3]的一組臨床綜合征。左歸丸出自《景岳全書》第五十一卷,由熟地、山藥、枸杞、山茱萸等八味滋陰中藥組成,具有壯水之主,培左腎陰之功效。主治真陰腎水不足,漸至衰弱,津液枯涸之證。本方臨床主要用于老年慢性支氣管炎、高血壓病、慢性腎炎等癥[4]。本研究觀察左歸丸對阿霉素誘發(fā)大鼠腎病綜合征的影響,現(xiàn)報道如下。

    1 材料與試劑

    1.1 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠85只,體重200~240 g,由遼寧長生生物有限公司提供,實驗動物合格證號:SCXK(遼)2015-0001。

    1.2 受試藥物及試劑 左歸丸,仲景宛西制藥股份有限公司,批號:190805。醋酸潑尼松,鄭州韓都藥業(yè)集團有限公司,批號:1906052。三酰甘油(TG)測定試劑盒、總膽固醇(TC)測試盒均購于南京建成生物工程研究所。PBS磷酸緩沖鹽,批號:20190327,北京Solarbio科技有限公司。伊紅染色液,批號:718123,蘇木素染色液,批號:718112,購于珠海貝索生物技術(shù)有限公司。DAB試劑盒,北京Solarbio科技有限公司。內(nèi)源性過氧化物酶的阻斷劑,批號:190625391h。生物素標記羊抗大鼠/兔IgG,批號:1906215396b。鏈霉素抗生物素蛋白—過氧化物酶,批號:1906215395c。檸檬酸緩沖鹽,批號:19032604。福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。二甲苯,批號:20190801。無水乙醇,批號:20191017,沈陽市新華試劑廠。腫瘤壞死因子-α(TNF -α)抗體,批號:08012887。兔抗鼠κ基因結(jié)合核因子-P65(NF-κB P65)抗體,批號:AE073025,購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

    1.3 儀器 AU5800全自動生化分析儀,貝克曼庫爾特公司。RM2 245切片機,德國(徠卡)生產(chǎn)。BX53光學顯微鏡,奧林巴斯(中國)有限公司。YG-280KX烤片機,陽光神琦醫(yī)用科技有限公司。YG-280KX攤長機,陽光神琦醫(yī)用科技有限公司。DNM-9602G酶標分析儀,北京普朗新技術(shù)有限公司。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 實驗方法[5]取體重200~240 g雄性Wistar大鼠85只,按體重隨機分為6組,分別為空白對照組(10只),模型對照組,左歸丸低劑量組(1.62 g/kg),左歸丸中劑量組(3.24 g/kg),左歸丸高劑量組(6.48 g/kg),醋酸潑尼松組(6.45 mg/kg),每組15只。除空白對照組外,其余各組分別尾靜脈注射阿霉素6.5 mg/kg。將阿霉素用生理鹽水溶解,濃度為2 mg/ml。各組灌胃給藥體積為10 ml/kg,空白對照組、模型對照組灌胃等體積的蒸餾水,連續(xù)給藥12周。實驗結(jié)束時收集24 h尿液,檢測尿蛋白。末次給藥1 h后,乙醚麻醉大鼠,腹主動脈取血,檢測各組大鼠血清總TG、TC、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)。采血后取腎臟,置于4%多聚甲酸溶液中固定24 h。采用HE染色檢查腎臟病理變化,采用免疫組化技術(shù)檢測各組大鼠腎臟NF-κB p65 及TNF-α的表達水平。免疫組化結(jié)果采用Image J軟件進行灰度值分析。

    2.3 實驗結(jié)果

    2.3.1 左歸丸對腎病綜合征模型腎功能的影響 由表1可見,模型對照組24 h尿蛋白水平高于空白對照組(P<0.01);左歸丸低劑量組、中劑量組、高劑量組和醋酸潑尼松組24 h尿蛋白水平低于模型對照組(P<0.01)。模型對照組血清BUN水平高于空白對照組(P<0.01);醋酸潑尼松組血清BUN水平低于模型對照組(P<0.05)。模型對照組Scr水平高于空白對照組(P<0.01);左歸丸中劑量組、高劑量組和醋酸潑尼松組血肌酐低于模型對照組(P<0.05或P<0.01)。

    表1 左歸丸對腎病綜合征模型大鼠腎功能的影響

    2.3.2 左歸丸對腎病綜合征模型血脂的影響 由表2可見,模型對照組TC、TG略高于空白對照組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型對照組相比,左歸丸低劑量組、中劑量組、高劑量組和醋酸潑尼松組血清TC和TG略有降低趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

    表2 左歸丸對腎病綜合征模型大鼠TC和TG的影響

    2.3.3 左歸丸對腎病綜合征模型大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響 HE結(jié)果顯示,空白對照組大鼠的腎小球結(jié)構(gòu)清晰,形態(tài)規(guī)則,細胞核圓整。與空白對照組相比,模型對照組大鼠的腎組織染色不均,腎間質(zhì)有炎性細胞浸潤,基膜和系膜增生、腎小管排列紊亂、腎小球肥大。與模型組相比,左歸丸各治療組和醋酸潑尼松組的腎組織病變明顯減輕,HE染色均勻,腎間質(zhì)炎性細胞浸潤減輕,基膜和系膜增生較模型對照組緩解,見圖1。

    圖1 左歸丸對腎病綜合征模型大鼠腎組織的影響(400×)注:A.空白對照組;B.模型對照組;C.左歸丸低劑量組;D.左歸丸中劑量組;E.左歸丸高劑量組;F.醋酸潑尼松組

