NHE-1蛋白和V-ATPase在胃癌及癌前病變組織中的表達(dá)及臨床意義

胡業(yè)曉 朱仁武 張煜程 陳旭晨 趙茂森

Na+/H+交換蛋白-1（Na+/H+exchanger 1，NHE-1）是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH 的重要跨膜蛋白，它以胞內(nèi)一個H+，胞外一個Na+進(jìn)行等分子比例的跨膜交換，排出細(xì)胞內(nèi)H+，從而維持細(xì)胞內(nèi)pH 的穩(wěn)定，同時調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透壓和細(xì)胞體積[1]?？张菪唾|(zhì)子ATP 酶（vacuolar H+-ATPase，V-ATPase）廣泛分布于真核細(xì)胞的囊泡膜和細(xì)胞膜上，依賴ATP 逆濃度梯度將H+泵出細(xì)胞外或泵入細(xì)胞器囊泡腔內(nèi)[2]。兩者共同維持細(xì)胞內(nèi)pH 的穩(wěn)定。細(xì)胞內(nèi)pH 穩(wěn)定是維持細(xì)胞正常功能的前提，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)開始出現(xiàn)酸化時，隨著酸化程度的不斷加深，正常細(xì)胞會出現(xiàn)凋亡和壞死。近年來研究表明，NHE-1 蛋白和VATPase 在腫瘤細(xì)胞中的活性表達(dá)水平明顯增高，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[3-6]。本研究分析NHE-1 蛋白和VATPase 在胃癌和癌前病變組織中的表達(dá)差異，探討兩者在胃癌組織中不同程度的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系、兩者在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性及對胃癌患者預(yù)后生存時間的臨床意義。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2014 年1 月至2019 年12 月在溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院行胃鏡檢查時采取的胃黏膜組織標(biāo)本及行胃癌手術(shù)采取的胃癌組織標(biāo)本共320 例，其中原發(fā)性胃癌標(biāo)本152 例，正常胃黏膜標(biāo)本55 例，癌前病變組織113 例（慢性萎縮性胃炎42 例、腸上皮化生30 例、異型增生41 例）。胃鏡標(biāo)本取自胃竇部及胃內(nèi)病變部位，胃癌標(biāo)本取自手術(shù)切除后的胃癌組織，均經(jīng)過HE染色病理檢查證實。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合胃癌及癌前病變的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查及胃鏡、手術(shù)后病理證實為胃癌及癌前病變；（2）均行胃癌手術(shù)及胃鏡治療；（3）年齡≤80 歲且能耐受手術(shù)治療；（4）可以獲得長期隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床資料不完整或不能完成隨訪者；（2）合并有其他重要臟器疾病或不能耐受手術(shù)者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 NHE-1 蛋白及V-ATPase 表達(dá)水平檢測 采用免疫組化SP 染色法。制作4 μm 厚石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。3%H2O2孵育以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。10%正常山羊血清封閉，加入一抗（1∶250 抗NHE-1 抗體、1∶250 抗V-ATPase 抗體）4 ℃過夜。第二天滴加生物素標(biāo)記的二抗（抗NHE-1 蛋白抗體、抗V-ATPase 抗體），滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，DAB 顯色。自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明和樹膠封片，顯微鏡下觀察NHE-1 蛋白和V-ATPase 表達(dá)的特點和陽性定位?？筃HE-1 蛋白抗體及抗V-ATPase 抗體試劑盒均購自美國圣克魯斯生物技術(shù)公司。

