辣蓼黃酮對(duì)小鼠免疫功能調(diào)節(jié)作用的研究

謝映紅，李 璐，肖 琦，于美玲，胡庭俊

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005）

辣蓼是蓼科蓼屬一年生草本植物，味辛、溫，具有祛風(fēng)利濕、散瘀止痛、解毒消腫等功效[1]。辣蓼的主要成分有黃酮類、揮發(fā)油、鞣質(zhì)類、脂肪酸、三萜類、糖苷、蓼酸等。黃酮類化合物是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，普遍存在于天然植物的根莖葉及花果中，具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤、抗心血管病、抗炎癥等藥理作用[2-4]。但關(guān)于辣蓼黃酮在免疫藥理方面的研究報(bào)道較少。環(huán)磷酰胺（CTX）是臨床上常用的細(xì)胞毒性化療藥物，其在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，可損傷機(jī)體的免疫器官，抑制機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，造成免疫功能的低下[5]。本試驗(yàn)選用環(huán)磷酰胺作為抑制劑建立小鼠免疫抑制模型，旨在研究辣蓼黃酮正丁醇部分（FNB）對(duì)小鼠的免疫功能的調(diào)節(jié)作用，為辣蓼黃酮的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物

辣蓼黃酮正丁醇部分（FNB），F(xiàn)NB中黃酮含量為52.84%，由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提取。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)選用SPF清潔級(jí)別健康的5～6周齡昆明小鼠60只，雌、雄各半，體重18～22 g，生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK桂2014-0002，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 試驗(yàn)飼料

SPF飼料由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的小鼠全價(jià)飼料。

1.1.4 試驗(yàn)試劑

結(jié)晶紫溶液（天津富宇精細(xì)化工）、苦味酸（斯百全化學(xué)有限公司，貨號(hào)：P1691）、中性樹膠（上海國藥集團(tuán)，批號(hào)：20150730）、瑞士-姬姆薩染液（貝索Baso）、甲醛（成都市科龍化工試劑廠）、注射用環(huán)磷酰胺（安道生，0.2g/瓶/盒，批號(hào)：5K087A）、氯化鈉（貴州天地藥業(yè)公司，批號(hào)：H20033973）、無水乙醇（天津富宇精細(xì)化工有限公司）。小鼠溶菌酶試劑盒、小鼠黃嘌呤氧化酶試劑盒、小鼠髓過氧化物酶試劑盒、小鼠一氧化氮合酶試劑盒、小鼠一氧化氮試劑盒、小鼠微量還原型谷胱甘肽試劑盒均購自南京建成研究所；小鼠γ干擾素試劑盒、小鼠免疫球蛋白試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素12試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素2試劑盒均購自江蘇晶美生物公司。

1.1.5 試驗(yàn)儀器

電子分析天平（METTLER TOLEDO，AB104-L，EL204瑞士）、超純水機(jī)（Direct-Q，5UV型，密理博）、去離子水機(jī)（CD-UPT-1，成都純?cè)剑?、電熱恒溫水浴鍋（HH-W21型，北京長(zhǎng)源設(shè)備廠）、高速離心機(jī)（Eppendorf，Centrifuge 5418）、超低溫冰箱（-80 ℃）（SANYO，MDF-U5386S）、超速低溫離心機(jī)（SIGMA，3K15）、全自動(dòng)切片機(jī)（德國，徠卡）、多功能酶標(biāo)儀（瑞士）、紫外分光光度儀（型號(hào)：Uvmini1240，日本，島津）、光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯，日本株式會(huì)社）、微量離心機(jī)（Sigma，1-14型，美國）、電熱恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱（天津泰斯特，WP25）、通風(fēng)柜（型號(hào)：HDR-B07，科藝）、超凈工作臺(tái)（安泰空氣技術(shù)有限公司，SWCJ-2F）、高壓滅菌器（致微（廈門）儀器有限公司，GI36D）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物試驗(yàn)

