內(nèi)生真菌對宿主植物生長和次級代謝產(chǎn)物影響研究進(jìn)展*

劉圣越 ，王躍飛 ，何永志 ，李霖 ，房士明 ，張晗

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)制藥工程學(xué)院，天津 301617）

內(nèi)生真菌是指一類存在于健康植物內(nèi)部各個組織及細(xì)胞內(nèi)，且不會對植物引起明顯病害癥狀的微生物[1]。已經(jīng)報道的內(nèi)生真菌都屬于子囊菌類，廣泛分布于苔蘚、蕨類、灌木、藻類、草本及被子與裸子植物。在長期發(fā)展進(jìn)化的過程中，內(nèi)生真菌與植物建立了互利共惠的關(guān)系。宿主植物能夠提供內(nèi)生真菌生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)[2-3]。內(nèi)生真菌通過調(diào)節(jié)植物激素促進(jìn)植物生長或者協(xié)助植物抵抗干旱、蟲害、病原菌侵害等外界因素的脅迫[4-9]。有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌通過分泌真菌誘導(dǎo)子來誘導(dǎo)植物產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，增加次級代謝產(chǎn)物的量，或者自身產(chǎn)生與植物相似的次級代謝產(chǎn)物[10-11]。文章對內(nèi)生真菌促進(jìn)植物生長、協(xié)助宿主對抗外界因素脅迫和影響植物次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累3個方面進(jìn)行總結(jié)概括，以期為研究內(nèi)生真菌對宿主植物作用以及中藥資源研究提供一定參考。

1 內(nèi)生真菌促進(jìn)植物生長

光源、碳源、土壤及水對于植物生長至關(guān)重要，內(nèi)生真菌對宿主植物生長也有很大影響。相關(guān)研究表明內(nèi)生真菌主要通過調(diào)節(jié)吲哚-3-乙酸（IAA）[12]和乙烯[13]等植物激素水平來促進(jìn)植物種子萌發(fā)和植物生長。

1.1 內(nèi)生真菌調(diào)節(jié)IAA水平促進(jìn)植物生長 植物激素IAA是一種生長素，是植物生長和發(fā)育關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，對細(xì)胞分裂、生長、衰老發(fā)揮著重要作用[14]。植物中合成IAA是通過色氨酸（Trp）依賴性途徑或用Trp非依賴性途徑從頭合成。在Trp依賴性途徑中，Trp轉(zhuǎn)化成IAA有4種生物合成途徑[15]，而在真菌中，主要有兩種途徑：一種是通過氨基轉(zhuǎn)移酶（TAA）將 Trp轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸（IPA），然后IPA在黃素單加氧酶（FMO）的作用下轉(zhuǎn)化成IAA。另一種則是Trp經(jīng)色氨酸脫羧酶（TDC）形成色胺（TAM），TAM在胺氧化酶（AO）的催化下形成吲哚-3-乙醛（IAAld），后者再經(jīng)吲哚-3-乙醛脫氫酶（IAD）轉(zhuǎn)化成IAA[16]。而在Trp非依賴性途徑中，吲哚-3-甘油磷酸作為前體，在吲哚合酶（INS）的作用下形成吲哚，后者再轉(zhuǎn)化成IAA，但植物吲哚如何轉(zhuǎn)化成IAA的機(jī)制尚不清晰，可能通過吲哚-3-乙腈（IAN）、IPA、吲哚-3-乙酰胺（IAM）等中間體合成IAA[17]。見圖 1。

