痰誘導(dǎo)涂片COPD 分型與急性加重期患者肺功能及炎癥因子的關(guān)系

蔡曉盛 陳芒芒 龔昌要 池瓊 潘景業(yè)

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary diseases，COPD）病程長，病情復(fù)雜，且易反復(fù)發(fā)作。據(jù)WHO 估計，全世界約有3.28 億COPD 患者，到2030年COPD 將成為全球第三大死亡原因[1]。炎癥細(xì)胞在肺部聚集并被激活被認(rèn)為是導(dǎo)致COPD 慢性炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)[2-3]。近年來有學(xué)者將痰誘導(dǎo)涂片技術(shù)用于評估COPD 急性加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD）的疾病嚴(yán)重程度，并逐漸發(fā)現(xiàn)其在評估氣道炎癥細(xì)胞及炎癥因子中的重要性，為COPD 的診斷及治療提供了重要的參考價值[3-7]?；谡T導(dǎo)痰中炎癥細(xì)胞的種類及數(shù)量不同，可將AECOPD 患者分為嗜酸性粒細(xì)胞型（EOS型）、中性粒細(xì)胞型（NE 型）、粒細(xì)胞缺乏型（AGR 型）、混合粒細(xì)胞型（MIX 型）。本研究對基于痰誘導(dǎo)涂片的COPD 分型與AECOPD 患者肺功能指標(biāo)及炎癥因子的相關(guān)性進(jìn)行分析，評估不同分型患者對治療的反應(yīng)性，為AECOPD 患者盡早開展個性化臨床治療及對預(yù)后評估提供參考依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016 年6 月至2017 年1 月溫州市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科收治的AECOPD 患者122 例作為研究對象，其中男65 例，女57 例；身高（159.8±6.1）cm；體重（67.3±9.4）kg；年齡44～79（62.7±5.2）歲；病程5～13（8.41±1.24）年。AECOPD 診斷標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013 年修訂版）》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：患者均已確診為COPD，短期內(nèi)出現(xiàn)急性加重，咳嗽、咳痰增多或痰液呈膿性、呼吸困難，超出日常的變異，排除心力衰竭等其他可能病因，并需要改變藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重肝腎功能不全、內(nèi)分泌系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病等患者；（2）肺癌、活動性肺結(jié)核及肺炎、嚴(yán)重支氣管擴(kuò)張、支氣管哮喘患者；（3）近期嚴(yán)重外傷、手術(shù)患者；（4）無法進(jìn)行痰誘導(dǎo)、肺功能檢測的患者及不愿參與研究的患者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 痰誘導(dǎo)及涂片染色 所有患者入院后48 h 內(nèi)進(jìn)行痰誘導(dǎo)及肺功能檢測。操作方法：（1）向患者講解痰誘導(dǎo)產(chǎn)生的不適以及痰誘導(dǎo)后會產(chǎn)生過量的黏液，誘導(dǎo)前將患者的基本資料（包括身高、體重）輸入電腦中，然后按照美國胸科協(xié)會指南檢測患者的肺功能指標(biāo)[包括第一秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1）、用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）]并記錄。（2）通過儲霧罐裝置吸入沙丁胺醇2噴[規(guī)格：100 μg/支，批號：16110012/B，葛蘭素史克制藥（蘇州）有限公司]，10 min 后第2 次測量患者的肺功能指標(biāo)并記錄。（3）囑患者平靜呼吸時吸入超聲霧化后的3%氯化鈉溶液7 ml，每次吸入后鼓勵患者積極咳嗽，清理鼻咽腔后收集痰液。（4）再測FEV1，若FEV1下降不超過10%則繼續(xù)操作；若FEV1下降10%～20%，則再次吸入沙丁胺醇2 噴；如果再次吸入沙丁胺醇后沒有改善則應(yīng)終止試驗(yàn)，如果有改善則可繼續(xù)痰誘導(dǎo)。（5）必要時重復(fù)以上步驟，結(jié)束誘導(dǎo)條件為誘導(dǎo)所得的標(biāo)本已足夠?qū)嶒?yàn)需要。（6）在30 min 內(nèi)結(jié)束誘導(dǎo)過程，結(jié)束后復(fù)測FEV1。（7）在誘導(dǎo)過程中患者出現(xiàn)胸悶、咳嗽等不適癥狀應(yīng)立即停止誘導(dǎo)。（8）測量痰液重量后，加入4 倍痰液重量的0.1%二硫蘇糖醇（批號：3577B051，卡邁舒上海生物科技有限公司），反復(fù)吹打，震蕩5 min 后，在37 ℃水浴15 min，經(jīng)無菌紗布過濾后，1 000 r/min 離心5 min，取離心沉淀物進(jìn)行細(xì)胞涂片染色。

