恒溫?zé)晒夥焖僭噭┖袡z測南美白對蝦六種流行病病原要點

文/葉紅梅 李慧

天津市水產(chǎn)技術(shù)推廣站在2017年～2019年3年間使用恒溫?zé)晒夥焖僭噭┖?，對本市養(yǎng)殖南美白對蝦9個區(qū)的養(yǎng)殖企業(yè)及養(yǎng)殖戶送檢與抽檢的種蝦、蝦苗、養(yǎng)殖過程中不同階段的蝦，進行了6種流行病病原指標(biāo)檢測。恒溫?zé)晒夥?zhǔn)確率高，可有效縮短檢測時間，在病害防治中能起到關(guān)鍵作用，有效推動當(dāng)?shù)厮a(chǎn)養(yǎng)殖綠色健康發(fā)展。

近年來，南美白對蝦養(yǎng)殖已成為天津市水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)，但由于蝦苗質(zhì)量參差不齊、養(yǎng)殖密度高、飼料品質(zhì)低及投喂不當(dāng)?shù)纫蛩?，造成對蝦養(yǎng)殖病害不斷發(fā)生，給企業(yè)及養(yǎng)殖戶造成不小的損失。在整個養(yǎng)殖周期中，買到優(yōu)質(zhì)健康的蝦苗、保持穩(wěn)定的水環(huán)境及蝦病防控已成為南美白對蝦健康養(yǎng)殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

針對當(dāng)?shù)啬厦腊讓ξr養(yǎng)殖中常見發(fā)病情況，確定出流行病原監(jiān)測指標(biāo)6項，其中病毒指標(biāo)4項：對蝦白斑綜合征（White spot syndrome virus，WSSV）、傳染性皮下及造血組織壞死?。↖nfectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）、對蝦偷死?。–overt mortality nodavirus，CMNV）和蝦血細(xì)胞虹彩病毒?。⊿hrimp hemocyte iridescent virus，SHIN）（2019年新增檢測指標(biāo)）；細(xì)菌類指標(biāo)1項：急性肝胰腺壞死?。╝cute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）/早期死亡綜合征（EMS）；寄生蟲類指標(biāo)1項：蝦肝腸胞蟲病（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）。

一、快速試劑盒法（恒溫?zé)晒夥ǎ?/h2>

筆者單位對南美白對蝦六種流行病原指標(biāo)檢測采用了快速試劑盒法?？焖僭噭┖蟹ǎê銣?zé)晒夥ǎ┎≡瓩z測包括核酸提取和檢測，提取和檢測分別按照試劑盒說明書進行。采用試劑盒為廣州迪澳生物科技有限公司生產(chǎn)，用水產(chǎn)動物病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取的核酸可用于上述4種病毒檢測，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取的核酸可用于細(xì)菌AHPND/EMS和寄生蟲EHP檢測。

（一）試劑盒保存條件及保質(zhì)期

1.提取試劑盒

水生動物病毒基因組D N A/R N A 提取試劑盒組份可在室溫下（15℃～25℃）干燥保存12個月，長期保存時要置于2℃～8℃的環(huán)境中。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒中蛋白酶K（Proteinase k）干粉和溶菌酶（Lysozyme）干粉需要保存在-20℃的環(huán)境中，其余試劑可在室溫下（15℃～25℃）干燥保存12個月，長期保存時應(yīng)置于2℃～8℃的環(huán)境中。

2.檢測試劑盒

恒溫?zé)晒夥ê怂釞z測試劑盒保存溫度在-18℃～-25℃，有條件的可-80℃低溫保存，有效期為12個月。

（二）檢測樣品的制備

核酸檢測試劑盒法（恒溫?zé)晒夥ǎz測要全程在衛(wèi)生潔凈的環(huán)境中進行，實驗需要使用的工具如剪刀、鑷子、紗布、生理鹽水等要經(jīng)過滅菌處理，槍頭、離心管要無菌成品。實驗時實驗人員全程穿工作服，戴一次性手套。實驗過程應(yīng)在生物安全柜中進行，沒有生物安全柜的可劃定專門區(qū)域，保證該區(qū)域干凈整潔無污染。實驗產(chǎn)生的所有廢棄物需進行無害化處理。

1.鮮活的蝦樣：將從池塘中打撈的蝦放入干凈的塑料袋中或塑料瓶中，放入一定的養(yǎng)殖水，有條件的可以在袋內(nèi)充氧，保證運輸?shù)綄嶒炇业奈r為活體。用多層紗布濾掉蝦體水分后將其放入干凈的塑料袋或離心管中，編號備檢。大一點的蝦用剪刀剪去眼柄后，取包含肝胰腺組織的蝦頭部分進行檢測，不能馬上檢測的要放入低溫冰箱中保存。

2.瀕臨死亡的病蝦：對于在池塘中已有發(fā)病癥狀但不能馬上拿到實驗室檢測的蝦，養(yǎng)殖戶可將其打撈后放到干凈的礦泉水瓶或塑料袋中低溫冷凍保存，做好標(biāo)記，實驗前將其解凍，剪去眼柄后蝦頭留待檢測。

（三）蝦樣基因的提取

提取過程要在環(huán)境整潔、器皿潔凈下進行。因使用試劑純度較高，試驗人員操作要準(zhǔn)確。

1.水生動物病毒基因組（DNA/RNA）的提取：將制備的蝦樣按照所購試劑公司試驗操作規(guī)程進行提取。病毒基因組提取后的DNA/RNA如暫時不檢測要放入低溫冰箱中-80℃保存，一周內(nèi)盡快檢測。另外因為提取后的病毒基因組核酸溶液要做4項病毒檢測，因此加入的DEPC水要取50μL以保證足夠的提取量。