圖1 真菌中IAA的合成途徑

文獻(xiàn)報道內(nèi)生真菌可產(chǎn)生IAA從而促進(jìn)植物種子萌發(fā)及根、莖、葉的生長。Chutima等[18]從蘭花根中分離出3種高產(chǎn)IAA的瘤菌根菌屬真菌Tulasnella CMU-SLP 007、Tulasnella CMU-NUT 013和Tulasnella CMU-AU 006，將這3種真菌接種于蕓豆及玉米種子中，發(fā)現(xiàn)蕓豆根生長長度增加，促進(jìn)了玉米種子萌發(fā)。內(nèi)生真菌還通過調(diào)控TAA影響IAA的合成。Kulkarni等[19]從種植鷹嘴豆土壤樣品中分離出鐮刀菌屬真菌Fusarium delphinoides，采用氣相色譜分析檢測該菌中存在IPA，并且TAA活性增強(qiáng)，IAA含量增加，促進(jìn)了鷹嘴豆生長。Kumla等[20]用高效液相色譜（HPLC）法檢測出6種真菌的粗酶提取物中都有IPA，且這些真菌中的TAA活性均增強(qiáng)。同時在接種這6種真菌的燕麥中發(fā)現(xiàn)這些真菌均能產(chǎn)生IAA，促進(jìn)燕麥胚芽鞘伸長。有研究顯示內(nèi)生真菌還能通過調(diào)控色胺途徑中IAD促進(jìn)植物生長。Reineke等[21]將敲除IAD基因的黑粉菌屬真菌Ustilago maydis突變體接種于玉米，顯示IAAld向IAA轉(zhuǎn)化過程受阻，而具有IAD基因的原始菌株能產(chǎn)生較高水平的IAA，從而促進(jìn)玉米生長。內(nèi)生真菌不僅能通過Trp依賴性途徑合成IAA，還能通過Trp非依賴性途徑合成IAA。Khan等[22]使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）法對從乳香樹中分離出的短梗霉屬真菌Aureobasidium sp.BSS6菌株培養(yǎng)濾液中的IAA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其培養(yǎng)濾液中存在吲哚-3-甘油磷酸而無Trp，并且該菌株顯示較高的IAA合成，促進(jìn)了乳香樹生長。強(qiáng)曉晶[23]分析從披堿草種子中篩選出的3種鏈格孢屬真菌Alternaria sp.LQ1230、Alternaria sp.LQ2、Alternaria sp.LQ141 的純培養(yǎng)濾液，發(fā)現(xiàn)這3種菌株內(nèi)無Trp存在，但這3種真菌仍能產(chǎn)生IAA，將這3種真菌接種于小麥幼苗中，均能顯著促進(jìn)小麥生長。上述文獻(xiàn)研究表明內(nèi)生真菌能通過Trp依賴途徑和非Trp依賴途徑合成IAA，并且自身調(diào)控這兩種途徑中涉及的中間產(chǎn)物及酶，增加植物IAA水平，進(jìn)而促進(jìn)植物根、莖、葉的生長及果實(shí)成熟。

1.2 內(nèi)生真菌通過降低乙烯水平刺激植物生長 乙烯是一種有生物活性的氣體分子，低濃度乙烯能促進(jìn)植物生長，而高濃度乙烯則會抑制其生長，因此降低乙烯水平有助于植物生長發(fā)育、果實(shí)成熟及延緩組織衰老等[24]。在乙烯的生物合成途徑中，甲硫氨酸在S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）的作用下形成S-腺苷甲硫氨酸（SAM），SAM在氨基環(huán)丙烷羧酸合酶的催化下合成氨基環(huán)丙烷羧（ACC），后者在氨基環(huán)丙烷羧氧化酶作用下進(jìn)一步合成乙烯[25]。其中ACC是合成乙烯的重要前體物質(zhì)。見圖2。

