CXCL3/CXCR2調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機制研究

李文燕 祝迪薇 顧艷玲 周曉紅 王瑾

趨化因子3（chemokines 3,CXCL3）是一種單鏈蛋白質(zhì)，屬于CXC 趨化因子家族。在機體穩(wěn)態(tài)條件下，CXCL3 可以由多種細(xì)胞產(chǎn)生[1-2]。趨化因子受體2（chemokine receptor 2,CXCR2）是CXCL3 的一個重要受體，CXCL3/CXCR2 中，CXCL3 可以激活CXCR2，介導(dǎo)下游信號的激活，調(diào)控細(xì)胞遷移、侵襲等，且CXCL3/CXCR2 與多種疾病相關(guān)[3-4]，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。CXCL3 作為腫瘤誘導(dǎo)因子，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的趨化，激活G 蛋白偶聯(lián)受體，誘導(dǎo)鈣動員和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶磷酸化，抑制腺苷酸環(huán)化酶激活劑活化，降低環(huán)腺苷酸水平，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5-6]，但是目前在乳腺癌的研究中鮮有CXCL3/CXCR2 的報道。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）是腫瘤重要的特征之一，它在人體發(fā)育過程中起著關(guān)鍵的作用，而且還參與組織愈合、器官纖維化和癌癥發(fā)生等過程[7-8]。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中，轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）可以抑制細(xì)胞的凋亡，誘導(dǎo)Snail 的表達(dá)，Snail 是EMT 的重要調(diào)控因子，而EMT 的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞的趨化能力有著重要的關(guān)系[9]。因此，本研究探討CXCL3/CXCR2 調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞EMT 的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7（批號：CL-0149）購自武漢普諾賽生命科技有限公司，重組人CXCL3 蛋白（批號：RPB604Hu01）購自武漢云克隆科技有限公司，CXCR2 抑制劑IN-1（批號：101022）購自上海MCE 公司，CCK-8 檢測試劑盒（批號：C0037）購自碧云天生物技術(shù)有限公司，N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、波形蛋白（vimentin）、CXCR2 及E-鈣黏蛋白（E-cadherin）（批號：13116、12475、5741、12671、14472）單克隆抗體購自美國cell signaling technology 公司，PI 染色的細(xì)胞周期檢測試劑盒（批號：S21522）購自美國BD 公司，Transwell 小室購自康寧公司，酶標(biāo)儀（型號：Multuskan Go 1510）購自美國Thermo 公司，顯微鏡（Olympusix71）購自德國徠卡公司，流式細(xì)胞儀（FASCC）購自美國BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞實驗及分組 在CXCL3 對于乳腺癌細(xì)胞作用的實驗中，將MCF-7 細(xì)胞分為對照組A 和CXCL3組A，對照組A 為常規(guī)培養(yǎng)的MCF-7 細(xì)胞，而CXCL3組A 為加入10 ng/L CXCL3 干預(yù)的MCF-7 細(xì)胞。在IN-1 干預(yù)的實驗中，將MCF-7 細(xì)胞分為對照組B、CXCL3 組B 和IN-1 組，對照組B 為常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞，CXCL3 組B 為加入10 ng/L CXCL3 干預(yù)的MCF-7 細(xì)胞，而IN-1 組為同時加入10 μM IN-1 和10 ng/L CXCL3干預(yù)的MCF-7 細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞周期檢測 細(xì)胞分組后接種在6 孔板中，分別用CXCL3 和IN-1 進(jìn)行干預(yù)，培養(yǎng)24 h 后用胰蛋白酶消化，PBS 洗2～3 次后，3 000 r/min 離心10 min，取細(xì)胞，加入50 μl PI 染液避光染色15 min，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到流式管中，上機檢測。

1.2.3 細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK-8 法。細(xì)胞接種到96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入CXCL3 或IN-1 進(jìn)行干預(yù)，于6、12、24、48 h 檢測細(xì)胞增殖能力。在96 孔板中加入10 μl CCK-8 溶液繼續(xù)孵育4 h。輕輕搖勻培養(yǎng)板后，在450 nm 處檢測吸光度（OD）值，同時設(shè)置空白培養(yǎng)基為對照。細(xì)胞增殖能力=（OD實驗組-OD對照）/（OD初始-OD對照）×100%。