1.2.2 AECOPD 分型標(biāo)準(zhǔn)[5]痰涂片染色后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)、分類，共計數(shù)400 個炎癥細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞；同時記錄鱗狀上皮細(xì)胞，鱗狀上皮細(xì)胞比例＞80%被認(rèn)為痰標(biāo)本污染。標(biāo)本評價：標(biāo)本評分＞18 分為良好，8 分≤標(biāo)本評分≤18 分為中等，標(biāo)本評分＜8 分為差。痰涂片評分＞18 分可進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)分型。痰涂片評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。依據(jù)痰樣本中嗜酸性粒細(xì)胞百分比是否＞2.5%以及中性粒細(xì)胞百分比是否＞61%，將AECOPD患者分為EOS 型（嗜酸性粒細(xì)胞百分比＞2.5%，中性粒細(xì)胞百分比≤61%）；NE 型（嗜酸性粒細(xì)胞百分比≤2.5%，中性粒細(xì)胞百分比＞61%）；AGR 型（嗜酸性粒細(xì)胞百分比≤2.5%，中性粒細(xì)胞百分比≤61%）；MIX 型（嗜酸性粒細(xì)胞百分比＞2.5%，中性粒細(xì)胞百分比＞61%）。

表1 誘導(dǎo)痰涂片評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 血常規(guī)及炎癥因子檢測 所有患者于入院后24 h內(nèi)抽取空腹靜脈血待檢。采用全自動血細(xì)胞計數(shù)分析儀（型號：AU-680，貝克曼庫爾特生物科技蘇州有限公司）檢測血常規(guī)；采用流式細(xì)胞儀（型號：FACSCalibur，美國BD 公司）檢測血清活性氧（reactive oxygen species，ROS）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等氧化/抗氧化相關(guān)指標(biāo)；采用ELISA 法檢測IL-8、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）和TNF-α，嚴(yán)格按照說明書的操作步驟完成。

1.2.4 臨床治療方法及療效評價 所有患者給予靜脈滴注廣譜抗生素[阿莫西林-克拉維酸針1.2 g，1 次/8 h（規(guī)格：1.2 g/支，批號：F6125508，華北制藥股份有限公司）或哌拉西林舒巴坦鈉針4.5 g，1 次/8 h（規(guī)格：4.5 g/支，批號：161203，蘇州二葉制藥有限公司）或莫西沙星針0.4 g，1 次/d（規(guī)格：0.4 g/250 ml/瓶，批號：BXHGJU3，拜耳先靈醫(yī)藥保健股份公司）]；并予霧化吸入支氣管擴(kuò)張劑。每天完成臨床COPD 問卷（clinical COPD questionnaire，CCQ）評分，并記錄患者急性加重期到恢復(fù)期（病情與加重期前的相似）的時間（癥狀恢復(fù)時間）、住院時間。療效標(biāo)準(zhǔn)[5]：有效為CCQ 評分達(dá)到恢復(fù)期；失敗為CCQ 評分未達(dá)到恢復(fù)期，規(guī)范使用抗生素7 d 后仍需要繼續(xù)使用或需要更改抗生素。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；方差不齊時，兩兩比較采用Tamhane's T2 檢驗(yàn)；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson 相關(guān)分析不同分型AECOPD 患者炎癥因子水平與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AECOPD 患者分型結(jié)果 122 例AECOPD 患者中，EOS 型25 例，NE 型51 例，AGR 型35 例，MIX 型11 例。