2.細(xì)菌基因（DNA）提?。喊凑照f明書操作規(guī)程進行提取。不同于病毒基因提取的是其消化時間較長，經(jīng)過碎化處理的蝦樣加入緩沖物（Buffei STE和 SDS）及蛋白酶K后，一般水浴3小時消化完全。提取的DNA保存于2℃～8℃，長期保存需低于-20℃。

（四）檢測

以提取的DNA作為模板，加入核酸檢測試劑盒中的反應(yīng)液、聚合酶、密封液后，分別進行WSSV、IHHNV、AHPND/EMS、EHP特異性PCR檢測，并設(shè)置陽性對照、陰性對照。檢測“對蝦血細(xì)胞虹彩病毒”及“對蝦偷死野田村病毒”2種病毒時需要在提取的DNA模板中加入逆轉(zhuǎn)錄酶得到cDNA后再進行上述操作。檢測儀器采用恒溫擴增熒光檢測儀。

檢測原理是采用恒溫擴增技術(shù)，通過聚合酶及特異性引物在恒溫條件下對病原核酸片段進行特異性擴增，擴增產(chǎn)物（DNA）與核酸染料結(jié)合后發(fā)出熒光信號，根據(jù)所產(chǎn)生的擴增曲線判斷結(jié)果。

需要特別注意是太陽光不能直射檢測機器，防止強光下儀器將陰性樣品檢測出假陽性?？衫洗昂熥稣诠馓幚?。

各病原指標(biāo)上機檢測所需體積及擴增溫度、反應(yīng)時間見表1。

表1 病原指標(biāo)上機檢測所需各種試液體積及擴增溫度、反應(yīng)時間

除蝦血細(xì)胞虹彩病毒（SHIV）和蝦肝腸胞蟲（EHP）反應(yīng)時間為45分鐘，其余4項指標(biāo)反應(yīng)時間為60分鐘。

二、檢測結(jié)果與討論

筆者3年間共檢測南美白對蝦蝦樣401個，包括蝦苗及養(yǎng)殖中不同階段的蝦。

（一）年度陽性樣品檢出率為：

2017年為IHHNV>AHPND/EMS>EHP>WSSV>CMNV，IHHNV陽性檢出率最高；2018年為EHP>IHHNV>AHPND/EMS>CMNV>WSSV，EHP檢出率最高；2019年為HP>AHPND/EMS>CMNV>IHHNV>WSSV，EHP檢出率最高。2018年、2019年蝦肝腸胞蟲（EHP）檢出率高，說明種蝦本身攜帶EHP病原，孵化時垂直傳播給蝦苗或孵化池消毒不徹底水體中病毒水平傳播給蝦苗。

（二）3年間陽性樣品檢出率

1.WSSV：17.8%（2017年）>16.3%（2019年）>15.1%（2018年），3年內(nèi)都有檢出，但變化不大；

2.IHHNV：49.5%（2017年）>25.6%（2018年）>18.3%（2019年），3年內(nèi)呈逐年下降的趨勢；

3.CMNV：15.0%（2017年）＜17.4%（2018年）＜25.5%（2019年），3年內(nèi)呈逐年上升的趨勢。

4.SHIV：2019才開始檢測SHIV。因為只檢測34個樣品，顯示陽性樣品4個，檢出率11.8%。出現(xiàn)的陽性樣品是同一家單位且同一個池塘的2種蝦樣（小龍蝦和南美白對蝦），經(jīng)過復(fù)檢仍為陽性，說明此病毒出現(xiàn)幾率少但可以水平傳播；

5.AHPND/EMS：32.7%（2017年）>24.4%（2018年）>22.6%（2019年），3年內(nèi)呈逐年下降的趨勢；

6.EHP：19.6%（2017年）＜30.2%（2018年）＜30.8%（2019年），3年內(nèi)呈逐年上升的趨勢。

對蝦偷死病（CMNV）和蝦肝腸胞蟲?。‥HP）這2種病原陽性檢出率呈上升趨勢，養(yǎng)殖企業(yè)和養(yǎng)殖戶今后應(yīng)密切注意。如養(yǎng)殖前期選苗應(yīng)注意EHP檢測結(jié)果，一旦檢出陽性應(yīng)果斷棄用，避免前期投入人力物力，養(yǎng)殖后期經(jīng)濟效益低。我們在檢測實踐中發(fā)現(xiàn)，被送檢的樣品大部分為蝦苗，這說明養(yǎng)殖企業(yè)和養(yǎng)殖戶越來越重視養(yǎng)殖前蝦苗的選擇，同時也充分證明了蝦苗檢測的重要性。

三、結(jié)論

筆者經(jīng)過多年檢測經(jīng)驗證明，用快速試劑盒法檢測南美白對蝦流行病病原定性準(zhǔn)確，準(zhǔn)確率高。并且應(yīng)用此方法可縮短檢測時間，尤其在養(yǎng)殖初期選苗階段，在養(yǎng)殖企業(yè)及養(yǎng)殖戶送檢的蝦樣較多、選苗時間較短的情況下，檢測人員可在短時間內(nèi)完成檢測，檢測結(jié)果能夠及時反饋給養(yǎng)殖戶，使他們及時淘汰病苗、劣質(zhì)苗，避免產(chǎn)生經(jīng)濟損失。另外在養(yǎng)殖后期由于檢測時間短，可幫助養(yǎng)殖戶及時判斷病蝦發(fā)病種類，為養(yǎng)殖戶做好病害防治起到關(guān)鍵作用。