圖2 乙烯的合成途徑

內(nèi)生真菌可產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶（ACCD），該酶能將乙烯合成途徑中的前體物質(zhì)ACC裂解成α-酮丁酸和氨，從而減少乙烯的合成，刺激植物的生長。Zhang等[26]檢測到含有木霉屬真菌Trichoderma asperellum ACCC30536的擬南芥中ACCD活性增強(qiáng)，擬南芥中乙烯含量降低，根長、根數(shù)、鮮質(zhì)量、種子等生長參數(shù)均增加。此外Zhang等[27]還檢測到含有木霉屬真菌Trichoderma asperellum ACCC30536的楊樹幼苗中ACCD活性增強(qiáng)，發(fā)現(xiàn)其中乙烯含量降低，促進(jìn)了楊樹幼苗的生長。Jolanta等[28]發(fā)現(xiàn)定殖了木霉屬真菌Trichoderma DEMTkZ3A0的小麥幼苗根部重量增加，在小麥幼苗的根部檢測到ACCD增加，乙烯含量減少，促進(jìn)小麥幼苗生長。綜上所述，內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生ACCD，該酶降解乙烯合成的前體物質(zhì)ACC，從而降低植物中乙烯的濃度，達(dá)到促進(jìn)植物生長的作用。

2 內(nèi)生真菌激活植物防御系統(tǒng)對抗惡劣環(huán)境

植物在生長過程中會受到干旱、高鹽、重金屬及病原體等帶來的侵害，如干旱能降低種子發(fā)芽率、導(dǎo)致葉片氣孔開放減少、植物光合作用受到抑制以及增加植物中的活性氧含量[29-30]。重金屬會破壞土壤質(zhì)量，并且損害植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，影響植物的生長和代謝[31]。高鹽會使植物中養(yǎng)分失衡，導(dǎo)致特定的離子毒性，同時也會產(chǎn)生大量的活性氧使得植物細(xì)胞受損[32]。然而植物中的內(nèi)生真菌能協(xié)助植物對抗脅迫，內(nèi)生真菌通過調(diào)控植物激素的水平，如調(diào)控赤霉素（GA）[33]、水楊酸（SA）[34]和茉莉酸（JA）[35]等物質(zhì)的水平，協(xié)助植物對抗環(huán)境脅迫。此外，內(nèi)生真菌還能調(diào)節(jié)活性氧協(xié)助植物對抗惡劣環(huán)境[36]。

2.1 內(nèi)生真菌產(chǎn)生GA誘導(dǎo)植物適應(yīng)脅迫 GA是一種植物激素，能抵御干旱、鹽等各種脅迫[37-39]。GA主要由前體物質(zhì)牻牛兒牻牛兒基焦磷酸（GGDP）在古巴焦磷酸合成酶（CPS）和內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶（KS）的催化下形成內(nèi)根-貝殼杉烯，進(jìn)而經(jīng)內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶（KO）的催化下依次形成內(nèi)根-貝殼杉烯醇、內(nèi)根-貝殼杉烯醛和內(nèi)根-貝殼杉烯酸（KA）。KA則在內(nèi)根-貝殼杉烯酸氧化酶（KAO）的作用下合成GA12-醛，后者進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成中間產(chǎn)物GA12。GA12在GA13氧化酶的催化下形成GA53，GA53在 GA20-oxidase、GA3-oxidase和 GA2-oxidase氧化酶的催化下形成不同種類的GA[40]。見圖3。

圖3 GA的合成途徑

內(nèi)生真菌通過合成GA可提高植物中GA水平，從而協(xié)助植物對抗環(huán)境脅迫。Khan等[41]將從黃瓜植株中分離得到的擬青霉菌屬真菌Paecilomyces formosus LHL10接種于處于鹽脅迫下的宿主植物中，并與未接種菌株的植物相比較，結(jié)果顯示接種菌株的植物中GA分子GA20合成增加，GA含量顯著增高，減弱了宿主植物受到的鹽脅迫。Cosme等[42]將梨形孢屬真菌印度梨形孢Piriformospora indica接種于含有稻水象甲的水稻中，與未接種內(nèi)生真菌的水稻比較，發(fā)現(xiàn)在接種內(nèi)生真菌的水稻中KS的基因表達(dá)和GA含量高于未接種內(nèi)生真菌的水稻，并且可以抵御稻水象甲的侵害。Bilal等[43]將擬青霉菌屬真菌Paecilomyces formosus LHL10接種于處于鎳脅迫下的大豆植物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種該菌減弱了大豆植物的鎳脅迫，并且通過實(shí)時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）分析發(fā)現(xiàn)該真菌內(nèi)GA合成過程中GA20-oxidase基因上調(diào)，大豆植物中GA含量增加。上述文獻(xiàn)結(jié)果表明，植物在遭遇外在環(huán)境脅迫時，其內(nèi)生真菌可以調(diào)控GA合成過程中的酶來合成GA，提高植物體內(nèi)GA水平，進(jìn)而幫助植物抵御脅迫。

