杭州市5 279例新生兒耳聾基因突變篩查及突變攜帶者隨訪結(jié)果分析

梅瑾 王敏 王昊 何茶英 連結(jié)靜 傅婷婷 胡文勝

先天性耳聾是人類發(fā)病率較高的出生缺陷之一，尤其是在新生兒中多發(fā)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示該疾病在新生兒中的發(fā)病率為0.1%，其中一半的患兒與遺傳缺陷有關(guān)[1]。目前已知的耳聾相關(guān)并且已經(jīng)作為臨床篩查目標(biāo)的基因有GJB2、SCL26A4、GJB3、線粒體12SrRNA[2-3]。2012年北京市政府開展新生兒耳聾基因篩查民生項(xiàng)目，隨后成都、長治、南通、鄭州等城市也開展了新生兒遺傳性耳聾基因篩查工作[4-8]，促進(jìn)了先天性耳聾的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)等防治工作。然而，杭州地區(qū)新生兒耳聾基因篩查項(xiàng)目開展較遲，有關(guān)耳聾基因的突變率等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及相關(guān)研究報(bào)道較少。為此，本研究采集2018 年6 月至2019 年12 月在杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院出生的5 279 例新生兒足底血，提取DNA 并應(yīng)用微陣列芯片雜交法檢測4 個(gè)耳聾基因15 個(gè)位點(diǎn)，分析基因突變攜帶率和突變類型，結(jié)合新生兒聽力篩查結(jié)果，比較兩者相關(guān)性，對聽力篩查未通過的耳聾基因突變者進(jìn)行耳聾全基因測序診斷確定基因型，隨訪其聽力發(fā)育和干預(yù)情況，以評估聽力-耳聾基因聯(lián)合篩查在先天性耳聾早期診斷與干預(yù)中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018 年6 月至2019 年12 月本院出生的新生兒5 279 例，男嬰2 797 例，女嬰2 482 例；出生孕周37～41（39.03±0.97）周；體重2 500～4 100（3 300±50）g；新生兒父母均來自杭州轄區(qū)的11 個(gè)區(qū)、縣（市）。排除重度窒息、重度黃疸、明顯先天缺陷及出生后轉(zhuǎn)新生兒病房治療的患兒。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過，所有患兒監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 新生兒足底血采集 由兒?？茖I(yè)人員在新生兒出生72 h 內(nèi)，在監(jiān)護(hù)人知情同意并簽字下，按照《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范（2010 版）》和采血常規(guī)的要求，采集新生兒足底血，使用專用采血濾紙片制成2 個(gè)直徑≥8 mm 的血斑，充分滲透，自然晾干，獨(dú)立裝袋，送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行耳聾基因檢測。

1.2.2 常見耳聾基因突變篩查 采用打孔器得到3 mm直徑的干血斑，使用十五項(xiàng)遺傳性耳聾相關(guān)基因檢測試劑盒（成都博奧晶芯生物科技有限公司，國械注準(zhǔn)20173401343）進(jìn)行檢測。按試劑盒說明要求，使用核酸提取試劑盒提取新生兒干血斑中的DNA，與空白樣本、陰性對照及陽性對照一起進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后，使用微陣列芯片雜交法對標(biāo)本進(jìn)行4 個(gè)基因15 個(gè)位點(diǎn)的檢測[GJB2（c.35delG、c.235delC、c.176del16、c.299delAT），GJB3（c.538C＞T），SLC26A4（c.2168A＞G、c.919-2A＞G、c.1174A＞T、c.1226G＞A、c.1229C＞T、c.1975G＞C、c.2027T＞A、c.IVS15+5G＞A）和線粒體12SrRNA（m.1494C＞T、m.1555A＞G）]。對基因芯片篩查中出現(xiàn)突變位點(diǎn)的樣本使用Sanger 測序法進(jìn)行驗(yàn)證[3]。采血后2 周內(nèi)報(bào)告結(jié)果。篩查結(jié)果分為未突變、雜合突變、純合突變、復(fù)合雜合突變以及復(fù)合突變[9]。未突變?yōu)闄z測結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)與耳聾相關(guān)的基因突變或基因型，雜合突變?yōu)橥换蚶锇l(fā)現(xiàn)一種突變型，純合突變?yōu)橥换蚶锇l(fā)現(xiàn)兩種一樣的突變型，復(fù)合雜合突變?yōu)橥换蚶锇l(fā)現(xiàn)兩種不同突變型，復(fù)合突變?yōu)椴煌蚶锔饔幸环N突變型。對于線粒體12SrRNA 上同時(shí)出現(xiàn)的兩種突變，定義為線粒體異質(zhì)突變；線粒體12SrRNA 上僅一種突變，定義為線粒體均質(zhì)突變。