將SPF清潔級(jí)別60只昆明種小鼠隨機(jī)分成6組，每組10只，雌、雄各半，分籠飼養(yǎng)，每籠5只。小鼠正常飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行正式試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組、最低劑量組（CTX+25 mg/kg FNB）、低劑量組（CTX+50 mg/kg FNB）、中劑量組（CTX+100 mg/kg FNB）、高劑量組（CTX+150 mg/kg FNB），連續(xù)給藥7 d。各組小鼠處理方式見表1。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.2.1 臨床表現(xiàn)

每天定時(shí)觀察并記錄小鼠的臨床表現(xiàn)及活動(dòng)情況，包括飲水、采食、精神狀況、被毛狀況、健康狀況及日?；顒?dòng)。觀察小鼠是否出現(xiàn)與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)，記錄小鼠不良反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間、程度、持續(xù)時(shí)間。

表1 各組小鼠處理方式Tab.1 Treatments of mice

1.2.2.2 血液生化指標(biāo)及炎性因子水平

給藥7 d后，最后一次給藥后1 h，剖殺小鼠，對(duì)小鼠進(jìn)行眼球采血，各組分別用1.5 mL EP管裝取小鼠眼眶所采集的血液，所采的血液不加抗凝劑，血液樣品于常溫下傾斜靜置2 h，取上層血清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書分別測(cè)定白細(xì)胞介素2（IL-2）、白細(xì)胞介素12（IL-12）、免疫球蛋白（IgG）、γ干擾素（IFN-γ）、溶菌酶（LZM）、黃嘌呤氧化酶（XOD）、髓過氧化物酶（MPO）、一氧化氮合酶試劑盒（NOS)、一氧化氮（NO）、微量還原型谷胱甘肽（GSH）的含量。

1.2.2.3 臟器指數(shù)

采血后所有試驗(yàn)小鼠頸椎脫臼處死，迅速解剖，采取脾臟和胸腺稱重，以小鼠臟器質(zhì)量（mg）/體重（g）計(jì)算脾臟、胸腺的臟器指數(shù)。將脾臟和胸腺浸泡在福爾馬林固定液中固定7 d，制作組織切片，觀察胸腺和脾臟的組織學(xué)是否發(fā)生變化。

1.2.3 病理組織學(xué)檢查

給藥7 d后采血處死的小鼠，取脾臟和胸腺分別制作病理組織切片。通過固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、修片與切片、展片與貼片、蘇木素伊紅（HE）染色、封片等步驟進(jìn)行制作切片。觀察組織切片的組織形態(tài)是否發(fā)生變化，并且將病理變化攝成圖片。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單因素方差分析檢驗(yàn)其組間差異顯著性，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床表現(xiàn)

試驗(yàn)期間，陽性對(duì)照組（即注射環(huán)磷酰胺的試驗(yàn)組）小鼠精神狀態(tài)較差、食欲減退、被毛粗亂，有部分小鼠出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，個(gè)體較消瘦。空白對(duì)照組和添加不同劑量的FNB試驗(yàn)組飲食正常，精神狀態(tài)良好，組間體重差異不明顯。

2.2 FNB對(duì)免疫抑制小鼠臟器指數(shù)的影響（見表2）

表2 FNB對(duì)免疫抑制小鼠臟器指數(shù)的影響Tab.2 Effect of FNB on organ indices of immune suppressed mice (n=10) 單位 ：mg/g

由表2可知，與空白對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組各種臟器指數(shù)極顯著降低（P＜0.01），表明成功建立免疫抑制的小鼠模型；與陽性對(duì)照組比較，不同劑量的FNB試驗(yàn)組小鼠脾臟和胸腺指數(shù)有升高的變化。

2.3 FNB對(duì)免疫抑制小鼠細(xì)胞因子的影響（見表3）

由表3可知，與空白對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組血清中IL-2、IL-12、IgG、INF-γ、LZM水平均明顯降低，（P＜0.05），表明成功建立免疫抑制小鼠模型；與陽性對(duì)照組比較，不同劑量的FNB組中IL-12和IgG的水平顯著升高（P＜0.05），其中在FNB中劑量組時(shí)LZM活性極顯著升高（P＜0.01）。試驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度的FNB能夠通過升高免疫抑制小鼠中的細(xì)胞因子水平而改善其免疫功能。