1.3 觀察指標(biāo) 陽性細(xì)胞表現(xiàn)為黃色至棕褐色顆粒，NHE-1 蛋白及V-ATPase 主要表達(dá)于細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)中。在光學(xué)顯微鏡下，每張切片隨機觀察5 個高倍視野（×400），每個視野計數(shù)200 個細(xì)胞進(jìn)行評分和記錄。陽性細(xì)胞百分比：無陽性細(xì)胞為0 分，＜10%為1 分，10%～50%為2 分，51%～100%為3 分。染色強度：無顯色為0 分，黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。兩者表達(dá)的總評分為染色強度和陽性細(xì)胞百分比之和：0～2 分為陰性，3～4 分為弱陽性，5～6 分為強陽性[7]。在預(yù)后分析中，將NHE-1 蛋白和V-ATPase 均為0～2 分記為NHE-1 蛋白和V-ATPase 均不表達(dá)組，NHE-1 蛋白為3～6 分且V-ATPase 為0～2 分記為NHE-1 蛋白表達(dá)組，V-ATPase 為3～6 分且NHE-1 蛋白為0～2 分記為V-ATPase 表達(dá)組，兩者均為3～6 分記為NHE-1 蛋白和V-ATPase 均表達(dá)組。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料多組間比較采用χ2檢驗，兩兩比較采用χ2分割法（P＜0.0125）。等級資料多組間比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney U 檢驗（Bonferroni 校正，3 組間兩兩比較P＜0.0167，4 組間兩兩比較P＜0.0125）。采用Spearman 等級相關(guān)分析NHE-1 蛋白表達(dá)和V-ATPase 表達(dá)的相關(guān)性。預(yù)后分析采用Kaplan-Meier 生存曲線。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及癌前病變組織中NHE-1 蛋白及V-ATPase的表達(dá) NHE-1 蛋白及V-ATPase 在正常胃黏膜組織中均無表達(dá)，但在胃癌組織及癌前病變組織中均有不同程度的表達(dá)。胃癌組織及癌前病變組織中NHE-1 蛋白及V-ATPase 的陽性表達(dá)率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中NHE-1 蛋白及V-ATPase 的陽性表達(dá)率均高于慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生和異型增生等癌前病變組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.0125），見表1。

表1 胃癌及癌前病變組織中NHE-1 蛋白及V-ATPase 的表達(dá)[例（%）]

2.2 胃癌組織中NHE-1 蛋白及V-ATPase 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 胃癌組織中NHE-1 蛋白及VATPase 的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、分化程度均無關(guān)（均P ＞0.05），但與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期均有關(guān)（均P＜0.05）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，浸潤深度T2、T3、T4時NHE-1 蛋白及V-ATPase 的表達(dá)與T1比較，差異均有統(tǒng)計意義（均P＜0.0125）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N1、N2、N3時NHE-1 蛋白及V-ATPase 的表達(dá)與N0比較，差異均有統(tǒng)計意義（均P＜0.0125）；TNM 分期Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期NHE-1 蛋白及V-ATPase 的表達(dá)與Ⅰ期比較，差異均有統(tǒng)計意義（均P＜0.0125），見表2。

2.3 胃癌組織中NHE-1 蛋白表達(dá)和V-ATPase 表達(dá)的相關(guān)性分析 Spearman 等級相關(guān)分析顯示，胃癌組織中NHE-1 蛋白表達(dá)和V-ATPase 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.299，P＜0.05），見表3。

表2 胃癌組織中NHE-1 蛋白及V-ATPase 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（例）

表3 胃癌組織中NHE-1 蛋白表達(dá)和V-ATPase 表達(dá)的相關(guān)性（例）

2.4 NHE-1 蛋白表達(dá)和V-ATPase 表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性分析 NHE-1 蛋白表達(dá)陰性、弱陽性和強陽性組中位生存時間分別為48（95%CI：42.643～53.357）、39（95%CI：29.344～48.656）和28（95%CI：20.949～35.051）個月，3 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.0167），見圖1（插頁）。V-ATPase表達(dá)陰性、弱陽性和強陽性組中位生存時間分別為50（95%CI：45.920～54.080）、32（95%CI：26.410～37.590）和27（95%CI：22.696～31.304）個月，3 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.0167），見圖2（插頁）。NHE-1 蛋白和V-ATPase 均表達(dá)組（70 例）、NHE-1 蛋白表達(dá)組（9 例）、V-ATPase 表達(dá)組（45 例）和NHE-1 蛋白和V-ATPase 均不表達(dá)組（28 例）中位生存時間分別為31（95%CI：25.784～36.216）、44（95%CI：40.120～47.880）、42（95%CI：39.140～44.860）和48（95%CI：46.790～49.210）個月，4 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，NHE-1 蛋白和V-ATPase均表達(dá)組分別與NHE-1 蛋白表達(dá)組、V-ATPase 表達(dá)組、NHE-1 蛋白和V-ATPase 均不表達(dá)組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.0125），V-ATPase 表達(dá)組與NHE-1蛋白和V-ATPase 均不表達(dá)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0125），見圖3（插頁）。

