miR-196b-5p 在食管鱗癌癌組織中的表達(dá)及作用機(jī)制

尹周亮 張波 張健 徐建峰

食管癌是世界第六大常見惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第四大常見原因[1]，其中超過90%為食管鱗狀細(xì)胞癌[2-3]。目前食管癌患者的預(yù)后仍不理想，中位生存時(shí)間僅為1.5 年，5 年生存率不到10%[4]。尋找食管癌的生物標(biāo)志物和開發(fā)新的基因治療，對(duì)降低食管癌患者死亡率具有重要意義。miRNA 作為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，可通過特異性結(jié)合靶mRNA 減少mRNA 翻譯或降低靶mRNA 表達(dá)[5-7]。目前，miRNA 已被證實(shí)在腫瘤中存在差異表達(dá)，且參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，miR-196b-5p 參與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，或可作為腫瘤生物標(biāo)志物[8-9]。Shao 等[9]發(fā)現(xiàn)miR-196b-5p 在胃癌組織中高表達(dá)，且調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。另一研究顯示，在胃癌患者的血清中，miR-196b-5p 同樣存在高表達(dá)，且對(duì)胃癌診斷及預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均具有一定的價(jià)值[10]。然而，目前關(guān)于miR-196b-5p 與食管癌的關(guān)系鮮有報(bào)道?；诖?，本研究探討miR-196b-5p 在食管鱗癌癌組織中的表達(dá)情況，評(píng)估m(xù)iR-196b-5p 作為食管鱗癌潛在生物標(biāo)志物的可能性，并進(jìn)一步分析其作用機(jī)制，以期為miR-196b-5p 作為食管鱗癌生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供理論支持。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2015 至2019 年浙江省臺(tái)州醫(yī)院收治的病理學(xué)檢查確診為食管鱗癌的24 例患者的癌組織及相應(yīng)癌旁（距離腫瘤≥2 cm）正常組織標(biāo)本，組織標(biāo)本均由中心實(shí)驗(yàn)室規(guī)范保存。24 例食管鱗癌組織標(biāo)本中男19 例，女5 例；年齡＜60 歲17 例，≥60 歲7例；腫瘤位置：食管近段～中段15 例，遠(yuǎn)段9 例；T 分期：T1～2期12 例，T3～4期12 例；N 分期：N0期14 例，Nx期10 例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 組織標(biāo)本miR-196b-5p 表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR 法。取適量的組織放入無酶EP 管后上機(jī)研磨，在研磨后的組織中加入1 ml Trizol（美國賽默飛公司），嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國賽默飛公司）說明書要求提取總RNA。將2×Master Mix、50×ROX Reference Dye、引物（上海生物工程公司）、模板完全溶解，依照PCR 試劑（上海吉瑪公司）說明書配制反應(yīng)體系，設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。所有miRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)采用log5（x）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。miR-196b-5p 上游引物：3'-TAGGTAGTTTCCTGTTGTTGGG-5'，下游引物：3'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-5'；內(nèi)參U6 上游引物：3'-CTCGCTTCGGCAGCACA-5'，下游引物：3'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5'。

1.3 癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）和基因表達(dá)匯編（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)驗(yàn)證 從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://cancergenome.nih.gov/）中下載食管鱗癌高通量基因測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)集，共95 例食管鱗癌癌組織和13 例癌旁正常組織的miRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)納入本研究。所有miRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)采用log2（x）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。從GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下載GSE43732 數(shù)據(jù)集，共115 例食管鱗癌組織和45 例癌旁正常組織的miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)納入本研究。所有miRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)采用2n進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。以上所有數(shù)據(jù)均來自有效信息，不包括遺失的數(shù)據(jù)。