2.2 不同分型AECOPD 患者外周血及誘導(dǎo)痰嗜酸性粒細(xì)胞百分比和中性粒細(xì)胞百分比比較 不同分型AECOPD 患者外周血及誘導(dǎo)痰嗜酸性粒細(xì)胞百分比和中性粒細(xì)胞百分比比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，NE 型及MIX 型患者外周血及誘導(dǎo)痰中性粒細(xì)胞百分比均高于EOS 型及AGR 型患者（均P＜0.05），而EOS 型及MIX 型患者外周血及誘導(dǎo)痰嗜酸性粒細(xì)胞百分比均高于NE 型及AGR 型患者（均P＜0.05），見表2。

表2 不同分型AECOPD 患者外周血及誘導(dǎo)痰嗜酸性粒細(xì)胞百分比和中粒細(xì)胞百分比比較（%）

2.3 不同分型AECOPD 患者肺功能指標(biāo)比較 不同分型AECOPD 患者FEV1和FEV1/FVC 比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，NE型及MIX 型患者FEV1均低于EOS 型及AGR 型（均P ＜0.05），NE 型患者FEV1/FVC 均低于EOS 型、AGR 型及MIX 型（均P＜0.05），見表3。

表3 不同分型AECOPD 患者肺功能指標(biāo)比較（%）

2.4 不同分型AECOPD 患者炎癥因子比較 不同分型AECOPD 患者ROS、SOD、IL-8、GM-CSF 及TNF-α比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，NE 型及MIX 型患者血清ROS、IL-8、GMCSF 及TNF-α 水平均高于EOS 型及AGR 型，血清SOD 活性均低于EOS 型及AGR 型（均P＜0.05）；且NE型患者血清ROS 水平高于MIX 型，SOD 活性低于MIX 型（均P＜0.05），見表4。

2.5 不同分型AECOPD 患者炎癥因子水平與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性分析 Pearson 相關(guān)分析顯示，不同分型AECOPD 患者血清ROS、IL-8、GM-CSF 及TNF-α 水平與FEV1及FEV1/FVC 均呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05），血清SOD 活性與FEV1及FEV1/FVC 均呈正相關(guān)（均P＜0.05），見表5～6。

2.6 不同分型AECOPD 患者臨床療效比較 不同分型AECOPD 患者癥狀恢復(fù)時間、住院時間和藥物治療失敗率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，NE 型及MIX 型患者癥狀恢復(fù)時間、住院時間均長于EOS 型及AGR 型，治療失敗率均高于EOS 型及AGR 型（均P＜0.05），見表7。

3 討論

COPD 發(fā)病原因或許和肺部的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[9]。研究顯示COPD 以遍及氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管的慢性炎癥為特征，這種炎癥反應(yīng)常以中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在肺內(nèi)浸潤增多為主要表現(xiàn)[10]；另有研究顯示，部分AECOPD 患者氣道內(nèi)的嗜酸性粒細(xì)胞也升高明顯[3]，提示炎癥反應(yīng)可能是導(dǎo)致COPD 發(fā)生的重要原因[11-12]。本研究對不同分型AECOPD 患者炎癥因子水平進(jìn)行比較，結(jié)果提示AECOPD 患者中炎癥因子可能在慢性肺損傷過程中起直接或間接作用，其結(jié)果與部分學(xué)者的研究一致[13-14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子IL-8與α1 抗胰蛋白酶可相互配合產(chǎn)生趨化活性，打破肺的免疫防御系統(tǒng)，加強(qiáng)炎癥反應(yīng)和細(xì)菌感染，并促進(jìn)COPD 的發(fā)展[15]。此外IL-8、TNF-α、GM-CSF 等還可活化中性粒細(xì)胞并釋放多種炎癥介質(zhì)，產(chǎn)生黏膜水腫、白細(xì)胞浸潤及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等多種效應(yīng)，同時這些炎癥因子還與氣道平滑肌增厚、氣道持續(xù)損傷及氣道重塑有關(guān)，并可能導(dǎo)致COPD 的發(fā)生[13-14]。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)氧化/抗氧化失衡在慢性肺損傷過程中也可能起到一定作用，這與倪涵晨等[16]的研究結(jié)果一致。倪涵晨等[16]認(rèn)為除了炎癥外，氧化/抗氧化平衡對COPD 的發(fā)病具有重要作用，ROS 包含超氧陰離子（O2-）、過氧化氫等氧化物，具有氧化作用，可對肺組織產(chǎn)生氧化損傷，已有研究證實(shí)，ROS 可通過多方面途徑參與COPD 的發(fā)生、發(fā)展[17]。而SOD 可以通過清除O2-對肺組織起到保護(hù)作用[18]。由此可見，氧化/抗氧化失衡可直接損傷肺功能導(dǎo)致COPD 疾病的發(fā)生、發(fā)展[16]。

