基于生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)分析FEN1基因在乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義

李镠祎 曹奔奔 張婷 王晨 楊紅健 戴五敏 蔡昀方

乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其死亡率居于女性惡性腫瘤的第二位[1]。近年來(lái)，隨著生活方式、飲食習(xí)慣等多因素的改變，全球乳腺癌的發(fā)生率和死亡率都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在過(guò)去的40 年中，東亞女性的發(fā)病率更是迅速增加[2-3]。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展常涉及基因突變、基因表達(dá)異常、染色體畸變等遺傳學(xué)改變。瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶1（flap endonuclease 1,FEN1）基因是BRCA2 合成致死（BRCA2 synthetic lethality,B2SL）基因的一種，編碼一種結(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切酶，參與岡崎片段成熟、DNA 重組、細(xì)胞凋亡DNA 片段化和長(zhǎng)片段堿基切除修復(fù)等過(guò)程，在維持基因組穩(wěn)定性和完整性方面發(fā)揮著重要作用[4-5]。FEN1 基因的功能缺陷（以體細(xì)胞突變和多態(tài)性形式出現(xiàn)）近來(lái)已被證明可導(dǎo)致自身免疫疾病、慢性炎癥以及促進(jìn)癌癥的發(fā)生、發(fā)展。研究證明，F(xiàn)EN1 表達(dá)水平在前列腺癌、卵巢癌、肺癌等多種惡性腫瘤中增高，其中乳腺癌和子宮癌的表達(dá)水平增高更為明顯，此外，F(xiàn)EN1 對(duì)于癌細(xì)胞的快速增殖至關(guān)重要，F(xiàn)EN1 基因的變異可降低女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，將FEN1 基因作為一個(gè)靶向治療的靶點(diǎn)可以阻止乳腺癌進(jìn)展[6-8]。本研究主要通過(guò)檢索Oncomine、基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析（gene expression profiling interactive analysis,GEPIA）、人類蛋白質(zhì)圖譜（human protein atlas,HPA）、腫瘤單細(xì)胞（CancerSEA）數(shù)據(jù)庫(kù)和Kaplan-Meier Plotter 在線工具分析FEN1 基因在乳腺癌中的表達(dá)及其與臨床病理分期、細(xì)胞功能狀態(tài)、預(yù)后的相關(guān)性，為進(jìn)一步探討FEN1 基因在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 從Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)提取數(shù)據(jù) Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.oncomine.org/）是目前世界上最大的腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)及數(shù)據(jù)整合提取的平臺(tái)，其中一項(xiàng)重要功能就是進(jìn)行腫瘤組織和正常組織的基因差異表達(dá)分析[9-10]。研究者可根據(jù)自己的需要設(shè)定數(shù)據(jù)挖掘的條件，本研究的檢索條件如下：（1）Gene：FEN1；（2）Analysis Type:Cancer vs Normal Analysis；（3）數(shù)據(jù)集篩選標(biāo)準(zhǔn)P 值＜0.0001，fold change 2，gene rank=Top 10%。

1.2 從GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)提取數(shù)據(jù) GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn/）是在腫瘤基因圖譜（the cancer genome atlas,TCGA）與基因型-組織表達(dá)（the genotypetissue expression,GTEx）這兩大轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)基礎(chǔ)上建立的可視化癌癥大數(shù)據(jù)分析平臺(tái)[10-11]。檢索條件如下：（1）“Expression DIY”框中點(diǎn)擊“Boxplot”；（2）Gene：FEN1；（3）Cancer name：BRCA；比較乳腺癌組織和正常乳腺組織的表達(dá)量。另一方面：（1）“Expression DIY”框中點(diǎn)擊“Stage plot”；（2）Gene：FEN1；（3）Cancer name：BRCA；比較不同分期的乳腺癌FEN1 表達(dá)量。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 從HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)提取數(shù)據(jù) HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.proteinatlas.org/）是一個(gè)基于免疫組化的大型蛋白質(zhì)表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，包含24 000 種蛋白質(zhì)在腫瘤組織、正常組織和細(xì)胞中的分布信息，通過(guò)免疫組化技術(shù)分析比較正常組織和腫瘤組織中蛋白的表達(dá)水平[12]。在HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)“Tissue Atlas”和“Pathology Atlas”中輸入FEN1，分別選擇“Breast”和“Breast cancer”，生成免疫組化圖，可視化乳腺癌組織和正常乳腺組織中FEN1基因編碼蛋白的表達(dá)水平。