1.2.3 聽力篩查 由兒?？茖I(yè)人員采用“兩階段篩查法”，即初篩和復(fù)篩，將結(jié)果錄入醫(yī)院產(chǎn)時(shí)信息系統(tǒng)，本研究數(shù)據(jù)從產(chǎn)時(shí)信息系統(tǒng)中提取。嚴(yán)格按照國家衛(wèi)健委新生兒聽力篩查規(guī)范要求進(jìn)行，初次診斷性聽力評估在3 個(gè)月內(nèi)完成。初篩是在新生兒出生后滿48～72 h 使用畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射法（DPOAE）（德國麥科聽力儀器公司，MAICO Diagnostic GmbH ERO-SCAN 型）進(jìn)行聽力測試，如果新生兒單耳或雙耳沒有通過測試，則記錄為“未通過”。初篩未通過者產(chǎn)后42 d 至兒童保健門診應(yīng)用自動(dòng)判別聽性腦干誘發(fā)電位檢查法（AABR）（德國麥科聽力儀器公司，型號：MAICO Diagnostic GmbH MB11 型）復(fù)篩，若初篩和復(fù)篩兩次均未通過測試，列為耳聾高危人群。結(jié)合耳聾基因篩查與診斷情況，3 個(gè)月內(nèi)轉(zhuǎn)聽力診斷部門綜合評估聽覺能力，包括聽性腦干反應(yīng)（ABR）、聲導(dǎo)抗檢查及外耳道檢查等。

1.2.4 耳聾基因診斷與父母基因篩查驗(yàn)證 耳聾基因篩查結(jié)果由產(chǎn)前診斷中心辦公室專人管理，對新生兒耳聾基因突變攜帶者，電話通知其家長到本院遺傳咨詢門診接受遺傳咨詢和健康教育，在知情同意的情況下，對耳聾基因突變新生兒父母行耳聾基因篩查驗(yàn)證，評估遺傳因素的作用，對GJB2 和SLC26A4 耳聾基因突變者行基因測序診斷以確定基因型。

1.2.5 隨訪內(nèi)容 產(chǎn)前診斷中心辦公室專人隨訪耳聾基因突變和聽力篩查未通過新生兒出生3 個(gè)月后聽力診斷性檢查情況以及耳聾者的個(gè)性化干預(yù)措施落實(shí)情況（配戴助聽器或安裝人工耳蝸）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耳聾基因突變情況 5 279 例耳聾基因突變篩查新生兒中，未突變4 999 例，突變280 例，其中雜合突變277 例，純合和復(fù)合雜合突變3 例，突變率為5.30%（280/5 279）。4 個(gè)耳聾基因中，GJB2 突變率最高，為3.05%（161/5 279），其中純合和復(fù)合雜合突變3 例，突變率為0.06%（3/5 279），雜合突變158 例，突變率為2.99%（158/5 279）；其余由高到低分別為SLC26A4 雜合突變84 例，突變率為1.59%（84/5 279）；GJB3 雜合突變18 例，突變率為0.34%（18/5 279）；線粒體12SrRNA 均質(zhì)突變14 例，突變率為0.27%（14/5 279）；雙基因雜合突變3 例，突變率為0.06%（3/5 297）。GJB2 基因突變中c.235delC 位點(diǎn)突變最多，達(dá)131 例，突變率為2.48%（131/5297）；SLC26A4基因中c.919-2A＞G 位點(diǎn)突變最多，為59 例，突變率為1.12%，見表1。

2.2 耳聾基因突變者基因診斷及父母驗(yàn)證情況 280例耳聾基因突變的新生兒父母均接受遺傳咨詢和健康教育，其中150 例新生兒父母依從性較好，在知情同意下，選擇了耳聾基因突變篩查驗(yàn)證，結(jié)果135 例新生兒突變來源于無表型的父母一方，占90.0%。對2 例GJB2基因c.235delC 純合突變和1 例GJB2 基因c.235delC/c.299delAT 復(fù)合雜合突變新生兒進(jìn)行GJB2 基因測序診斷，結(jié)果與篩查一致，見表1。另有19 例GJB2 和SLC26A4耳聾基因雜合突變新生兒進(jìn)行基因測序診斷，發(fā)現(xiàn)其中4 例為GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位點(diǎn)復(fù)合雜合突變，父母經(jīng)驗(yàn)證為相應(yīng)位點(diǎn)突變的攜帶者。

