黃芪復(fù)方對急性低壓缺氧大鼠視網(wǎng)膜DNA損傷的防護(hù)作用

李艷榮 辛?xí)匀?/p>

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院眼科，成都 610072

急進(jìn)高原時由于急性低壓缺氧而引起一系列高原反應(yīng)，嚴(yán)重者可發(fā)生高原肺水腫、高原腦水腫等高原病[1]。視網(wǎng)膜對缺氧非常敏感，低壓缺氧狀態(tài)下使血-視網(wǎng)膜毛細(xì)血管屏障功能受到影響而發(fā)生高原視網(wǎng)膜病變(high altitude retinopathy，HAR)[2]。視網(wǎng)膜功能和結(jié)構(gòu)的完整性依賴于規(guī)律的氧氣供應(yīng)[2]。當(dāng)機(jī)體處于低壓缺氧環(huán)境時，細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化平衡發(fā)生紊亂，導(dǎo)致活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的積累，高濃度ROS可攻擊蛋白質(zhì)使其結(jié)構(gòu)破壞、活性降低；攻擊DNA分子使其發(fā)生突變，甚至斷裂，促使視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷和視網(wǎng)膜血管調(diào)節(jié)功能障礙，繼而出現(xiàn)HAR[3-4]。目前從DNA影響機(jī)制及干預(yù)對HAR進(jìn)行的研究相對較少，且近年來由平原進(jìn)入高海拔地區(qū)的人越來越多，因此研究HAR的病理機(jī)制及治療頗為重要。中藥在防治高原疾病方面有其特色療效，但目前對中藥抗氧化研究主要以單藥的形式進(jìn)行，對中藥復(fù)方的研究較少。與單藥相比，復(fù)方在配伍過程中可能存在療效增強(qiáng)、毒性和不良反應(yīng)減輕等特點(diǎn)。本研究選取在長期應(yīng)用過程中表現(xiàn)出有效自由基清除、抗氧化、免疫力調(diào)節(jié)等作用的黃芪、人參、枸杞、白術(shù)、玉竹和甘草組方為黃芪復(fù)方，通過模擬海拔高度5 km的缺氧環(huán)境探討急性低壓缺氧對大鼠視網(wǎng)膜DNA的影響和黃芪復(fù)方制劑對其的防治作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 選取雄性清潔級SD大鼠72只[實驗動物許可證號：SCXK(陜)2018-001]，由西安交通大學(xué)動物實驗中心提供，體質(zhì)量(200±20)g，2～3月鼠齡。所有動物實驗符合國家科學(xué)技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》。

1.1.2主要試劑及儀器 兔抗鼠p53抗體(WL01919，沈陽萬類生物科技有限公司)、兔抗鼠組蛋白家族2A變異體(histone family 2A variant，H2AX)抗體(ab2893，美國Abcam公司)；山羊抗兔IgG(111-035-045，美國Jackson公司)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR GREEN試劑盒、RNAiso Plus(Trizol)(日本TaKaRa公司)；8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶(8-hydroxyguanine glycolsylase，OGG1)、8-羥基鳥嘌呤核苷酸酶(8-oxoguanine nucleoside triphosphatase，MTH1)RT-PCR引物(上海生工生物工程有限公司)。384孔RT-PCR板、RT-PCR反應(yīng)膜、熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1中藥配制 黃芪復(fù)方(黃芪20 g、人參10 g、玉竹9 g、枸杞9 g、白術(shù)6 g、甘草6 g)，按傳統(tǒng)方法煎煮過濾，并濃縮成11.76 g/ml的復(fù)方藥物備用。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)觀察(HE×100，標(biāo)尺=100 μm) 低氧模型組視網(wǎng)膜較常氧對照組和黃芪復(fù)方灌胃組增厚 A:常氧對照組 B:低氧模型組 C:黃芪復(fù)方灌胃組Figure 1 Histopathological observation of rat retina in each group (HE×100，scale bar=100 μm) The retina of hypoxic model group was thicker than that of the normal oxygen control group and Radix Astragali seu Hedysari compound gavage group A：normal oxygen control group B：hypoxic model group C：Radix Astragali seu Hedysari compound gavage group