    2.3.4 左歸丸對腎病綜合征模型大鼠腎組織NF-κB P65和TNF-α表達的影響 由表3可見,模型對照組NF-κB P65表達高于空白對照組(P<0.01)。左歸丸高劑量組和醋酸潑尼松組NF-κB P65表達低于模型對照組(P<0.05)。模型對照組TNF-α表達高于空白對照組(P<0.01)。與模型對照組相比,左歸丸低劑量組、中劑量組、高劑量組和醋酸潑尼松組TNF-α表達顯著降低(P<0.05),見圖2、圖3。

    表3 各組大鼠NF-κB P65和TNF-α表達水平比較

    圖2 左歸丸對腎病綜合征模型大鼠腎組織NF-κB P65表達(400×)注:A.空白對照組;B.模型對照組;C.左歸丸低劑量組;D.左歸丸中劑量組;E.左歸丸高劑量組;F.醋酸潑尼松組

    圖3 左歸丸對腎病綜合征模型大鼠腎組織TNF-α表達(400×)注:A.空白對照組;B.模型對照組;C.左歸丸低劑量組;D.左歸丸中劑量組;E.左歸丸高劑量組;F.醋酸潑尼松組

    3 討論

    大量蛋白尿是腎病綜合征患者最主要的臨床表現(xiàn),也是腎病綜合征的最基本的病理機制[6]。正常腎小球濾過膜具有電荷屏障[4]和分子屏障[7],腎小球毛細血管壁結(jié)構(gòu)破壞導致蛋白尿[8]。本研究中左歸丸低劑量組、中劑量組、高劑量組24 h尿蛋白較模型對照組顯著降低,說明左歸丸對阿霉素引起的腎小球毛細血管損傷具有保護作用,能夠降低阿霉素腎病綜合征大鼠模型24 h尿蛋白含量。血尿素氮是血漿中蛋白質(zhì)代謝的終末產(chǎn)物,由腎小球濾過而排出體外,腎功能不全時,血尿素氮將升高[9]。當腎小球濾過率下降至正常的50%以下時,血尿素氮的濃度迅速升高[10]。間質(zhì)性腎炎、腎小球腎炎和急慢性腎功能衰竭均可使血尿素氮增高。本研究中左歸丸低劑量組、中劑量組、高劑量組血清尿素氮較模型對照組雖有所降低,但未見顯著性差異,可能與血尿素氮是血漿中蛋白質(zhì)代謝的終末產(chǎn)物有關(guān)。正常情況下血肌酐從腎小球濾出,可用作腎小球濾過功能的診斷指標[11]。當腎小球濾過功能減低時,血肌酐因潴留而增高[12]。本研究中左歸丸中劑量組、高劑量組的血肌酐較模型對照組顯著降低,說明左歸丸可增強腎病綜合征模型大鼠腎小球的濾出功能。腎病綜合征引起高膽固醇和高三酰甘油血癥濃度增加的原因目前尚未完全闡明,可能是由于肝臟合成脂蛋白增加,但是在周圍循環(huán)中分解代謝障礙所致。本研究中左歸丸低劑量組、中劑量組、高劑量組的血清TC和TG較模型對照組雖略有降低,但差異無統(tǒng)計學意義,說明左歸丸對腎病綜合征模型的脂代謝僅有較弱的干預作用。

    阿霉素腎病綜合征模型為目前公認的能夠較好模擬人類腎病的模型,其表現(xiàn)非常接近臨床的人類腎病綜合征,其細胞模型能夠較好地模擬腎小球足細胞的基本功能,因此廣泛應(yīng)用于腎病的病理機制研究[13]。有研究表明,單劑量注射5 mg/kg以上阿霉素可引起大鼠出現(xiàn)嚴重而持續(xù)的蛋白尿,導致局灶性節(jié)段式的腎小球硬化,并伴有腎小管間質(zhì)纖維化以及炎性浸潤[14],造成中等程度的腎功能不全。本研究中,與模型組相比,左歸丸各治療組的腎組織病變明顯緩解,基膜和系膜增生、腎間質(zhì)炎性細胞浸潤均有所減輕,說明左歸丸對阿霉素引起的腎組織損傷具有一定的治療作用。

    腎小球毛細血管濾過膜的損傷和腎小球內(nèi)壓及血流量密切相關(guān),腎小球內(nèi)毛細血管壓力增加,入球小動脈血漿流量下降和膜兩側(cè)靜水壓代償性增高,此時單個腎小球濾過分數(shù)增高,出球端的蛋白濃度高于正常,使血漿蛋白經(jīng)腎小球毛細血管壁的彌散增加[15]。熟地、山萸肉、牛膝有降血壓作用,可改善微循環(huán)[16]。腎病綜合征還存在高凝狀態(tài),山萸肉、牛膝能降低紅細胞聚集指數(shù),降低全血黏度,抑制血小板聚集抗血栓形成[17]。參與免疫反應(yīng)的早期和炎癥反應(yīng)各階段的許多分子都受NF-κB的調(diào)控,包括:TNF-α、IL-6、iNOS、COX2和趨化因子等[18]。有研究表明,左歸丸顯著降低去卵巢大鼠血清TNF-α水平,左歸丸中熟地、山萸肉、杜仲、龜板膠可防止連續(xù)服用地塞米松后腎上腺皮質(zhì)萎縮,能有效保護腎上腺皮質(zhì)功能[19]。本研究中左歸丸高劑量組腎組織NF-κB P65表達較模型對照組顯著降低,左歸丸低劑量組、中劑量組、高劑量組腎組織TNF-α表達較模型對照組顯著降低,表明左歸丸可能通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路產(chǎn)生減輕阿霉素引起腎組織損傷的作用。

    綜上所述,本研究結(jié)果表明,左歸丸對阿霉素引起的大鼠腎病綜合征模型具有治療作用,該作用可能與其對NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。

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