表3 FNB對(duì)免疫抑制小鼠細(xì)胞因子的影響Tab.3 Effect of FNB on cytokines in immunosuppressed mice（n=10） 單位 ：ng/L

2.4 FNB對(duì)免疫抑制小鼠生化指標(biāo)的影響（見表4）

由表4可知，與空白對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組血清中的XOD、MPO、NOS、NO、GSH活力均顯著降低（P＜0.05）；各劑量FNB組中小鼠血清中的XOD、MPO、NOS、NO對(duì)比陽性組顯著升高（P＜0.05），當(dāng)FNB劑量達(dá)到150 mg/kg時(shí)，各指標(biāo)水平均有下降的趨勢(shì)。結(jié)果表明，一定濃度的FNB能提高免疫抑制小鼠血清中MPO、NOS、NO等生化指標(biāo)的活力，有利于維持機(jī)體自由基的產(chǎn)生和清除平衡，降低免疫抑制帶來的影響，從而改善其免疫功能。

表4 FNB對(duì)免疫抑制小鼠生化指標(biāo)的影響Tab.4 The effect of FNB on the biochemical indexes of immunosuppressed mice（n=10） 單位 ：ng/L

2.5 小鼠脾臟和胸腺的病理組織學(xué)變化（見圖1、圖2）

由圖1可知，空白對(duì)照組小鼠脾臟的脾小體結(jié)構(gòu)完整、脾淋巴細(xì)胞密集、細(xì)胞輪廓清晰。環(huán)磷酰胺對(duì)照組小鼠脾臟脾小體數(shù)量顯著減少、淋巴細(xì)胞稀疏、紅髓區(qū)內(nèi)有數(shù)量不等的嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；不同濃度FNB組小鼠的脾小體尚可辨認(rèn)，體積縮小，但淋巴細(xì)胞輪廓較清晰，局部見淋巴濾樣增生。

由圖2可知，空白對(duì)照組胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰可辨，皮質(zhì)區(qū)內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量密集。環(huán)磷酰胺對(duì)照組和不同濃度FNB組小鼠胸腺皮質(zhì)結(jié)構(gòu)模糊，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，但環(huán)磷酰胺組胸腺組織內(nèi)淋巴細(xì)胞明顯稀疏，不同濃度FNB組小鼠胸腺內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量較多，呈小結(jié)樣增生。

3 討論

本試驗(yàn)采用環(huán)磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型，試驗(yàn)觀察FNB對(duì)小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺處理后，臨床表現(xiàn)個(gè)體消瘦、被毛粗亂、精神不佳；組織切片顯示脾臟脾小體數(shù)量顯著減少、胸腺皮質(zhì)結(jié)構(gòu)模糊；胸腺、脾臟指數(shù)低于空白對(duì)照組；同時(shí)環(huán)磷酰胺處理組小鼠血清中IL-2、IL-12、IgG、INF-γ的顯著下降，表明免疫抑制小鼠模型建立成功。

免疫調(diào)節(jié)可維持機(jī)體生理平衡與相對(duì)穩(wěn)定，在預(yù)防感染、免疫監(jiān)視中發(fā)揮著重要的作用。脾臟是機(jī)體重要的外周免疫器官，是成熟淋巴細(xì)胞定居場(chǎng)所，胸腺是T細(xì)胞發(fā)育成熟的重要場(chǎng)所，與細(xì)胞免疫和體液免疫密切相關(guān)[6]。李振卿[7]對(duì)地衣多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能進(jìn)行研究，結(jié)果表明，地衣多糖能夠明顯提高免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)，顯著提高免疫抑制小鼠的免疫功能。在本試驗(yàn)中，與環(huán)磷酰胺處理組比較，不同劑量的FNB組中IL-12、LZM、IgG的水平顯著升高，其中IL-12可以有效激活NK 細(xì)胞，通過增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性達(dá)到消除機(jī)體病原體和殺傷腫瘤細(xì)胞的目的，同時(shí)IL-12是T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)因子，輔助T淋巴細(xì)胞增殖參與細(xì)胞免疫應(yīng)答[8]。有研究表明，LZM通過破壞微生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及抑制細(xì)胞膜內(nèi)活性，從而致使機(jī)體內(nèi)病原體裂解死亡[9]。此外，IgG也在自然被動(dòng)免疫中起著至關(guān)重要的作用，IgG水平顯著升高從側(cè)面反映機(jī)體抵抗病原體的能力增強(qiáng)。因此，本試驗(yàn)結(jié)果說明一定濃度的FNB能夠通過升高免疫抑制小鼠中的細(xì)胞因子水平而改善其免疫功能。