1.2.4 平板克隆形成實驗 細(xì)胞生長至對數(shù)期后，消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 000 個/孔，接種到6 孔板中，同時采用含有30%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)2 周，待細(xì)胞形成克隆后，棄去培養(yǎng)基，PBS 清洗2 次后加入多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，PBS 洗2～3 次，拍照后計算克隆形成數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞侵襲能力檢測 細(xì)胞加入Transwell 上層的小室，待細(xì)胞貼壁后，加入無血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，同時在上層的DMEM 培養(yǎng)基中加入CXCL-3 或IN-1 進(jìn)行干預(yù)，而下層小室中加入含20%FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)24 h 進(jìn)行侵襲后取出，用甲醇固定、0.1%結(jié)晶紫染色，鏡下計算侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot。細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞并用PBS 洗2 次后，RIPA+PMSF 蛋白裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，3 000 r/min離心后取上清液，加入等體積的上樣緩沖液煮沸后采用SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行電泳分離，PVDF 轉(zhuǎn)膜后用脫脂奶粉進(jìn)行封閉，之后用稀釋的N-cadherin、βcatenin、vimentin、CXCR2、E-cadherin 單克隆抗體4 ℃過夜孵育，孵育后采用TBST 漂洗后加入IgG-HRP二抗孵育，ECL 顯色液顯色后，成像系統(tǒng)成像，并用凝膠定量分析軟件Quantity One 4.4 進(jìn)行相對表達(dá)量的測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCL3 對于MCF-7 細(xì)胞周期的影響 對照組A細(xì)胞中G0/G1 期的比例為（82.44±4.18）%，S/M+G2 期為（17.43±2.87）%；CXCL3 組A 細(xì)胞中G0/G1 期的比例為（74.54±4.43）%，S/M+G2 期為（25.87±3.42）%；兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1a。而IN-1 干預(yù)后，IN-1 組細(xì)胞中G0/G1 期的比例為（79.44±4.21）%，S/M+G2 期為（22.54±2.32）%；CXCL3 組B 細(xì)胞中G0/G1 期的比例為（84.23±3.11）%，S/M+G2 期為（15.43±3.11）%；對照組B 細(xì)胞中G0/G1 期的比例為（76.43±2.87）%，S/M+G2 期為（21.11±3.42）%；3 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與CXCL3 組B 比較，IN-1組細(xì)胞中G0/G1 期的比例下降（P＜0.05），見圖1b。

2.2 CXCL3 對于MCF-7 細(xì)胞增殖能力的影響 與對照組A 同一時間點比較，CXCL3 組A 細(xì)胞增殖能力明顯上升（均P＜0.05），提示CXCL3 干預(yù)后可以明顯提高M(jìn)CF-7 細(xì)胞增殖能力，見圖2a。而IN-1 干預(yù)后，與CXCL3 組B 同一時間點比較，IN-1 組細(xì)胞增殖能力明顯下降（均P＜0.05），見圖2b。

2.3 CXCL3 對于MCF-7 細(xì)胞平板克隆形成的影響與對照組A 克隆形成數(shù)（45.87±8.12）比較，CXCL3 組A細(xì)胞平板克隆形成數(shù)（78.43±12.12）明顯增加（P＜0.05），見圖3a。而IN-1 干預(yù)后，與CXCL3 組B 平板克隆形成數(shù)（88.43±11.54）比較，IN-1 組細(xì)胞平板克隆形成數(shù)（50.54±11.54）明顯減少（P＜0.05），見圖3b。

2.4 CXCL3 對于MCF-7 細(xì)胞侵襲能力的影響 與對照組A 侵襲細(xì)胞數(shù)（68.87±18.54）比較，CXCL3 組A 侵襲細(xì)胞數(shù)（135.65±17.65）明顯增加（P＜0.05），見圖4a。而IN-1 干預(yù)后，與CXCL3 組B 侵襲細(xì)胞數(shù)（129.65±20.54）比較，IN-1 組侵襲細(xì)胞數(shù)（69.12±14.54）明顯減少（P＜0.05），見圖4b。

圖1 趨化因子3（CXCL3）對于MCF-7 細(xì)胞周期改變的影響[a：CXCL3 對于MCF-7 細(xì)胞周期的影響；b：抑制趨化因子受體2（CXCR2）后，CXCL3 對于MCF-7 細(xì)胞周期的影響]

圖2 趨化因子3（CXCL3）對于MCF-7 細(xì)胞增殖能力的影響[a：CXCL3 對于MCF-7 細(xì)胞增殖能力的影響，與對照組A 同一時間點比較，*P＜0.05；b：抑制趨化因子受體2（CXCR2）后，CXCL3 對于MCF-7 細(xì)胞增殖能力的影響，與對照組B 同一時間點比較，*P＜0.05；與CXCL3 組B 比較，△P＜0.05]

2.5 CXCL-3 對于EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組A 比較，CXCL3 組A 細(xì)胞N-cadherin、β-catenin、vimentin、CXCR2 表達(dá)水平均上調(diào)，E-cadherin 表達(dá)水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。而IN-1 干預(yù)后，與CXCL3 組B 比較，IN-1 組細(xì)胞N-cadherin、βcatenin、vimentin、CXCR2 表達(dá)水平均下調(diào)，E-cadherin表達(dá)水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖5。

3 討論

圖3 趨化因子3（CXCL3）對于MCF-7 細(xì)胞克隆形成能力的影響[a：CXCL3 對于MCF-7 細(xì)胞克隆形成的影響；b：抑制趨化因子受體2（CXCR2）后，CXCL3 對于MCF-7 細(xì)胞克隆形成的影響]