1.2.2實驗分組處理 按照計算機(jī)數(shù)字隨機(jī)分配法將72只SD大鼠隨機(jī)平均分為常氧對照組、低氧模型組和黃芪復(fù)方灌胃組，每組24只。低壓氧艙模擬海拔5 km的高度，相對于海平面含氧量10.40%。氧分壓為10.53 kPa，溫度為18～24 ℃，濕度為37%～50%。常氧對照組大鼠在正常氧分壓環(huán)境下喂養(yǎng)，溫度為22～24 ℃，濕度為55%。低氧模型組和黃芪復(fù)方灌胃組大鼠置于低壓氧艙內(nèi)喂養(yǎng)，每24小時開艙0.5 h給大鼠加食、喂水，黃芪復(fù)方灌胃組大鼠每日黃芪復(fù)方制劑(0.1 g/kg)灌胃1次，低氧模型組大鼠每日等量生理鹽水灌胃1次，持續(xù)7 d。

1.2.3組織病理學(xué)染色觀察大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)的變化 于灌胃給藥第7天，按照0.35 ml/100 g劑量腹腔內(nèi)注射100 g/L水合氯醛麻醉大鼠后，快速取出眼球，于40 g/L多聚甲醛溶液中固定72 h，各組分別取8只眼球用于組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測。將固定好的標(biāo)本常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，制成厚4 μm石蠟切片。將石蠟切片置于二甲苯中脫蠟，依次浸泡于梯度乙醇各3 min，蘇木素染色10 min；洗去多余染液，體積分?jǐn)?shù)0.5%鹽酸乙醇分色，伊紅染色5 min；依次浸泡于梯度乙醇，二甲苯透明，中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.4免疫組織化學(xué)法觀察大鼠視網(wǎng)膜p53和H2AX的表達(dá) 各組取石蠟切片，貼片于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%多聚賴氨酸處理的載玻片上，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水后采用熱修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加p53(1∶ 100)或H2AX(1∶ 500)一抗，4 ℃孵育過夜；PBS漂洗3次，每次5 min，滴加相應(yīng)二抗(1∶ 5 000)，37 ℃孵育30 min；PBS漂洗3次，每次5 min，加入DAB顯色液，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明后中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察呈棕色染色為陽性。

1.2.5實時熒光定量PCR法檢測OGG1和MTH1的表達(dá) 各組分別取8只眼球，去除晶狀體和玻璃體，并完整剝離視網(wǎng)膜。取1 ml Trizol試劑與視網(wǎng)膜混勻，提取組織總RNA，按照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。將獲取的cDNA分別加入各引物的反應(yīng)體系中進(jìn)行熒光定量PCR，各PCR引物序列見表1,反應(yīng)體系為20 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火及延伸30 s，循環(huán)40次。擴(kuò)增后進(jìn)行熔解曲線分析。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-△△Ct方法計算各目的基因mRNA相對表達(dá)量。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences引物名稱引物序列(5’-3’)OGG1F:CCCGCTATGTATGTGCCAGTR:TGTCCAGGGCATTAAGCAGMTH1F:CATGGGACACCCACAGAGAGR:GGGAACCAGTAGCTGTCGTCGAPDHF:AGACAGCCGCATCTTCTTGTR:CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT 注:PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);OGG1:8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶;MTH1:8-羥基鳥嘌呤核苷酸酶;F:正向引物;R:反向引物 Note:PCR:polymerase chain reaction;OGG1:8-hydroxyguanine gly-colsylase;MTH1:8-oxoguanine nucleoside triphosphatase;F:forward primer;R:reverse primer

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。本研究中計量數(shù)據(jù)經(jīng)W檢驗證實符合正態(tài)分布，以mean±SD表示，組間均數(shù)經(jīng)Levene檢驗證實方差不齊。采用隨機(jī)分組單因素干預(yù)多水平研究設(shè)計，各組中MTH1 mRNA和OGG1 mRNA相對表達(dá)量總體比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tamhane's T2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠狀態(tài)及視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)的變化

與常氧對照組相比，低氧模型組大鼠行動遲緩，嗜臥嗜睡，精神狀態(tài)差，食欲減低。組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，與常氧對照組大鼠視網(wǎng)膜相比，低氧模型組視網(wǎng)膜增厚，其中以神經(jīng)纖維層及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層增厚明顯；與低氧模型組相比，黃芪復(fù)方灌胃組大鼠視網(wǎng)膜厚度有所降低(圖1)。

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜DNA損傷標(biāo)志物p53和磷酸化蛋白H2AX的表達(dá)變化

