miR-21-5p靶向TGF-β1調(diào)節(jié)大鼠心肌細(xì)胞增殖和凋亡

史東東，張 棟，高剛利，李嬌嬌

(榆林市第一醫(yī)院心內(nèi)科一病區(qū)，陜西 榆林 719000)

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)會誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡水平，隨后發(fā)生的缺血性再灌注和氧化應(yīng)激也將進(jìn)一步促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[1]，從而導(dǎo)致心血管疾病加重并增加其病死率[2]。miRNA是一種非編碼單鏈RNA分子，由約21～23個核糖核苷酸組成，對轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)具有重要的調(diào)控作用[3]。大量研究表明，miRNA參與調(diào)控心肌細(xì)胞的增殖和凋亡[4]。如miR-21-5p通過抑制FASLG的表達(dá)水平，從而促進(jìn)大鼠心肌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡[5]。此外，大量研究表明[6]，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)在心肌細(xì)胞成纖維化中起到重要的調(diào)控作用，但TGF-β1對心肌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控尚未見文獻(xiàn)報道。故本文探討miR-21-5p通過TGF-β1對大鼠心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

大鼠心肌細(xì)胞H9c2購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American type culture collection,ATCC)。RPMI-1640、胎牛血清、青霉素、鏈霉素和脂質(zhì)體(lipofectamine)2000和免疫印跡一抗、二抗及蛋白提取試劑盒和SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒均購于上海優(yōu)寧維有限公司。miR-21-5p inhibitor/mimic和pcDNA-TGF-β1構(gòu)建于柏業(yè)貿(mào)易(上海)有限公司。RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于中國ambion公司。CCK-8試劑盒和Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于日本同仁公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠心肌細(xì)胞H9c2培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清)中，在培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中常規(guī)培養(yǎng)，每3 d傳代1次。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 胰酶消化對數(shù)期H9c2細(xì)胞(濃度為1×105個/孔)接種于24孔板。按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將miR-21-5p inhibitor、pcDNA-TGF-β1及miR-21-5p mimic+pcDNA-TGF-β1轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞中，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2、1% O2、94% N2)中培養(yǎng)，檢測報告基因活性，在開始轉(zhuǎn)染1 d后將細(xì)胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中，2 d后加入篩選抗生素，轉(zhuǎn)染后24 h，將細(xì)胞以≥1∶10的比例傳至新鮮培養(yǎng)基，次日加入選擇培養(yǎng)基。

1.2.3 RT-qPCR檢測miR-21-5p的表達(dá) TRIZOL試劑盒提取對照組，miR-21-5p inhibitor組及miR-21-5p mimic+pcDNA-TGF-β1組中H9c2細(xì)胞總RNA，并用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。引物序列見表1。內(nèi)參為U6，采用2-ΔΔCt法計算H9c2細(xì)胞中miR-21-5p的表達(dá)水平。反應(yīng)體系： 10 μL SYBR Green Mix、2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、上下游引物各0.5 μL、去離子水補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃變性5 min后，再94 ℃變性30 s，最后60℃退火30 s，總共40個循環(huán)。

表1 引物序列

1.2.4 Western blotting檢測TGF-β1的表達(dá) 收集對照組(NC組)、pcDNA-TGF-β1組及miR-21-5p mimic+pcDNA-TGF-β1組中H9c2細(xì)胞，參考蛋白提取試劑盒說明書提取H9c2細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行定量。取等量蛋白與上樣緩沖液混勻，95 ℃變性10 min后，采用10% SDS-PAGE分離蛋白，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉1 h后，4 ℃，一抗(1∶1 000)孵育過夜。次日去除一抗，TBST漂洗3次，加入二抗(1∶2 000),室溫?fù)u床孵育1 h，去除二抗，TBST漂洗3次。最后加入化學(xué)發(fā)光底物，在凝膠成像系統(tǒng)中顯影，用Image J進(jìn)行條帶灰度值分析。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-21-5p和TGF-β1的靶向關(guān)系 首先采用TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-21-5p的潛在靶向蛋白。將野生型和突變型TGF-β1-3′-UTR靶向區(qū)域構(gòu)建至pGLO-basic載體中，然后分別與miR-21-5p mimic和miR-NC共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞。參考雙熒光素酶試劑盒說明書，以海腎熒光值作為內(nèi)參，采用酶標(biāo)儀檢測熒光素酶活性。每個樣品中會有3個數(shù)值；RLU1-螢火蟲熒光酶素酶反應(yīng)強(qiáng)度；RLU2-內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度，計算2組數(shù)據(jù)比值，即RLU1/ RLU2。