表4 不同分型AECOPD 患者炎癥因子比較

表5 不同分型AECOPD 患者炎癥因子水平與FEV1 的相關(guān)性分析

表6 不同分型AECOPD 患者炎癥因子水平與FEV1/FVC 的相關(guān)性分析

表7 不同分型AECOPD 患者臨床療效比較

眾所周知，盡早評估AECOPD 患者的疾病嚴(yán)重程度可為治療提供重要參考依據(jù)[19]。臨床上肺功能檢查在COPD 的診斷、病情評估、預(yù)后及治療反應(yīng)等方面均有重要意義，但急性加重期檢查結(jié)果也往往不夠準(zhǔn)確，甚至部分患者難以完成該檢查，所以該時期不建議對患者進(jìn)行肺功能檢查[20]。近年來臨床上應(yīng)用痰誘導(dǎo)涂片技術(shù)評估AECOPD 疾病嚴(yán)重程度具有一定的價值，并為COPD 的診斷及其治療提供了重要的參考價值[3-5]。該技術(shù)具有很好的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，對氣道疾病的診斷和鑒別診斷、藥物療效觀察及其機(jī)制探討有一定意義[21]，這種非侵入性定量定性檢測氣道炎癥的方法安全、可靠、簡便、不受病情限制、患者易于接受[3]。本研究對痰液進(jìn)行誘導(dǎo)后涂片染色，并根據(jù)嗜酸性粒細(xì)胞百分比和中性粒細(xì)胞百分比進(jìn)行分型，對不同分型患者肺功能指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果提示AECOPD 患者痰誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞數(shù)量升高，與疾病的嚴(yán)重程度存在一定的關(guān)系，本研究結(jié)果與部分學(xué)者的研究一致[3，5]。因此在AECOPD 期間可用痰誘導(dǎo)涂片技術(shù)來評估病情嚴(yán)重程度，為盡早開展臨床治療提供參考。此外，本研究對不同分型AECOPD 患者的療效觀察發(fā)現(xiàn)，NE 型和MIX 型患者對治療的反應(yīng)性可能較差，部分患者使用抗生素需要超過7 d，對于這部分患者應(yīng)盡早引起重視，盡早給予制定個性化治療方案，使患者最大獲益。

本研究優(yōu)點(diǎn)在于屬于前瞻性研究，對臨床治療有明確的指導(dǎo)意義；在AECOPD 期因各種原因?qū)е路喂δ軝z查缺失，可以考慮使用痰誘導(dǎo)涂片結(jié)果暫時代替肺功能來評估病情嚴(yán)重程度，為盡早開展臨床治療提供參考。本研究的不足之處在于樣本量較少,對最終結(jié)果的有效性產(chǎn)生一定影響，因此有待于擴(kuò)大樣本量來進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，根據(jù)痰誘導(dǎo)涂片結(jié)果對AECOPD 患者進(jìn)行分型，其中NE 型和MIX 型COPD 患者的肺功能較差、氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡較為嚴(yán)重、對治療反應(yīng)性較差。這種分型可為AECOPD 患者個性化治療方案的制定提供參考。