MPO可以使過氧化氫和氯離子反應(yīng)生成次氯酸，次氯酸會(huì)氧化細(xì)胞成分，對(duì)病原微生物有殺滅作用，但當(dāng)生成過量次氯酸，超過機(jī)體抗氧化防御能力時(shí)，反而會(huì)導(dǎo)致組織損傷[10]。胡小艷等[11]在金絲桃素對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能和抗氧化能力的研究中發(fā)現(xiàn)，由環(huán)磷酰胺所致的免疫抑制小鼠MPO活性顯著下降，但金絲桃素對(duì)MPO活性無顯著影響。本研究中，免疫抑制小鼠血清中MPO活性也同樣顯著下降，但FNB處理后發(fā)現(xiàn)小鼠血清MPO活性增強(qiáng)，說明FNB可以調(diào)節(jié)MPO活性，降低機(jī)體免疫抑制帶來的影響。NOS有3種亞型，分別是神經(jīng)元型（nNOS）、誘導(dǎo)型（iNOS）、內(nèi)皮型（eNOS），對(duì)機(jī)體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)、血管、平滑肌等發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能，NO是在NOS的催化作用下產(chǎn)生[12]。NO作為一種自由基，具有病理與生理的雙向調(diào)節(jié)作用，過量的NO會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用從而使機(jī)體正常細(xì)胞受損；體內(nèi)適量的NO有利于維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮著免疫防御的作用[13-14]。因此，機(jī)體內(nèi)的NOS活力和NO水平均需要維持在某種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。在本試驗(yàn)中，免疫抑制組小鼠的NOS活力和NO水平均顯著降低，對(duì)其給予各劑量的FNB后發(fā)現(xiàn)小鼠NOS活力和NO水平顯著升高。朱丹等[15]在金黃扶正茶對(duì)免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫功能的研究中，免疫抑制組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NOS活力顯著降低，藥物組顯著上升。在對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的研究中也呈現(xiàn)出相似結(jié)果。李義等[16]對(duì)竹筍多糖對(duì)免疫抑制中華絨螯蟹的免疫調(diào)節(jié)研究中發(fā)現(xiàn)，免疫抑制組中華絨螯蟹血清中NOS活性顯著下降，給予竹筍多糖后NOS活性上調(diào)，這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。提示FNB可以使免疫抑制小鼠血清中失調(diào)的NOS、NO靠近正常水平，促使其恢復(fù)正常生理活性，從而提高免疫功能，但其中的具體調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

徐璐等[17]對(duì)黃芪總黃酮對(duì)小鼠免疫功能進(jìn)行研究，結(jié)果表明，黃芪總黃酮能顯著增強(qiáng)小鼠的免疫功能。劉愛華等[18]對(duì)木瓜總黃酮抗腫瘤活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，木瓜總黃酮可以促進(jìn)機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答，最終達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)，提高腫瘤鼠存活率的作用。皮建輝等[19]對(duì)金銀花黃酮對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明，金銀花黃酮能顯著提高免疫抑制小鼠的臟器指數(shù)，金銀花黃酮能顯著調(diào)節(jié)小鼠血清免疫酶活性，提高淋巴器官的抗氧化功能，表明其具有良好的免疫調(diào)節(jié)功能。本研究結(jié)果表明，辣寥黃酮對(duì)環(huán)磷酰胺引起的小鼠免疫功能抑制有拮抗作用，可以增強(qiáng)小鼠的免疫功能。

4 結(jié)論

辣寥黃酮不僅可以通過升高機(jī)體細(xì)胞因子水平來對(duì)抗環(huán)磷酰胺引起的小鼠免疫功能抑制，還可以通過調(diào)節(jié)NO水平和MPO、NOS等活性來降低免疫抑制帶來的影響，從而增強(qiáng)小鼠免疫功能。