免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果顯示，常氧對照組神經(jīng)纖維層、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層及外叢狀層p53呈弱陽性表達(dá)，低氧模型組視網(wǎng)膜各層中p53陽性染色程度較常氧對照組明顯增強(qiáng)，而黃芪復(fù)方灌胃組視網(wǎng)膜p53陽性染色程度較低氧模型組減弱。常氧對照組視網(wǎng)膜中H2AX呈弱陽性表達(dá)，低氧模型組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及外叢狀層H2AX陽性染色程度較常氧對照組明顯增強(qiáng)，尤其以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層陽性染色增強(qiáng)更為明顯，而黃芪復(fù)方灌胃組視網(wǎng)膜中H2AX陽性染色程度較低氧模型組明顯減弱(圖2)。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜p53和H2AX免疫組織化學(xué)染色觀察(DAB×100，標(biāo)尺=100 μm) 低氧模型組大鼠視網(wǎng)膜p53和H2AX陽性染色強(qiáng)度較常氧對照組和黃芪復(fù)方灌胃組明顯增強(qiáng) A：常氧對照組 B：低氧模型組 C：黃芪復(fù)方灌胃組 H2AX：組蛋白家族2A變異體Figure 2 Immunohistochemical observation of p53 andH2AX in rat retina of each group(DAB×100，scale bar=100 μm) The positive staining intensity of p53 and H2AX in retina of the hypoxic model group was significantly enhanced than that of the normal oxygen control group and Radix Astragali seu Hedysari compound gavage group A：normal oxygen control group B：hypoxic model group C：Radix Astragali seu Hedysari compound gavage group H2AX：histone family 2A variant

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜MTH1 mRNA和OGG1 mRNA的表達(dá)變化

常氧對照組、低氧模型組和黃芪復(fù)方灌胃組大鼠視網(wǎng)膜中MTH1 mRNA相對表達(dá)量分別為0.846±0.160、0.573±0.081和0.748±0.114，OGG1 mRNA相對表達(dá)量分別為1.013±0.168、0.772±0.136和0.807±0.734，組間總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=24.511、12.692，均P<0.01)；其中低氧模型組MTH1 mRNA和OGG1 mRNA相對表達(dá)量明顯低于常氧對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；黃芪復(fù)方灌胃組視網(wǎng)膜MTH1 mRNA相對表達(dá)量明顯高于低氧模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，OGG1 mRNA相對表達(dá)量與低氧模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.743)(圖3)。

圖3 各組視網(wǎng)膜MTH1 mRNA和OGG1 mRNA相對表達(dá)量比較(單因素方差分析，Tamhane's T2檢驗，n=8) A：各組MTH1 mRNA相對表達(dá)量比較 F=24.511，P<0.01.與常氧對照組比較，aP<0.05；與低氧模型組比較，bP<0.05 B：各組OGG1 mRNA相對表達(dá)量比較 F=12.692，P<0.01。與常氧對照組比較，aP<0.05 MTH1∶ 8-羥基鳥嘌呤核苷酸酶；OGG1:8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶Figure 3 Comparison of the expression of MTH1 and OGG1 mRNA in retina among different groups (One way ANOVA，Tamhane's T2 test,n=8) A：Comparison of the MTH1 mRNA expression F=24.511，P<0.01.Compared with the normal oxygen control group, aP<0.05；compared with the hypoxic model group，bP<0.05 B：Comparison of the OGG1 mRNA expression F=12.692,P<0.01.Compared with the normal oxygen control group, aP<0.05 MTH1：8-oxoguanine nucleoside triphosphatase；OGG1:8-hydroxyguanine glycolsylase

3 討論

高海拔環(huán)境具有低氣壓和低氧分壓的特點(diǎn)[5]。HAR屬于急性高原病的一種，是機(jī)體處于高海拔環(huán)境時出現(xiàn)的視網(wǎng)膜出血、視盤水腫、棉絮斑和黃斑水腫[6]。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的延續(xù)，視網(wǎng)膜是人體最具代謝活性的組織之一，其血流量受組織氧張力的調(diào)控，過低的氧分壓可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血流量增加，導(dǎo)致視網(wǎng)膜充血，甚至出血[7-8]。

本研究自擬的黃芪復(fù)方由黃芪、人參、枸杞、白術(shù)、玉竹、甘草組成，該復(fù)方藥物在四君子湯的基礎(chǔ)上，去除茯苓，增加黃芪、玉竹和枸杞。四君子湯能夠改善組織抗氧化性，提高機(jī)體內(nèi)分泌功能，調(diào)節(jié)體內(nèi)能量代謝[9]，而黃芪、人參、枸杞、白術(shù)、玉竹、甘草對自由基清除率較高，有較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激作用[10-15]。黃芪對免疫功能有著較廣泛的影響，具有明顯減少全身耗氧及增加組織耐缺氧2個方面的作用[10]。枸杞減緩脂質(zhì)過氧化進(jìn)程，具有良好抗氧化功能[12]。玉竹通過清除自由基，提高血清超氧化物歧化酶活力[14]。甘草對細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，能抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞抗氧化能力[15]。玉竹中的玉竹多糖在清除超氧陰離子及體外抗氧化方面明顯優(yōu)于茯苓多糖[16]，這為我們選擇玉竹，去除四君子湯中的茯苓提供了依據(jù)。本課題前期研究結(jié)果已提示黃芪復(fù)方制劑可通過提高視網(wǎng)膜細(xì)胞線粒體錳超氧化物歧化酶、細(xì)胞色素氧化酶水平，降低細(xì)胞色素C活性來發(fā)揮保護(hù)視網(wǎng)膜功能的作用[17]。