1.4 Kaplan-Meier Plotter 在線分析 Kaplan-Meier Plotter 在線分析工具（http://www.kmplot.com/）是一種包括基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)的在線分析工具[13]。利用Kaplan-Meier Plotter 在線分析工具對(duì)乳腺癌患者總生存率（overall survival，OS）進(jìn)行分析，設(shè)置條件：（1）Cancer type：Breast cancer；（2）Gene：FEN1；（3）Survival：OS。log-rank 檢驗(yàn)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 從CancerSEA 數(shù)據(jù)庫(kù)提取數(shù)據(jù) CancerSEA 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/）是一個(gè)單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)，它總共包含來(lái)自25 種癌癥的41 900個(gè)癌細(xì)胞，可全面探索癌細(xì)胞在單細(xì)胞水平上的功能狀態(tài)[14]。檢索條件如下：（1）Gene：FEN1；（2）Cancer Types:Breast cancer。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 乳腺癌組織與正常乳腺組織中FEN1 基因表達(dá)比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；不同臨床病理分期乳腺癌患者FEN1 基因表達(dá)水平比較采用單因素方差分析；FEN1 基因表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系采用Kaplan-Meier 生存曲線，兩組生存率比較采用logrank 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FEN1 基因在不同類型腫瘤中的表達(dá) 按照預(yù)設(shè)篩選條件進(jìn)行檢索，Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)中共收集384 項(xiàng)關(guān)于FEN1 基因在不同類型腫瘤組織與正常組織中表達(dá)的比較研究結(jié)果。其中FEN1 基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的研究結(jié)果共61 項(xiàng)，F(xiàn)EN1 基因呈高表達(dá)的研究有58 項(xiàng)，呈低表達(dá)的研究只有3 項(xiàng)。另外，證明乳腺癌組織中FEN1 基因表達(dá)升高的研究有8 項(xiàng)，研究數(shù)量?jī)H次于肺癌居第二（圖1，見(jiàn)插頁(yè)）。

圖1 瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶1（FEN1）基因在Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)中所有腫瘤類型中的表達(dá)情況（紅色表示上調(diào)，藍(lán)色表示下調(diào)，顏色越深表示顯著性越高）

2.2 FEN1 基因在乳腺癌中的表達(dá)情況 經(jīng)過(guò)篩選，GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)中，乳腺癌組織中FEN1 基因的轉(zhuǎn)錄水平與正常乳腺組織相比明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)圖2a。此外，通過(guò)檢索HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了乳腺癌組織和正常乳腺組織中FEN1 的免疫組化染色圖像（圖2b），免疫組化結(jié)果顯示乳腺癌組織中FEN1 基因的表達(dá)水平明顯高于正常乳腺組織。

圖2 瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶1（FEN1）基因在乳腺癌中的表達(dá)情況[（a：基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析（GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)中FEN1 基因在乳腺癌與正常乳腺組織中的表達(dá)差異；b：人類蛋白質(zhì)圖譜（HPA）數(shù)據(jù)庫(kù)中FEN1 基因在乳腺癌與正常乳腺組織中的免疫組化分析；免疫組化染色，×200]

2.3 FEN1 基因的表達(dá)水平與乳腺癌臨床病理分期的關(guān)系 在GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)中分析FEN1 基因表達(dá)水平與乳腺癌臨床病理分期的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同臨床病理分期乳腺癌患者FEN1 基因表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.68，P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析（GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)中瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶1（FEN1）基因在乳腺癌不同臨床病理分期中的表達(dá)情況

