黨參枸杞復(fù)合飲料的制備及其抗氧化活性研究

杜景濤，鄭 貞,*，陳 駿，鄢顯明，蔣小鳳，劉精武

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)體育學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都市郫都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，四川 成都 610000；3.長治學(xué)院體育系，山西 長治 046011）

人體在長時間劇烈運(yùn)動時，體內(nèi)的氧化還原平衡被破壞，生成過量的自由基與活性氧，促使體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激，出現(xiàn)組織損傷、肌肉收縮能力下降等不良現(xiàn)象，產(chǎn)生疲勞感，而對機(jī)體補(bǔ)充外源性抗氧化劑是延緩體力疲勞的有效方法之一[1-2]。近年來，一些多糖、皂苷、黃酮類化合物、小分子肽類等天然抗氧化活性成分被發(fā)現(xiàn)抗疲勞作用較好，大量用于運(yùn)動飲料的添加[3-5]，通過阻止細(xì)胞氧化、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及直接清除自由基等作用，降低體內(nèi)氧化應(yīng)激，緩解運(yùn)動后身體疲勞。

黨參是桔梗科植物黨參（Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.）的干燥根部，具有補(bǔ)中益氣、養(yǎng)血生津等功效，含有萜類、多糖、糖苷類、甾體類、黃酮類、木脂素、氨基酸等活性成分[6-7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黨參多糖具有增加血紅蛋白數(shù)量、抗氧化及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等作用[8]。秦楠等[9]曾以黨參、蕎麥為原料，研制出的保健醋飲料口感柔和，風(fēng)味獨(dú)特，但未對其具體保健效果進(jìn)行深入探討，而楊鮮[10]在黨參復(fù)合保健飲料制備時并未就不同活性成分對飲料的品質(zhì)影響進(jìn)行分析。由于枸杞作為國家衛(wèi)生健康委員會首批認(rèn)定的藥食同源食品，其多糖提取物也可增強(qiáng)身體的運(yùn)動耐力[11]。因此，本研究利用上述兩種物質(zhì)多糖成分的生物學(xué)活性，以兩種物質(zhì)的多糖提取液為原料，輔以蔗糖、檸檬酸和黃原膠，研制黨參枸杞復(fù)合運(yùn)動飲料，探討不同組分對飲料品質(zhì)的影響，同時以羥基自由基、超氧陰離子自由基與DPPH 自由基為機(jī)體劇烈運(yùn)動后生成的自由基代表，利用復(fù)合飲料分別檢測其對不同自由基的清除率，考察該復(fù)合飲料的體外抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

黨參、枸杞均購于成都君源堂大藥房，經(jīng)成都市郫都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院蔣小鳳醫(yī)師鑒定為川黨參干燥根部。

無水乙醇、氫氧化鈉、苯酚、硫酸、硫酸亞鐵、雙氧水、磷酸氫鈉、磷酸氫二鈉，均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖對照品，購于中國食品藥品檢定研究院；蔗糖，購于成都某農(nóng)貿(mào)市場；黃原膠，購于濟(jì)南意和旺化工科技有限公司；檸檬酸，購于河南吉乾生物科技有限公司；VC，購于江蘇嵐羽生物工程有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、DPPH 自由基，購于美國Sigma 公司；水楊酸、鄰苯三酚，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；試驗(yàn)用水為二次純化水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

YP-6001 型電子天平，購于上海越平儀器有限公司；FE28 型臺式pH 計(jì)，購于梅特勒-托利多有限公司；NAR-3T 型折光儀，購于上海雙旭電子有限公司；JY96-II 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，購于上海熙揚(yáng)儀器有限公司；UV-7504 型紫外可見分光光度計(jì)，購于上海精密儀器儀表有限公司；JY-W2 型超威粉碎機(jī)，購于濰坊星爾機(jī)械設(shè)備有限公司；ZH-RHJ 型高壓均質(zhì)機(jī)，購于廣州正恒自動化設(shè)備有限公司；GRX-9073A型干熱滅菌箱，購于上海善志儀器設(shè)備有限公司；KQ5200E 型超聲波器，購于昆山舒美超聲儀器有限公司；TG16G 型臺式高速離心機(jī)，購于常州億能儀器設(shè)備有限公司；動物恒溫游泳池，購于上海艾研生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黨參枸杞運(yùn)動飲料制備工藝流程