1.2.6 CCK-8檢測H9c2細(xì)胞增殖情況 取對照組、miR-21-5p inhibitor組、pcDNA-TGF-β1組及miR-21-5p mimic+pcDNA-TGF-β1組H9c2細(xì)胞，96孔板中每孔接種5×103個細(xì)胞，設(shè)置三個復(fù)孔，加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基90 μL培養(yǎng)。分別于24、48、72、96 h行CCK8檢測，參考說明書每孔加入10 μL CCK8，37 ℃，孵育2 h。使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度(OD值)，并利用各時間點(diǎn)的吸光度繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI雙染檢測H9c2細(xì)胞凋亡水平 取對照組、miR-21-5p inhibitor組、pcDNA-TGF-β1組及miR-21-5p mimic+pcDNA-TGF-β1組H9c2細(xì)胞，并用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞一次，2 000 rpm離心10 min。加入300 μL去離子水稀釋的Binding Buffer(1×Binding Buffer)懸浮細(xì)胞后，加入5 μL Annexin V-FITC，避光室溫孵育15 min，然后加入5 μL PI進(jìn)行染色，補(bǔ)加200 μL 1×Binding Buffer上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，單因素方差分析進(jìn)行多組間比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 miR-21-5p表達(dá)抑制對H9c2細(xì)胞的影響

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-21-5p inhibitor組H9c2細(xì)胞中miR-21-5p的表達(dá)水平顯著下降(P<0.01，圖1A)。CCK-8檢測結(jié)果顯示，miR-21-5p inhibitor組中H9c2細(xì)胞活力顯著低于NC組(P<0.05，圖1B)。Annexin V-FITC/PI雙染檢測結(jié)果顯示，miR-21-5p inhibitor組中H9c2細(xì)胞的凋亡水平顯著高于NC組(P<0.01，圖1C)。由此可知，miR-21-5p表達(dá)抑制后使H9c2細(xì)胞增殖受到抑制并誘導(dǎo)其凋亡。

圖1 miR-21-5p對H9c2細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.2 miR-21-5p靶向負(fù)調(diào)控TGF-β1的表達(dá)水平

TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示，TGF-β1是miR-21-5p的潛在靶基因(圖2A)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-21-5p顯著抑制野生型TGF-β1的表達(dá)水平(P<0.05，圖2B)，且miR-21-5p組中突變型TGF-β1的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖2B)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-21-5p顯著抑制H9c2細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)水平(P<0.05，圖2C)。由此可知，TGF-β1是miR-21-5p的靶基因，且抑制TGF-β1的表達(dá)水平。

2.3 miR-21-5p通過TGF-β1促進(jìn)H9c2細(xì)胞增殖并抑制其凋亡

Western blotting檢測結(jié)果顯示，pcDNA-TGF-β1組中TGF-β1表達(dá)水平顯著高于NC組(P<0.05，圖3A)，且pcDNA-TGF-β1+miR-21-5p mimics組中TGF-β1表達(dá)水平低于pcDNA-TGF-β1組(P<0.05，圖3A)。CCK-8試劑盒檢測結(jié)果顯示，pcDNA-TGF-β1組中H9c2細(xì)胞活力顯著低于NC組(P<0.05，圖3B)，且pcDNA-TGF-β1+miR-21-5p mimics組中H9c2細(xì)胞活力高于pcDNA-TGF-β1組(P<0.05，圖3B)。Annexin V-FITC/PI雙染檢測結(jié)果顯示，pcDNA-TGF-β1組中H9c2細(xì)胞凋亡水平顯著高于NC組(P<0.01，圖3C)，且pcDNA-TGF-β1+miR-21-5p mimics組中H9c2細(xì)胞凋亡水平低于pcDNA-TGF-β1組(P<0.05，圖3C)。由此可知，過表達(dá)TGF-β1顯著抑制H9c2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