2.4 FEN1 基因表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier Plotter 在線工具分析顯示:乳腺癌患者FEN1 基因不同表達(dá)水平與預(yù)后具有相關(guān)性。從總體來(lái)看，F(xiàn)EN1 基因高表達(dá)組患者OS 低于低表達(dá)組（P＜0.05）（圖4a）。亞組分析：（1）淋巴結(jié)：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者FEN1 基因低表達(dá)組OS 高于高表達(dá)組（P＜0.05），但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者低表達(dá)組和高表達(dá)組OS 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）（圖4b-c）；（2）免疫組化：免疫組化結(jié)果分別為雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽(yáng)性、ER 陰性、孕激素受體（progesterone receptor，PR）陽(yáng)性、PR 陰性、人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽(yáng)性和Her2陰性的患者，ER 陽(yáng)性和HER2 陰性患者FEN1 基因低表達(dá)組OS 高于高表達(dá)組（均P＜0.05）（圖4d、4i），而ER 陰性、PR 陽(yáng)性、PR 陰性、HER2 陽(yáng)性患者低表達(dá)組和高表達(dá)組OS 比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）（圖4e-h）；（3）分子分型：Luminal A 型、Luminal B 型患者FEN1 基因低表達(dá)組OS 高于高表達(dá)組（均P＜0.05）（圖5a-b），HER2 過(guò)表達(dá)型和基底細(xì)胞（Basal-like）型患者中FEN1 基因低表達(dá)組和高表達(dá)組間OS 比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）（圖5c-d）。

2.5 FEN1 基因在單個(gè)細(xì)胞里的功能 CancerSEA 數(shù)據(jù)庫(kù)的功能相關(guān)分析表明，在單個(gè)乳腺癌細(xì)胞中FEN1基因表達(dá)與多種細(xì)胞功能狀態(tài)相關(guān)，其中與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、分化、DNA 損傷、DNA 修復(fù)、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞增殖和侵襲均呈正相關(guān)（均P＜0.05），與血管生成、組織缺氧、炎癥、細(xì)胞沉默和干細(xì)胞性均呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05）（圖6）。進(jìn)一步對(duì)FEN1 基因與乳腺癌細(xì)胞功能狀態(tài)的相關(guān)性進(jìn)行分析，Braune 等[15]和Jordan 等[16]兩項(xiàng)研究均顯示FEN1 基因的表達(dá)與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、DNA 損傷、DNA 修復(fù)、EMT、癌細(xì)胞侵犯、細(xì)胞增殖呈正相關(guān)，其中r 值較高的有細(xì)胞周期、DNA 損傷、DNA 修復(fù)，分別為0.70/0.65、0.51/0.65、0.69/0.69（圖7，見(jiàn)插頁(yè)）。

圖4 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)中瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶1（FEN1）基因表達(dá)水平與不同乳腺癌人群預(yù)后的關(guān)系[a：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性人群；b：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性人群；c：雌激素受體（ER）陽(yáng)性人群；d：ER 陰性人群；e：孕激素受體（PR）陽(yáng)性人群；f：PR 陰性人群；g：人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2（HER2）陽(yáng)性人群；h：HER2 陰性人群]

圖5 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)中瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶1（FEN1）基因表達(dá)水平與不同分型的乳腺癌預(yù)后之間的關(guān)系[a：Luminal A 型；b：Luminal B 型；c：人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2（HER2）型；d：基底細(xì)胞（Basal-like）型]

圖6 腫瘤單細(xì)胞（CancerSEA）數(shù)據(jù)庫(kù)中瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶1（FEN1）基因表達(dá)與不同惡性腫瘤細(xì)胞功能狀態(tài)的相關(guān)性

圖7 腫瘤單細(xì)胞（CancerSEA）數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌細(xì)胞瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶1（FEN1）基因表達(dá)與癌細(xì)胞功能狀態(tài)的相關(guān)性

3 討論

隨著治療方式的不斷改進(jìn)，乳腺癌患者的預(yù)后得到了極大的改善，然而由于生活方式、飲食習(xí)慣等多方面的改變，乳腺癌的發(fā)病率仍呈明顯上升趨勢(shì)，是全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性的身心健康[17]。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，基因表達(dá)的異常在這一過(guò)程中起著重要作用，但是其具體機(jī)制目前仍未得到明確闡述。因此進(jìn)一步探索乳腺癌具體的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，挖掘有效的基因靶點(diǎn)對(duì)乳腺癌的診斷治療及預(yù)后評(píng)估具有重要的臨床意義。