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 黨參多糖的提取

參照李啟艷等[12]的方法稍作修改。黨參洗凈后曬干（含水量為15%～20%），粉碎過80 目篩，準(zhǔn)確稱取20 g 過篩樣品，加水600 mL，于60 ℃、400 W 下超聲提取60 min 后濃縮，加入無水乙醇至醇濃度達(dá)到60%停止，混勻后過夜，以5 000 r/min 離心20 min 后過濾，揮干乙醇后，即得黨參多糖提取物。

1.2.2.2 枸杞多糖的提取

參照彭浩等[13]的方法稍作修改。枸杞洗凈、曬干、粉碎后過80 目篩，準(zhǔn)確稱取20 g 樣品，加水300 mL，于60 ℃、200 W 下超聲提取30 min，濃縮后加5 倍體積乙醇，混勻后過夜，以2 000 r/min 離心過濾，揮干乙醇，即得枸杞多糖提取物。

1.2.2.3 調(diào)配

將40%黨參多糖水溶液和40%枸杞多糖水溶液以一定比例混合成原料液后，加入食品添加劑（蔗糖、檸檬酸、黃原膠），調(diào)配至成品。

1.2.2.4 均質(zhì)、灌裝與滅菌

成品料液均質(zhì)攪拌2 次后灌裝（溫度：65～70 ℃，壓力：18～25 MPa），于121 ℃下滅菌10 min，冷卻后制得黨參枸杞運(yùn)動飲料[14]。

1.2.3 黨參枸杞運(yùn)動飲料的配方優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以黨參多糖與枸杞多糖的水溶液體積比和蔗糖、檸檬酸、黃原膠的用量（相對多糖混合液的百分比）為單因素，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分別考察原料液中黨參多糖與枸杞多糖的水溶液體積比（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）、蔗糖用量（2%、4%、6%、8%、10%）、檸檬酸用量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）及黃原膠用量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）對運(yùn)動飲料的感官品質(zhì)影響。

1.2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以黨參多糖與枸杞多糖的水溶液體積比（A）、蔗糖用量（B）、檸檬酸用量（C）和黃原膠用量（D）為自變量，感官得分為響應(yīng)值（Y），設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，利用Design-Expert 軟件的Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，優(yōu)化各組分配比，試驗(yàn)因素水平見表1 所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.4 感官品質(zhì)評價(jià)

參考復(fù)合運(yùn)動飲料的感官評價(jià)經(jīng)驗(yàn)[15]，根據(jù)成品的實(shí)際特性，制定黨參枸杞運(yùn)動飲料的感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，如表2 所示。邀請7 位飲料感官評價(jià)經(jīng)驗(yàn)豐富的人員組成感官評定小組，分別按照色澤、氣味、口感和組織形態(tài)四個維度，對不同組分配比制得的運(yùn)動飲料進(jìn)行評價(jià)，每個樣品重復(fù)3 次，最終結(jié)果取平均值。

表2 運(yùn)動飲料感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria of the sports beverage

1.2.5 理化指標(biāo)測定

1.2.5.1 pH

采用pH 計(jì)檢測運(yùn)動飲料的pH。

1.2.5.2 可溶性固形物含量

按照GB 15266—2009[16]要求采用折光計(jì)法測定。

1.2.5.3 離心沉淀率

稱取一定質(zhì)量（m0）的黨參枸杞運(yùn)動飲料，置于離心管中，以3 000 r/min 離心10 min 后，對管內(nèi)上清液稱重，記為m，按照下式計(jì)算飲料的離心沉淀率[17]。