1.4 患者分組定義 基于24 例食管鱗癌患者的miRNA 數(shù)據(jù)，定義癌組織中miR-196b-5p 表達(dá)水平高于截?cái)嘀档幕颊邽楦弑磉_(dá)患者，反之定義為低表達(dá)患者，以進(jìn)行后續(xù)生存分析。另基于TCGA 完整的RNA、miRNA 和臨床數(shù)據(jù)，按食管鱗癌癌組織中miR-196b-5p 表達(dá)水平從低到高對(duì)食管鱗癌患者進(jìn)行排序，定義前1/3 患者為miR-196b-5p 低表達(dá)患者，后1/3 患者為miR-196b-5p 高表達(dá)患者，以進(jìn)行后續(xù)差異基因的富集分析。

1.5 京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 富集分析 利用R 包“l(fā)imma”對(duì)miR-196b-5p 高表達(dá)和低表達(dá)患者進(jìn)行差異基因篩選，設(shè)置閾值log 倍數(shù)變化（fold change，F(xiàn)C）＞0.5 且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.1。利用DAVID 在線生物信息分析軟件（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)miR-196b-5p 相關(guān)差異基因進(jìn)行KEGG通路分析，P＜0.05 被認(rèn)為富集顯著。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。采用GraphPad 軟件繪制ROC 曲線；生存分析的最佳截?cái)嘀祦碜訶-tile 軟件[11]分析結(jié)果；通過Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，預(yù)后比較采用log-rank 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌患者癌組織與癌旁正常組織miR-196b-5p 表達(dá)水平比較 qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果、TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO 數(shù)據(jù)庫中食管鱗癌患者癌組織miR-196b-5p 表達(dá)水平均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表1。

2.2 miR-196b-5p 診斷食管鱗癌的效能 根據(jù)本研究24 例食管鱗癌癌組織標(biāo)本qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果計(jì)算，miR-196b-5p 水平診斷食管鱗癌的靈敏度為0.79，特異度為0.92，最佳截?cái)嘀禐?.542，AUC 為0.891（95%CI：0.767～0.962）（P＜0.01）；根據(jù)TCGA 數(shù)據(jù)計(jì)算，靈敏度為0.86，特異度為0.85，最佳截?cái)嘀禐?.310，AUC 為0.832（95%CI：0.748～0.897）（P＜0.01）；根據(jù)GEO 數(shù)據(jù)計(jì)算，靈敏度為0.89，特異度為0.96，最佳截?cái)嘀禐?.012，AUC 為0.946（95%CI：0.900～0.975）（P＜0.01），見圖1。

2.3 不同臨床特征食管鱗癌患者癌組織中miR-196b-5p 表達(dá)水平比較 本研究24 例食管鱗癌患者中，T3～4期患者癌組織中miR-196b-5p 表達(dá)水平高于T1～2期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但不同性別、年齡、腫瘤位置和N 分期患者癌組織miR-196b-5p表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05），見表2。

2.4 食管鱗癌癌組織miR-196b-5p 高表達(dá)與低表達(dá)患者生存情況比較 X-tile 軟件顯示進(jìn)行生存分析時(shí)miR-196b-5p 表達(dá)水平的最佳截?cái)嘀禐?.898。本研究24 例食管鱗癌患者中，13 例miR-196b-5p 低表達(dá)（≤1.898）患者3 年生存率為55.3%，明顯高于11 例miR-196b-5p 高表達(dá)（＞1.898）患者的0.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.412，P=0.036），見圖2。

2.5 KEGG 富集分析miR-196b-5p 在食管鱗癌中的信號(hào)通路 通過R 包“l(fā)imma”共篩選出173 個(gè)差異基因，對(duì)這些差異基因進(jìn)行KEGG 富集分析顯示，差異基因顯著富集于有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Wnt、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）等多條通路（均P＜0.05）。前10 項(xiàng)通路富集見表3。

3 討論

食管癌患者無論是局部轉(zhuǎn)移還是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其預(yù)后通常較差。因此，早期篩選食管癌患者并進(jìn)行有效的治療對(duì)于預(yù)后具有重要意義。本研究中，筆者探討了miR-196b-5p 在食管鱗癌癌組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析其可能參與的信號(hào)通路。