2.2 內(nèi)生真菌通過調(diào)控SA和JA抵御環(huán)境脅迫 SA和JA是高等植物的內(nèi)源性調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以促進(jìn)植物對病原體的抵御。SA的合成途徑是苯丙氨酸先轉(zhuǎn)化成肉桂酸（t-CA），t-CA經(jīng)苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化形成苯甲酸，苯甲酸在苯甲酸2-羥化酶（BA2H）作用下經(jīng)羥基化形成SA，其中PAL是其合成過程中的關(guān)鍵酶。見圖4。

圖4 SA的合成途徑

JA則是α-亞麻酸在13-脂氧合酶（LOX）的作用下氧化成13-氫過氧-亞麻酸，再由13-氫過氧化物脫水酶催化成12-13環(huán)氧亞麻酸，并由13-氫過氧化物環(huán)化酶催化成12-氧-植物二烯酸，此物質(zhì)再由12-氧-植物二烯酸還原酶催化成3-氧-2-（2-戊烯基）-環(huán)戊烷辛酸，再由β氧化生成JA。其中LOX是JA合成過程中的關(guān)鍵酶[44-45]。見圖5。

圖5 JA的合成途徑

植物經(jīng)常會受到蟲害、病原菌及機(jī)械創(chuàng)傷造成的侵害，而內(nèi)生真菌能調(diào)控SA和JA的水平誘導(dǎo)其宿主植物對抗這些侵害。馬碧花等[46]從蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科學(xué)院采摘帶內(nèi)生真菌和不帶內(nèi)生真菌的多年生黑麥草，賦予這兩種黑麥草干旱脅迫，兩者相比較，帶內(nèi)生真菌的黑麥草枝葉茂盛，而不帶內(nèi)生真菌的黑麥草枝葉凋落。經(jīng)檢測帶有內(nèi)生真菌的黑麥草相對含水量、葉綠素含量和SA含量高于不帶內(nèi)生真菌的黑麥草。Mishra等[47]將鏈格孢菌屬真菌Alternaria alternata接種于宿主植物并給予其病原體侵害，與未接種內(nèi)生真菌的宿主植物相比，其SA合成過程中PAL基因上調(diào)，植物中SA含量增加，宿主植物受到病原體的傷害減弱。Pappas等[48]將鐮刀菌屬真菌Fusarium solani接種于番茄中，給予葉螨侵染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未接種該菌的番茄相比，番茄中葉螨的產(chǎn)卵下降，并且發(fā)現(xiàn)LOX基因的表達(dá)增強(qiáng)，番茄中JA含量增加。綜上所述，內(nèi)生真菌調(diào)控植物中SA和JA的含量，協(xié)助宿主植物對抗病原體的進(jìn)攻。

2.3 內(nèi)生真菌調(diào)控活性氧對抗脅迫 活性氧是指機(jī)體內(nèi)或者自然環(huán)境中由氧組成，并且性質(zhì)活潑的物質(zhì)總稱，包括超氧陰離子、過氧化氫（H2O2）及氧氣，也是體內(nèi)正常代謝的副產(chǎn)物。當(dāng)植物長期暴露于干旱、高鹽、病原體感染等環(huán)境時，這些環(huán)境會迫使植物產(chǎn)生活性氧，而過量的活性氧則會造成蛋白質(zhì)和植物細(xì)胞氧化受損[49]。