1.2.5.4 微生物指標(biāo)檢測

按照GB 7101—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲料》[18]要求，分別檢測黨參枸杞運(yùn)動飲料的微生物菌落總數(shù)、大腸桿菌和致病菌。

1.2.6 體外抗氧化活性評價(jià)

1.2.6.1 羥基自由基清除率

在裝有2.0mL9mmol/L 硫酸亞鐵和2.0mL9mmol/L水楊酸醇溶液的試管內(nèi)準(zhǔn)確加入2.0 mL 飲料樣品，搖勻后繼續(xù)加入2.0 mL 20 mmol/L 雙氧水混合搖勻，于37 ℃水浴加熱30 min 后，以純化水作空白對照，0.2 mg/mL VC 作陽性對照，在510 nm 處測定吸光度值，平行測定6 次，按照下式計(jì)算羥基自由基清除率[19]。

式中：w為羥基自由基清除率，%；A1為待測管吸光度值；A2為以水替代雙氧水的待測管吸光度值；A0為以水替代樣品的待測管吸光度值。

1.2.6.2 超氧陰離子自由基清除率

參考文獻(xiàn)方法[19]，在裝有2.0 mL Tris-HCl 溶液（0.1 mmol/L，pH 8.2）的試管內(nèi)準(zhǔn)確加入0.1 mL 飲料樣品和0.1 mL 鄰苯三酚鹽酸溶液（3 mol/L），于25 ℃下水浴加熱5 min 后，冷卻至室溫，以水作空白對照，0.2 mg/mL VC 作陽性對照，于420 nm 處測定吸光度值，平行測定6 次，按照公式（2）計(jì)算超氧陰離子自由基的清除率。其中：w為超氧陰離子自由基清除率，%；A1為待測管吸光度值；A2為以水替代鄰苯三酚鹽酸溶液的待測管吸光度值；A0為以水替代樣品的待測管吸光度值。

1.2.6.3 DPPH 自由基清除率

準(zhǔn)確移取2.0 mL 復(fù)合飲料于試管內(nèi)，加入2.0 mL 0.2 mol/L DPPH 自由基乙醇溶液，搖勻后避光靜置30 min，以無水乙醇作空白對照，0.2 mg/mL VC 作陽性對照，于517 nm 處測定吸光度值，平行測定6 次，按照公式（2）計(jì)算DPPH 自由基的清除率[19]。其中：w為DPPH 自由基的清除率，%；A1為待測管吸光度值；A2為以水替代DPPH 乙醇溶液的待測管吸光度值；A0為以水替代樣品的待測管吸光度值。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05 表示具有顯著性差異，P＜0.01 表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 黨參多糖與枸杞多糖水溶液體積比對飲料感官品質(zhì)的影響

固定蔗糖用量6%、檸檬酸用量0.5%、黃原膠用量0.3%，考察不同黨參多糖與枸杞多糖水溶液體積比對飲料感官品質(zhì)的影響，結(jié)果見圖1。當(dāng)黨參多糖與枸杞多糖的水溶液體積比為1∶2 時，運(yùn)動飲料的感官得分最高，為（85.67±1.33）分，此時飲料呈棕黃色、酸甜適中；若枸杞多糖的比例繼續(xù)增大，則飲料黨參香味下降明顯；而黨參多糖比例過大，溶液的苦澀味加重且不穩(wěn)定。因此選擇黨參多糖與枸杞多糖水溶液體積比2∶1、1∶1、1∶2 作為響應(yīng)面因素考察水平。

圖1 不同黨參多糖與枸杞多糖水溶液體積比對飲料感官品質(zhì)的影響Fig.1 Effects of different ratios between polysaccharide extracts of Codonopsis pilosula and wolfberry on the sensory evaluation of beverage