本課題組前期研究表明，急性低壓缺氧環(huán)境可導(dǎo)致大鼠視網(wǎng)膜損傷，其分子機(jī)制可能與調(diào)節(jié)缺氧相關(guān)因子和凋亡相關(guān)基因等的表達(dá)有關(guān)[18-19]。本研究中進(jìn)一步探討了急性缺氧對視網(wǎng)膜DNA相關(guān)因子的影響以及黃芪復(fù)方制劑對其防護(hù)的機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，在模擬海拔高度為5 km的低壓缺氧條件下，大鼠視網(wǎng)膜組織出現(xiàn)水腫，p53蛋白表達(dá)增強(qiáng)。p53是一種轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控多個基因介導(dǎo)細(xì)胞死亡、衰老及DNA修復(fù)，具有保護(hù)生物體基因組的功能。在正常細(xì)胞內(nèi)p53主要通過與E3泛素蛋白連接酶(mouse double minute 2homolog，MDm2)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)來保持較低水平表達(dá)，在各種應(yīng)激條件下，細(xì)胞通過抑制與MDm2的反應(yīng)以及后續(xù)一系列調(diào)節(jié)因子來誘導(dǎo)p53的磷酸化和轉(zhuǎn)錄，使p53表達(dá)水平升高[20]。本研究中黃芪復(fù)方灌胃組視網(wǎng)膜p53表達(dá)水平較低氧模型組下降，提示黃芪復(fù)方使p53保持較低水平表達(dá)以減輕應(yīng)激損傷而發(fā)揮視網(wǎng)膜保護(hù)作用。

雙鏈斷裂(double strand breaks，DSBs)是致命的DNA損傷形式之一[21]。而H2AX是DSBs最敏感的標(biāo)志物，可用于檢測DNA的損傷和修復(fù)[22]。H2AX在DSBs側(cè)邊位點(diǎn)被初始磷酸化后，可募集大量DSBs修復(fù)蛋白，實現(xiàn)對斷裂位點(diǎn)的修復(fù)[23]。本研究結(jié)果表明低氧模型組視網(wǎng)膜中H2AX陽性染色較常氧對照組增強(qiáng)，其機(jī)制可能為急性缺氧環(huán)境下，通過堿基胺化、硝化和脂質(zhì)過氧化作用影響信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致H2AX表達(dá)增強(qiáng)，破壞DNA，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。黃芪復(fù)方灌胃組視網(wǎng)膜中H2AX的表達(dá)水平較低氧模型組明顯降低，提示黃芪復(fù)方制劑可能是通過降低H2AX表達(dá)而減輕低壓缺氧環(huán)境下視網(wǎng)膜DNA損傷。

在本研究中，模擬急性低壓缺氧環(huán)境下大鼠視網(wǎng)膜中MTH1 mRNA和OGG1 mRNA表達(dá)水平明顯降低，可能由于急性低壓缺氧環(huán)境導(dǎo)致ROS攻擊糖和堿基，造成DNA的氧化損傷。鳥嘌呤具有最低的氧化還原電位，是最易被氧化的DNA堿基，氧化后產(chǎn)生8-二氫鳥嘌呤(8-oxoguanine，8-oxoG)[24]。OGG1從DNA中識別和切除8-oxoG，MTH1從核苷酸池中去除8-oxoG[25]，提示MTH1和OGG1在DNA完整性中具有重要作用。一項有關(guān)MTH1缺陷小鼠或細(xì)胞的研究表明，MTH1可有效減少小鼠大腦細(xì)胞核和線粒體DNA中8-oxoG的積累，從而有助于保護(hù)大腦免受氧化應(yīng)激損傷[26]。本研究結(jié)果提示急性低壓缺氧應(yīng)激使大量的MTH1和OGG1用于清除8-oxoG，繼而使大鼠視網(wǎng)膜中MTH1和OGG1減少，提示急性低壓缺氧引起大鼠視網(wǎng)膜DNA損傷。而黃芪復(fù)方制劑上調(diào)了這2種基因的表達(dá)，說明該制劑對低氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜DNA損傷有抑制作用。

利益沖突本研究中所有作者均聲明不存在利益沖突