NADPH氧化酶（NoxA）是活性氧形成過程中的關(guān)鍵酶，電子供體NADPH轉(zhuǎn)移的電子通過黃細(xì)胞色素B558轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜的胞質(zhì)側(cè)，這些電子與電子受體反應(yīng)并產(chǎn)生超氧化物，進(jìn)而產(chǎn)生大量的活性氧[50]。內(nèi)生真菌能調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）來抑制NADPH氧化酶活性，協(xié)助植物清除活性氧進(jìn)而減少細(xì)胞受損[51]。張詩婉[52]從盤錦紅海灘堿蓬Suaeda glauca Bunge葉片中分離出內(nèi)生真菌Y1-1，將其接種于重金屬鎘感染的水稻幼苗中，與未接種真菌的水稻幼苗比較，有效緩解了水稻幼苗受到的鎘侵害，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)接種真菌的水稻幼苗中SOD、CAT、POD等抗氧化酶活性增加，使得處于干旱脅迫下的水稻中的鎘含量和活性氧減少。胡桂馨等[53]將頂頭胞霉菌Acremonium coenophialum接種于高羊茅中，置于干旱環(huán)境下，與未接種的高羊茅相比，接種內(nèi)生真菌的高羊茅中SOD、CAT等抗氧化酶活性和相對含水量均高于未接種的高羊茅。張永雯[54]將細(xì)交鏈孢菌Alternaria alternata、根腐離蠕孢Bipolaris sorokiniana和燕麥鐮刀菌Fusarium avenaceum接種于鹽脅迫下的野大麥，發(fā)現(xiàn)野大麥中POD、CAT、SOD酶活性增強(qiáng)，活性氧的含量降低。上述研究表明，內(nèi)生真菌能增強(qiáng)抗氧化酶活性來抑制活性氧形成過程中的NADPH氧化酶，維持植物中活性氧與抗氧化性的平衡，進(jìn)而協(xié)助植物對抗環(huán)境脅迫。

3 增加宿主次級代謝物質(zhì)積累

植物次級代謝產(chǎn)物對人類健康有著重要影響，但是植物次級代謝產(chǎn)物的獲取受植物生長周期限制，而且有些成分含量極低。植物內(nèi)生真菌不僅能通過自身產(chǎn)生誘導(dǎo)物質(zhì)促進(jìn)植物次級代謝產(chǎn)物的生物合成[55-56]，而且還能產(chǎn)生與宿主植物相似的次級代謝產(chǎn)物[57-61]。

3.1 內(nèi)生真菌通過真菌誘導(dǎo)子刺激宿主次級代謝物質(zhì)積累 刺激次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的分子稱為誘導(dǎo)子，而誘導(dǎo)則是增加植物中次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的有效手段之一。內(nèi)生真菌中的誘導(dǎo)子如寡糖、多糖、甘露聚糖及植物激素可以活化植物中特定的某類次級代謝產(chǎn)物的代謝途徑，進(jìn)而調(diào)控這類物質(zhì)的生物合成。Li等[62]從鐮刀菌屬真菌Fzarium oxysporum Dzf17的菌絲體中制備寡糖，將其加入盾葉薯中，發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元含量增大。Zhong等[63]將鐮刀菌屬真菌Fusarium oxysporum Fat9中的胞外多糖加入苦蕎麥中，發(fā)現(xiàn)苦蕎麥芽中蘆丁和槲皮素的總產(chǎn)量增加。Chen等[64]從孔球孢霉屬真菌Gilmaniella sp.AL12中提取出胞外甘露聚糖，將其加入到蒼術(shù)中，顯示部分甘露聚糖被降解為甘露糖，并被己糖激酶活化，促進(jìn)了光合作用、能量代謝及萜類化合物的生成。Jie等[65]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌Gilmaniella sp.AL12能誘導(dǎo)白術(shù)中的乙烯生成，并且刺激H2O2和一氧化氮（NO）的信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而刺激白術(shù)中倍半萜類化合物的合成。Ren等[66]先用JA抑制劑布洛芬（IBU）和去甲二氫愈創(chuàng)木酸處理白術(shù)，抑制了白術(shù)中JA和揮發(fā)油的產(chǎn)生，隨后將內(nèi)生真菌孔球孢霉Gilmaniella sp.AL12接種于白術(shù)中，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)白術(shù)中JA含量增加，同時增加了白術(shù)中的揮發(fā)油含量。上述研究結(jié)果說明內(nèi)生真菌能通過各種真菌誘導(dǎo)子刺激植物產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，增加其積累。