2.1.2 蔗糖用量對飲料感官品質(zhì)的影響

固定黨參多糖與枸杞多糖水溶液體積比1∶2、檸檬酸用量0.5%、黃原膠用量0.3%，考察不同蔗糖用量對飲料感官品質(zhì)的影響，結(jié)果見圖2。隨著蔗糖用量的增多，飲料的感官評分呈先增大后減小的趨勢，這歸因于蔗糖用量過少，飲料的澀味較重，而用量過多又影響飲料中黨參與枸杞的獨(dú)有風(fēng)味。因此選擇蔗糖用量4%、6%、8%作為響應(yīng)面因素考察水平。

圖2 不同蔗糖用量對飲料感官品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of different amount of saccharose on the sensory evaluation of beverage

2.1.3 檸檬酸用量對飲料感官品質(zhì)的影響

檸檬酸的添加不僅有利于改善飲料的口感，還可作為酸味劑、抗氧化劑及pH 調(diào)節(jié)劑，以保持飲料的品質(zhì)。固定黨參多糖與枸杞多糖水溶液體積比1∶2、蔗糖用量6%、黃原膠用量0.3%，考察不同檸檬酸用量對飲料感官品質(zhì)的影響，結(jié)果見圖3。當(dāng)檸檬酸用量為0.5%時，飲料的感官評分呈下降趨勢；檸檬酸的過多添加，導(dǎo)致溶液的酸味突出，口感變差。因此選擇檸檬酸用量0.3%、0.5%、0.7%作為響應(yīng)面因素考察水平。

2.1.4 黃原膠用量對飲料感官品質(zhì)的影響

黨參與枸杞在超聲分離提取多糖后，仍有部分大分子化合物或纖維組織進(jìn)入提取液，影響飲料的穩(wěn)定性，因此添加黃原膠來改善飲料的懸浮能力。固定黨參多糖與枸杞多糖水溶液體積比1∶2、蔗糖用量6%、檸檬酸用量0.5%，考察不同黃原膠用量對飲料感官品質(zhì)的影響，結(jié)果見圖4。當(dāng)黃原膠用量為0.3%時，飲料的感官得分最高，為（85.76±1.29）分；若黃原膠用量繼續(xù)增大，感官得分逐漸降低，這可能與黃原膠用量過多，致使溶液黏度增大有關(guān)。因此選擇黃原膠用量0.2%、0.3%、0.4%作為響應(yīng)面因素考察水平。

圖3 不同檸檬酸用量對飲料感官品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of different amount of citric acid on the sensory evaluation of beverage

圖4 不同黃原膠用量對飲料感官品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of different amount of xanthan gum on the sensory evaluation of beverage

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，按照Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，分別以黨參多糖與枸杞多糖水溶液體積比（A）、蔗糖用量（B）、檸檬酸用量（C）及黃原膠用量（D）為響應(yīng)面考察因素，感官評分（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果如表3 所示。

對上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到感官得分與各因素的二次多項(xiàng)回歸模型：Y=85.66+0.57A+0.42B+0.55C-0.53D-1.50AB+1.50AC+0.80AD+0.50BC-0.56BD-0.31CD-1.10A2-2.75B2-2.25C2-1.64D2。

對該模型進(jìn)行顯著檢驗(yàn)與方差分析，結(jié)果見表4。

由表4 可知，該回歸模型P＜0.01，表明該模型回歸效果顯著，可較好地反映實(shí)際結(jié)果，R2=0.977 3，說明該模型擬合值與實(shí)際結(jié)果具有高度相關(guān)性，而模型失擬項(xiàng)P=0.071 3，表示該模型方程并不顯著，說明回歸方程擬合度較好，可準(zhǔn)確反映各因素與響應(yīng)值的關(guān)系，一次項(xiàng)A、B、C、D對飲料感官得分的影響均極顯著（P＜0.01），二次項(xiàng)對感官得分的影響也均為極顯著（P＜0.01），而交互項(xiàng)AB、AC對感官得分的影響極顯著（P＜0.01），AD、BC、BD對感官得分的影響顯著（P＜0.05）；另從表中F值可知，各因素對飲料的感官品質(zhì)影響程度順序?yàn)椋簷幟仕嵊昧浚–）＞黨參多糖與枸杞多糖的水溶液體積比（A）＞黃原膠用量（D）＞蔗糖用量（B）。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the response surface experiment