圖4 趨化因子3（CXCL3）對于MCF-7 細(xì)胞侵襲能力的影響[a：CXCL3 對于MCF-7 細(xì)胞侵襲能力的影響；b：抑制趨化因子受體2（CXCR2）后，CXCL3 對于MCF-7 細(xì)胞侵襲能力的影響]

圖5 CXCL3 對于MCF-7 EMT 相關(guān)蛋白的影響[a：EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖；b：對照組A 和CXCL3 組A 細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較，與對照組A 比較，*P＜0.05；c：對照組B、CXCL3 組B 和IN-1 組細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較，與對照組B 比較，*P＜0.05；與CXCL3 組B 比較，△P＜0.05；CXCL3 為趨化因子3；N-cadherin 為N-鈣黏蛋白；β-catenin 為β-連環(huán)蛋白；vimentin為波形蛋白；E-cadherin 為E-鈣黏蛋白；CXCR2 為趨化因子受體2；EMT 為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化]

趨化因子是一類細(xì)胞因子的超家族，具有激活和趨化白細(xì)胞的作用，它的不同趨化因子在許多疾病的發(fā)生、發(fā)展中均有重要的作用[10]。尤其是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中,趨化因子表現(xiàn)出雙刃劍的作用：一部分趨化因子可能增強宿主抗腫瘤侵入的固有或特異性免疫反應(yīng)，另一部分可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤血管的生成,發(fā)揮促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移的作用[11]。趨化因子受體是一類表達(dá)于細(xì)胞膜上的,與趨化因子結(jié)合的,含有7 個跨膜區(qū)的G 蛋白耦聯(lián)受體。根據(jù)其所結(jié)合的配體可將趨化因子受體分為CXC 受體、CC 受體、XC 受體、CX3C 受體4 個亞家族。趨化因子與趨化因子受體結(jié)合后,可以參與多種生理和病理過程,如細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化、凋亡、組織損傷、腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移等[12-13]。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移又以EMT 為基礎(chǔ)。EMT 是指上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過程，同時獲得遷移的能力。腫瘤細(xì)胞在EMT 的過程中發(fā)生了明顯變化，主要是腫瘤細(xì)胞極性改變，與周圍細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞聯(lián)系接觸減少。EMT 在腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲過程中也起到重要的作用。β-catenin 是經(jīng)典的調(diào)節(jié)EMT 的信號通路，其作用和β-catenin 的磷酸化/降解有關(guān)[14]，β-catenin 與E-cadherin 和骨架蛋白的穩(wěn)態(tài)有關(guān)，E-cadherin 表達(dá)水平是EMT 主要的標(biāo)志物，同時vimentin 蛋白也在大部分腫瘤EMT 過程中高表達(dá)[15-16]。CXCL3 是一種趨化因子，其受體主要是CXCR2，在臨床研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CXCL3 和CXCR2 在多種腫瘤中高表達(dá)，但是機制尚未明確。

乳腺癌是一種高轉(zhuǎn)移高致死率的惡性腫瘤，乳腺癌經(jīng)常發(fā)生骨轉(zhuǎn)移和腦轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移的機制較為復(fù)雜。本實驗體外培養(yǎng)了MCF-7 細(xì)胞，并用重組人CXCL3 蛋白進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCL3 蛋白干預(yù)后明顯提高了MCF-7 細(xì)胞的增殖能力，同時促進(jìn)了細(xì)胞周期的改變。在EMT 發(fā)生的過程中，細(xì)胞具有高增殖能力是EMT 發(fā)生的先決條件，而CXCL3 可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。在轉(zhuǎn)移和侵襲的實驗中也發(fā)現(xiàn)，CXCL3 可以促進(jìn)細(xì)胞侵襲，同時提高細(xì)胞克隆形成能力，這與EMT 的發(fā)生相關(guān)。在機制的檢測中發(fā)現(xiàn)，CXCL3 可以上調(diào)EMT 標(biāo)志蛋白N-cadherin、β-catenin、vimentin 的表達(dá)，同時下調(diào)E-cadherin，這說明，細(xì)胞對于基質(zhì)的黏附能力下降，具備了轉(zhuǎn)移和侵襲的能力。CXCR2 作為CXCL3 的受體，在CXCL3 的作用中也扮演著重要的角色，本實驗用IN-1 干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)CXCR2 抑制后可以明顯抑制CXCL3 的作用，細(xì)胞增殖能力下調(diào)，同時侵襲能力也下調(diào)，最關(guān)鍵的是可以抑制EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)。這說明CXCL3 是通過CXCR2 發(fā)揮作用的。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)CXCL3/CXCR2 的激活可以促進(jìn)乳腺癌EMT，這有望成為乳腺癌治療的新靶點。