本研究結(jié)果顯示，miR-196b-5p 與食管鱗癌的發(fā)生關(guān)系密切。與癌旁正常組織相比，食管鱗癌患者癌組織中miR-196b-5p 表達(dá)水平明顯上調(diào)，ROC 曲線分析結(jié)果顯示miR-196b-5p 預(yù)測(cè)食管鱗癌的AUC 值為0.891，具備較高的靈敏度和特異度。這一結(jié)論得到TCGA 和GEO 數(shù)據(jù)分析結(jié)果的支持。同時(shí)，本研究結(jié)果還顯示T3～4期食管鱗癌患者癌組織中miR-196b-5p 表達(dá)水平高于T1～2期患者，提示miR-196b-5p 與食管鱗癌進(jìn)展有關(guān)。生存分析結(jié)果顯示食管鱗癌癌組織中miR-196b-5p 高表達(dá)患者的預(yù)后較低表達(dá)患者差。另外，本研究顯示miR-196b-5p 可能通過參與MAPK、Wnt、PI3K/Akt 等多條信號(hào)通路的調(diào)控，從而影響食管鱗癌的發(fā)生和發(fā)展。

表1 食管鱗癌患者癌組織與癌旁正常組織miR-196b-5p 表達(dá)水平比較

圖1 miR-196b-5p 診斷食管鱗癌的ROC 曲線（TCGA 為癌癥基因組圖譜；GEO 為基因表達(dá)匯編）

表2 不同臨床特征食管鱗癌患者癌組織miR-196b-5p 表達(dá)水平比較

圖2 食管鱗癌組織miR-196b-5p 高表達(dá)與低表達(dá)患者生存曲線比較

表3 前10 項(xiàng)KEGG 通路富集結(jié)果

研究顯示miR-196b-5p 在胃癌[9]、結(jié)直腸癌[8]、非小細(xì)胞癌[12]和乳腺癌[13]等多種腫瘤中表達(dá)失調(diào)。已有研究表明，miR-196b-5p 在胃癌患者癌組織和外周血清中均顯著上調(diào)，可作為胃癌診斷的潛在生物標(biāo)志物和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)因子，具有重要的臨床價(jià)值[9-10]。與此同時(shí)，Ren 等[8]和Xu 等[14]發(fā)現(xiàn)miR-196b-5p 在結(jié)直腸癌患者癌組織和外周血清中均存在高表達(dá)，在結(jié)直腸癌診斷中具有一定的臨床價(jià)值，且高表達(dá)的miR-196b-5p 與淋巴結(jié)浸潤(rùn)、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。上述研究顯示，miR-196b-5p 可作為某些特定腫瘤診斷的潛在生物標(biāo)志物。

研究發(fā)現(xiàn)miR-196b-5p 可通過調(diào)節(jié)靶基因從而調(diào)控胃癌[9]、結(jié)直腸癌[15]、口腔癌[16]等多種腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。盡管如此，miR-196b-5p 對(duì)信號(hào)通路的調(diào)控作用卻鮮有研究。Li 等[17]研究表明，miR-196b-5p 可通過PI3K/Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。PI3K/Akt 信號(hào)通路在過去被發(fā)現(xiàn)參與包括食管鱗癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖和轉(zhuǎn)移[18-19]。筆者過去的一項(xiàng)研究表明，miR-30b-5p 可通過PI3K/Akt 信號(hào)通路調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲[20]。另外，MAPK 和Wnt 等信號(hào)通路也被證實(shí)與食管鱗癌關(guān)系密切[21-22]。

綜上所述，miR-196b-5p 在食管鱗癌的發(fā)生中起著重要作用。食管鱗癌癌組織中miR-196b-5p 表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，或可作為食管鱗癌篩選的潛在生物標(biāo)志物。miR-196b-5p 可能通過參與調(diào)控多條信號(hào)通路，在食管鱗癌發(fā)生中起致癌作用。本研究也存在一些不足，如缺少食管鱗癌患者外周血的檢測(cè)以進(jìn)一步明確miR-196b-5p 作為篩選因子的潛能；信號(hào)通路方面仍需細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。