圖2 miR-21-5p和TGF-β1的靶向關(guān)系

圖3 miR-21-5p通過調(diào)控TGF-β1的表達(dá)水平對H9c2細(xì)胞增殖和凋亡的影響

3 討論

心血管疾病是危害人類健康的主要疾患之一，具有發(fā)病率及病死率高等特點(diǎn)。AMI或者其他的心臟病會導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量下降，進(jìn)一步，心肌細(xì)胞被漸進(jìn)性成纖維細(xì)胞替換，從而造成心肌肥大和左心室擴(kuò)張，進(jìn)而導(dǎo)致心臟功能下降，最終誘發(fā)心力衰竭而危及生命[7]。盡管，近些年的急診PCI技術(shù)發(fā)展和廣泛應(yīng)用使得急性AMI的死亡率明顯下降，但由于成年心臟心肌細(xì)胞幾乎沒有再生能力，從而最終會導(dǎo)致心力衰竭[8]。因此維持心肌細(xì)胞正常的結(jié)構(gòu)和功能對于急性心肌梗死臨床治療的預(yù)后至關(guān)重要。

miRNA是由約21～23個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA分子，主要通過轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控參與疾病的發(fā)生發(fā)展[9]。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通路在心肌細(xì)胞的增殖和凋亡中起著重要的調(diào)控作用。如，miR-24-3p通過抑制Keap1/Nrf2通路，從而促進(jìn)小鼠心肌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡[10]；高糖誘導(dǎo)miR-144表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而抑制CTRP3/JNK信號通路，從而抑制AC16心肌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[4]；間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體miR-21-5p通過PI3K信號通路上調(diào)心肌細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡[11]；此外，Tang等[5]發(fā)現(xiàn)，PGE1通過上調(diào)心肌細(xì)胞中miR-21-5p的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制FASLG促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，敲降miR-21-5p能夠顯著抑制心肌H9c2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，該結(jié)果與Tang等[5]人研究一致，且本研究通過TargetScan數(shù)據(jù)庫和雙熒光素酶報告基因發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p能夠靶向負(fù)調(diào)控TGF-β1的表達(dá)水平。

TGF-β1是一種多效性和多向性的細(xì)胞因子，可通過自分泌或旁分泌的方式與細(xì)胞表面的受體信號進(jìn)行應(yīng)答，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)行為[12]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在心肌細(xì)胞增殖、凋亡和成纖維化中扮演著重要的角色。如，β3-AR通過激活PKG/JNK/c-Jun信號通路上調(diào)TGF-β1的表達(dá)水平，從而抑制心肌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[13]。RyR-2上調(diào)心肌細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)水平，從而TGF-β1通過旁分泌機(jī)制促進(jìn)了心臟成纖維細(xì)胞的膠原形成，進(jìn)而導(dǎo)致心肌肥大和心肌收縮功能異常[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TGF-β1后，H9c2心肌細(xì)胞增殖水平顯著上升，此外，其凋亡水平下調(diào)，同時過表達(dá)miR-21-5p和TGF-β1能夠恢復(fù)心肌H9c2細(xì)胞增殖和凋亡能力。

綜上，本研究探討了miR-21-5p通過TGF-β1對心肌H9c2細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)制。研究還發(fā)現(xiàn)，TGF-β1是miR-21-5p的靶基因，且miR-21-5p通過下調(diào)TGF-β1的表達(dá)水平，從而促進(jìn)心肌H9c2細(xì)胞增殖并抑制其凋亡。