圖1 Na+/H+交換蛋白-1（NHE-1）蛋白表達(dá)的胃癌患者預(yù)后生存曲線

圖2 空泡型質(zhì)子ATP 酶（V-ATPase）表達(dá)的胃癌患者預(yù)后生存曲線

圖3 Na+/H+交換蛋白-1（NHE-1）蛋白和空泡型質(zhì)子ATP 酶（V-ATPase）表達(dá)的胃癌患者預(yù)后生存曲線

3 討論

相對于正常細(xì)胞而言，胃癌細(xì)胞代謝旺盛，供血、供氧量相對不足，容易造成細(xì)胞缺氧的環(huán)境，缺氧環(huán)境加速細(xì)胞對葡萄糖的酵解，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的乳酸和H+[8]，為了維持細(xì)胞內(nèi)pH 的穩(wěn)定，胃癌細(xì)胞會開放更多高效的排酸通道，促使細(xì)胞內(nèi)H+排出，因此就會過度的表達(dá)NHE-1 蛋白及V-ATPase，而大量H+排出使細(xì)胞外pH 降低，最終導(dǎo)致細(xì)胞酸性微環(huán)境形成[9]。其次Na+-H+交換依賴于ATP 酶供能，這一耗能過程又會反饋地刺激胃癌細(xì)胞對糖的攝取和對糖酵解的依賴，從而使胃癌細(xì)胞進(jìn)行更多的Na+-H+交換，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致更多的正常細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死，最終進(jìn)一步加速癌癥細(xì)胞的形成[10]。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中NHE-1 蛋白和V-ATPase 陽性表達(dá)率均高于癌前病變及正常胃黏膜組織，且胃癌組織中NHE-1 蛋白表達(dá)和V-ATPase 表達(dá)呈正相關(guān)。NHE-1 蛋白的表達(dá)會促進(jìn)V-ATPase 表達(dá)，兩者協(xié)同發(fā)揮作用來維持細(xì)胞內(nèi)pH 穩(wěn)定，因此也造成細(xì)胞酸性微環(huán)境形成，加速胃癌細(xì)胞的產(chǎn)生。

胃癌細(xì)胞可以通過上調(diào)NHE-1 蛋白和V-ATPase的表達(dá)，將癌細(xì)胞糖酵解產(chǎn)生的大量H+泵出細(xì)胞外，維持癌細(xì)胞的生存并形成腫瘤酸性微環(huán)境，酸性微環(huán)境形成會促使癌細(xì)胞基因表型的改變以獲得更強勁的生命力，還有利于腫瘤血管的生成以及癌細(xì)胞外基質(zhì)的重建，導(dǎo)致癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[11]。研究表明，NHE-1蛋白和V-ATPase 在多種腫瘤細(xì)胞中都存在過表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞的增殖生長、浸潤轉(zhuǎn)移和凋亡都有著密切的聯(lián)系[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中NHE-1 蛋白及VATPase 表達(dá)情況與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期均有關(guān)，表明NHE-1 蛋白及V-ATPase 的表達(dá)越強則胃癌組織的生長越活躍、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移程度越廣泛、TNM 分期越晚。

胃癌細(xì)胞上NHE-1 蛋白和V-ATPase 的過表達(dá)不僅有助于胃癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，也會對化療和放療產(chǎn)生抵抗[14]。研究表明NHE-1 蛋白和V-ATPase 的過表達(dá)更容易使胃癌細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性[15-17]。細(xì)胞內(nèi)pH 的穩(wěn)定對化療藥物發(fā)揮細(xì)胞毒反應(yīng)起到重大作用，因為細(xì)胞酸中毒是細(xì)胞凋亡的起始點，同時對耐藥性的產(chǎn)生也具有作用，耐藥的胃癌細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度會明顯降低[16]，使化療效果下降，從而縮短生存時間。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中不同程度NHE-1 蛋白和V-ATPase 的表達(dá)其生存時間存在明顯差異，表達(dá)程度越高胃癌生存時間越短。通過將NHE-1 和V-ATPase 同時表達(dá)跟單一表達(dá)及同時不表達(dá)之間的生存時間進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)同時表達(dá)的生存時間明顯縮短，說明酸性微環(huán)境的形成與胃癌預(yù)后存在相關(guān)性。

綜上所述，本研究通過Spearman 等級相關(guān)分析顯示胃癌組織中NHE-1 蛋白表達(dá)和V-ATPase 表達(dá)呈正相關(guān)，且兩者表達(dá)與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和預(yù)后生存時間均有關(guān)。提示NHE-1 蛋白和VATPase 異常表達(dá)可能在胃癌發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移的過程中起正向調(diào)控作用，兩者有望成為預(yù)防、治療和評估胃癌預(yù)后的新的生物學(xué)標(biāo)志物。