3.2 內(nèi)生真菌產(chǎn)生與其宿主相同或相似的代謝產(chǎn)物 內(nèi)生真菌不僅能刺激植物產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物積累，由于與宿主共同進(jìn)化還可能會產(chǎn)生與其宿主相同或相似的代謝產(chǎn)物。其原因是植物代謝過程中某些關(guān)鍵酶的基因垂直傳遞給內(nèi)生真菌，導(dǎo)致真菌產(chǎn)生與植物相同或類似的代謝產(chǎn)物[67]。Strobel等[68]從西藏紅豆杉中分離出1株擬盤多毛孢屬真菌Pestalotiopsis microspora，從該菌的提取物中分離出一種與紫杉醇類似的化合物，通過進(jìn)一步的LC-MS和核磁共振（NMR）分析，并與對照品紫杉醇比對，證實(shí)該化合物為紫杉醇。張春燕[69]從構(gòu)樹[Broussonetia papyrifera（L.）Vent]中分離出 48 株內(nèi)生真菌，其中兩株真菌Chaetomium globousm和Alternaria sp產(chǎn)生與構(gòu)樹相似的生物堿類化合物。厲秀秀等[70]從黃連中分離得到12株內(nèi)生真菌，其中1株擬莖點(diǎn)霉屬內(nèi)生真菌Phomopsis HL-BC，經(jīng)HPLC檢測，該內(nèi)生真菌的發(fā)酵液中含有小檗堿。袁麗紅等[71]從盾葉薯蕷根狀莖中分離出1株盤針孢菌屬內(nèi)生真菌Libertella sp.RE0105，發(fā)現(xiàn)其能產(chǎn)生與盾葉薯蕷相同的代謝產(chǎn)物——薯蕷皂苷元。上述研究表明，內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主植物相同或類似的次級代謝產(chǎn)物，可從內(nèi)生真菌中獲得與植物相同或類似的代謝產(chǎn)物，具有不受植物資源限制的優(yōu)勢。

4 結(jié)論與展望

藥用植物中的內(nèi)生真菌種類眾多，資源豐富，是一類尚未充分利用并且應(yīng)用前景廣闊的微生物。內(nèi)生真菌可以促進(jìn)植物生長，協(xié)助其宿主植物對抗惡劣環(huán)境脅迫，產(chǎn)生與宿主植物相類似的次級代謝產(chǎn)物及誘導(dǎo)植物次級代謝產(chǎn)物積累。因此對內(nèi)生真菌進(jìn)行全面深入的研究有助于植物的開發(fā)與保護(hù)，并且產(chǎn)生具有良好生物活性的成分。在現(xiàn)階段研究中，關(guān)于植物通過什么路徑將其代謝過程中的關(guān)鍵酶基因傳遞給內(nèi)生真菌有待進(jìn)一步研究。一些珍貴稀少的植物還未展開內(nèi)生真菌的研究。目前對于內(nèi)生真菌的研究還處于實(shí)驗(yàn)室中，尚未進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。因此對于藥用植物中內(nèi)生真菌的研究還有待進(jìn)一步深化，應(yīng)該利用現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行更深層次的機(jī)制研究，闡明內(nèi)生真菌與宿主植物之間的關(guān)系，有利于保護(hù)珍稀、瀕危的藥用植物，大規(guī)模分離內(nèi)生真菌，尋找新穎的活性先導(dǎo)化合物，為新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)。