表1 280 例新生兒4 個(gè)常見耳聾基因突變篩查、基因診斷及父母驗(yàn)證情況

2.3 耳聾基因篩查與聽力篩查比較 5 279 例耳聾基因突變篩查新生兒中，耳聾基因未突變者聽力篩查未通過率為0.05%（25/4 999），低于耳聾基因突變攜帶者的1.79%（5/280），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

表2 5 279 例新生兒耳聾基因篩查與聽力篩查比較（例）

2.4 耳聾基因突變者聽力診斷和干預(yù)隨訪情況 隨訪耳聾基因雜合突變新生兒277 例，其中2 例聽力篩查未通過，經(jīng)GJB2 全基因測序，1 例為GJB2 基因c.235delC位點(diǎn)雜合突變，聽力診斷正常；另1 例為GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位點(diǎn)復(fù)合雜合突變，出生3 個(gè)月經(jīng)聽力診斷性檢查，確診中度耳聾，準(zhǔn)備安裝人工耳蝸；還對3 例聽力篩查通過而基因測序診斷為GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位點(diǎn)復(fù)合雜合突變新生兒進(jìn)行隨訪，出生3 個(gè)月聽力均診斷正常。隨訪GJB2 基因純合/復(fù)合雜合突變新生兒3 例，聽力篩查雙耳均未通過，基因測序基因型與篩查一致；其中GJB2 基因c.235delC純合突變2 例，出生2 個(gè)月確診為重度耳聾，出生6 個(gè)月準(zhǔn)備安裝人工耳蝸；GJB2 基因c.235delC/c.299delAT復(fù)合雜合突變1 例，出生2 個(gè)月確診為中度耳聾，準(zhǔn)備配戴助聽器。另對14 例線粒體12SrRNA 突變攜帶者父母發(fā)放生活和用藥指導(dǎo)卡片，對18 例GJB3 基因突變攜帶者和3 例雙基因雜合突變者囑其父母注意聽力發(fā)育及生活指導(dǎo)。

3 討論

聽力障礙會(huì)直接影響患兒的語言發(fā)育，如果未早期發(fā)現(xiàn)，最終由聾致啞，給患兒的生長發(fā)育及社會(huì)生活帶來非常嚴(yán)重的影響，為此，應(yīng)盡早發(fā)現(xiàn)和干預(yù)患兒，避免其因錯(cuò)過最佳治療期而成為永久性聾兒，這一直是臨床工作者關(guān)注的重點(diǎn)。我國20 多年前就開展了新生兒耳聲發(fā)射結(jié)合聽性腦干聽覺誘發(fā)電位測試（金標(biāo)準(zhǔn)）[10]聽力篩查工作，該檢測無創(chuàng)，假陽性率低，為發(fā)現(xiàn)新生聾兒起到了巨大的作用。但并不是所有的聽力損傷都會(huì)在出生不久便發(fā)生，遲發(fā)性、漸進(jìn)性甚至藥物性耳聾都無法用該法查出。隨著對耳聾基因的深入研究，已表明我國大部分先天性遺傳性耳聾由為數(shù)不多的幾個(gè)基因突變引起[11]，耳聾基因檢測已經(jīng)成為防控遺傳性聾兒的重要措施[12-13]，在一定程度上彌補(bǔ)了聽力篩查的不足[2]。

本研究在5 279 例新生兒中檢出基因突變280 例，突變率為5.30%，與Zhang 等[14]報(bào)道的天津地區(qū)耳聾基因突變攜帶率為5.52%接近，比Chen 等[15]對我國18 篇新生兒耳聾基因篩查的文獻(xiàn)進(jìn)行Meta 分析，發(fā)現(xiàn)新生兒耳聾基因陽性檢出率為4.7%略高，也高于阮宇等[16]4.51%和王川等[17]4.38%的報(bào)道，原因可能是我國不同地區(qū)新生兒耳聾基因篩查方式存在差異，耳聾基因突變陽性檢出率不盡相同。本研究篩查4 個(gè)基因15 個(gè)位點(diǎn)，而阮宇等[16]篩查的是4 個(gè)基因9 個(gè)位點(diǎn)，由于篩查突變位點(diǎn)的增加，耳聾基因突變陽性檢出率有所增高。本研究4 個(gè)基因中，GJB2 基因突變最高，純合和復(fù)合雜合突變率為0.06%，雜合突變率為2.99%；其次為SLC26A4 雜合突變，突變率為1.59%。GJB2 基因中，c.235delC 突變最多，達(dá)131 例，突變率為2.48%；SLC26A4 基因中c.919-2A＞G 突變最多，為59 例，突變率為1.12%，與阮宇等[16]報(bào)道一致，表明了杭州地區(qū)耳聾基因突變攜帶率和常見突變類型與國內(nèi)其他地區(qū)研究報(bào)道基本一致。