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 4 The variance analysis of response surface experiment

2.2.2 響應(yīng)曲面分析

黨參枸杞運(yùn)動飲料配方中各因素的交互作用對飲料感官品質(zhì)的影響見圖5。響應(yīng)曲面越陡峭，說明感官得分（Y）受不同因素的交互作用影響越大。由圖5 可知，運(yùn)動飲料的感官得分與各影響因素之間具有明顯的拋物曲線關(guān)系，且隨著交互因素值的增大，感官得分呈先升高后降低趨勢。

圖5 各因素交互作用對飲料感官得分影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface methodology of the interaction of various factors on the sensory score of beverage

對二次多項(xiàng)回歸擬合方程進(jìn)行極值分析，確定黨參枸杞運(yùn)動飲料最佳配方為：黨參多糖與枸杞多糖的水溶液體積比為1∶2，蔗糖用量6%，檸檬酸用量0.5%，黃原膠用量0.3%（相對多糖混合液的百分比），此時感官得分最高預(yù)測值為86.12 分。對該優(yōu)化配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到飲料的感官得分為（86.53±1.29）分，與預(yù)測值相近，相對誤差僅為0.48%，表明該回歸模型可較好地預(yù)測黨參枸杞運(yùn)動飲料的最佳配方參數(shù)。

2.3 運(yùn)動飲料的質(zhì)量檢驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)最佳配方制得的黨參枸杞運(yùn)動飲料色澤均勻、棕黃透亮，酸甜適中，并有黨參與枸杞的香味，靜置后未有明顯沉淀與分層。

飲料的pH 為5.3，可溶性固形物含量14.2%，離心沉淀率為0.86%，微生物菌落總數(shù)＜10 CFU/mL，且未有大腸桿菌和其他致病菌被檢出。

2.4 體外抗氧化活性結(jié)果

通過體外自由基清除模型研究，分別比較黨參枸杞運(yùn)動飲料和0.2 mg/mL VC 對相同濃度（100 mg/L）的羥基自由基、超氧陰離子自由基與DPPH 自由基清除能力，結(jié)果見表5。黨參枸杞運(yùn)動飲料與0.2 mg/mL VC 對DPPH 自由基的清除率相近，且無顯著性差異，而運(yùn)動飲料對超氧陰離子自由基的清除率極顯著高于VC（P＜0.01），但對羥基自由基的清除能力明顯弱于VC（P＜0.01），表明黨參枸杞運(yùn)動飲料在體外具有一定的抗氧化性。

表5 不同物質(zhì)對三種自由基的清除率(n=6)Table 5 The radical removal rates of different substances on three types of free radicals(n=6)單位：%

3 結(jié)論

本研究以黨參、枸杞為原料，輔以蔗糖、黃原膠研制黨參枸杞復(fù)合運(yùn)動飲料。通過單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)確定運(yùn)動飲料的最佳配方為：40%黨參多糖與40%枸杞多糖水溶液體積比為1∶2，蔗糖用量6%，檸檬酸用量0.5%，黃原膠用量0.3%（相對多糖混合液的百分比），在此配方下制得的運(yùn)動飲料感官評分為86.53 分，產(chǎn)品呈棕黃透亮、色澤均勻，酸甜適中，并混有黨參與枸杞香味，靜置后未有明顯沉淀與分層。該飲料對羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH 自由基的清除率分別為73.75%、69.48%和71.55%，具有一定的體外抗氧化活性，從而在體育市場具有較好的推廣前景。