FEN1 基因是重要的的抑癌基因，其編碼的FEN1是一種結(jié)構(gòu)特異性核酸酶，參與了長(zhǎng)片段堿基切除修復(fù)和DNA 復(fù)制過(guò)程中岡崎片段的成熟，此外FEN1 在DNA 修復(fù)、DNA 復(fù)制和其他多種DNA 代謝途徑中發(fā)揮作用，被認(rèn)為是維持基因穩(wěn)定和DNA 復(fù)制的關(guān)鍵酶[18]。He 等[7]研究證明FEN1 基因不僅在乳腺癌中過(guò)表達(dá)，并且對(duì)于乳腺癌細(xì)胞的快速增殖至關(guān)重要。當(dāng)乳腺癌細(xì)胞中的FEN1 基因被抑制時(shí)，可導(dǎo)致DNA 復(fù)制的延遲和未修復(fù)的DNA 中間體的積累，從而導(dǎo)致DNA 雙鏈的斷裂和細(xì)胞凋亡[19]。抑制FEN1 的活性，或許可以抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。臨床上使用的大多數(shù)化療藥物通過(guò)誘導(dǎo)DNA 損傷引起細(xì)胞凋亡，然而由于DNA 修復(fù)蛋白在癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)而導(dǎo)致的高效率DNA 修復(fù)顯著降低了藥物功效，癌細(xì)胞DNA 修復(fù)能力的提高可導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生[20-21]?；贔EN1 具有的DNA 修復(fù)功能，抑制FEN1 基因或許可以增加癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。鑒于FEN1 的DNA 復(fù)制和DNA 修復(fù)功能，將FEN1 基因作為治療靶點(diǎn)或許可以成為乳腺癌治療的有效策略。

本研究通過(guò)檢索Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EN1 基因在多種腫瘤組織中表達(dá)增高，如肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等。此外，通過(guò)檢索GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)，驗(yàn)證了乳腺癌組織中FEN1 基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于正常乳腺組織。通過(guò)檢索HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)，生成FEN1 免疫組化圖，可視化了乳腺癌組織和正常乳腺組織中FEN1 基因編碼蛋白的表達(dá)差異，驗(yàn)證了GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)論。通過(guò)進(jìn)一步檢索GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)不同臨床病理分期乳腺癌患者FEN1 基因表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，F(xiàn)EN1基因的表達(dá)水平，或許會(huì)隨著疾病的進(jìn)展發(fā)生變化，這有待進(jìn)一步研究。此外，通過(guò)Kaplan-Meier Plotter 在線分析顯示FEN1 基因高表達(dá)組患者OS 低于低表達(dá)組，進(jìn)一步亞組分析顯示：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性、ER 陽(yáng)性、HER2 陰性、Luminal A 型和Luminal B 型FEN1 基因低表達(dá)組患者OS 高于高表達(dá)組，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性、ER 陰性、PR 陽(yáng)性、PR 陰性、HER2 陽(yáng)性、HER2 過(guò)表達(dá)型和基底細(xì)胞型患者FEN1 基因高表達(dá)組與低表達(dá)組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行分析。FEN1 基因在生物細(xì)胞的DNA 代謝中扮演重要角色，參與DNA 復(fù)制和損傷修復(fù)過(guò)程，還能通過(guò)不同的調(diào)控機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)展及耐藥[22]，因此本研究通過(guò)CancerSEA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析FEN1 基因在單個(gè)細(xì)胞里的功能。分析表明在單個(gè)乳腺癌細(xì)胞中FEN1基因表達(dá)與多種細(xì)胞功能狀態(tài)相關(guān)，其中與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、分化、DNA 損傷、DNA 修復(fù)、EMT、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞增殖和侵襲均呈正相關(guān)，此外，CancerSEA 數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋的兩項(xiàng)研究均證明FEN1 基因的表達(dá)與細(xì)胞周期、DNA 損傷、DNA 修復(fù)均呈較高的正相關(guān)性。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析FEN1 基因在乳腺癌中高表達(dá)，與患者預(yù)后相關(guān)，并且與乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期、DNA 損傷和DNA 修復(fù)等細(xì)胞功能具有較高的相關(guān)性，F(xiàn)EN1 基因或許可以作為潛在的評(píng)估乳腺癌患者預(yù)后的標(biāo)志物和治療靶標(biāo)，為臨床乳腺癌的治療及基因靶向藥物的研制提供重要理論依據(jù)，對(duì)乳腺癌的預(yù)后具有重要的臨床意義。