本研究280 例耳聾基因突變中，150 例新生兒父母進(jìn)行了耳聾基因突變篩查驗(yàn)證，結(jié)果135 例新生兒突變來源于無表型的父母一方，占90.0%。還對22 例攜帶GJB2 和SLC26A4 基因突變的新生兒進(jìn)行基因測序診斷，確定GJB2 基因c.235delC 純合突變2 例，GJB2 基因c.235delC/c.299delAT 復(fù)合雜合突變1 例，與篩查結(jié)果一致，同時(shí)發(fā)現(xiàn)4 例為GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位點(diǎn)復(fù)合雜合突變，父母經(jīng)驗(yàn)證分別為相應(yīng)位點(diǎn)突變的攜帶者。說明新生兒耳聾基因突變大部分是遺傳父母，少部分才是基因突變所致。提示在孕前、孕期進(jìn)行夫妻耳聾基因篩查可以有效檢出胎兒的耳聾基因攜帶狀況，如果夫妻雙方均為同一基因攜帶者，根據(jù)耳聾的主要遺傳方式——常染色體隱性遺傳，即有1/4 可能出生聾兒，可進(jìn)行婚育指導(dǎo)和產(chǎn)前診斷，以減少耳聾的出生。

從耳聾基因突變狀態(tài)與聽力篩查結(jié)果比較中發(fā)現(xiàn)，耳聾基因未突變，聽力初篩與復(fù)篩未通過率為0.05%，低于耳聾基因突變新生兒的1.79%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與王川等[17]報(bào)道一致。說明新生兒耳聾基因突變攜帶與聽力篩查不通過兩者有相關(guān)性，所以通過聽力-耳聾基因聯(lián)合篩查，以確定先天性耳聾的高危人群，并對高危人群盡早聽力診斷加以確診，有利于早期采取干預(yù)，避免由聾致啞。

按照新生兒聽力篩查規(guī)范要求，常規(guī)聽力篩查未通過，初次診斷性聽力評估在3 個(gè)月左右完成，最后確診耳聾還要延后，但結(jié)合耳聾基因篩查結(jié)果，可以在出生2 個(gè)月就進(jìn)入到聽力診斷的階段，盡早發(fā)現(xiàn)和干預(yù)患兒。本研究還對聽力篩查通過而基因測序診斷為GJB2基因c.235delC/c.109G＞A 位點(diǎn)復(fù)合雜合突變的新生兒進(jìn)行隨訪，出生3 個(gè)月聽力均診斷正常，由于GJB2 基因c.109G＞A 位點(diǎn)突變外顯不全，對于GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位點(diǎn)復(fù)合雜合突變，是否表現(xiàn)聽力障礙，目前各個(gè)研究者認(rèn)識不一致，國內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道，即使出生后聽力篩查與診斷正常，但仍需要長期隨訪聽力發(fā)育，一旦發(fā)現(xiàn)聽力異常需及時(shí)干預(yù)。本研究對14 例攜帶線粒體12SrRNA 基因突變的新生兒進(jìn)行藥物性耳聾高危用藥指導(dǎo)，避免用藥致聾；對18 例GJB3基因突變攜帶者和3 例雙基因雜合突變者囑其父母注意聽力發(fā)育及生活指導(dǎo)。

綜上所述，本研究通過聽力-耳聾基因聯(lián)合篩查與診斷，在出生3 個(gè)月確診中重度耳聾4 例，對不同的耳聾基因突變者進(jìn)行個(gè)性化干預(yù)，達(dá)到了早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)的目的。本研究為杭州地區(qū)開展新生兒聽力-耳聾基因聯(lián)合篩查提供了理論依據(jù)及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對提高杭州地區(qū)出生人口健康素質(zhì)具有積極的意義。