染色盒同源物3對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究

張嘉琦，賈佩琦，蘇東明

0 引 言

結(jié)直腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤，在我國(guó)其發(fā)病率近年不斷上升。結(jié)直腸癌治療選擇多樣且個(gè)體化，包括腹腔鏡和手術(shù)局部切除、術(shù)前放療、姑息化療、靶向治療和免疫治療等等[1-3]。盡管如此，其治療形勢(shì)仍不樂觀。部分與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的癌癥易感基因已被成功鑒定，但大多數(shù)導(dǎo)致發(fā)病的機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步研究[4]。探討結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找可靠的結(jié)直腸癌早期治療靶點(diǎn)，仍舊是一個(gè)熱點(diǎn)與難點(diǎn)。

染色盒同源物3(Chromebox3，CBX3)，屬于CBX蛋白家族，是一種異染色質(zhì)蛋白，又被稱為異染色質(zhì)蛋白1γ(heterochromatin protein 1γ, HP1γ)，存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)。CBX3已被證實(shí)在肺腺癌、宮頸癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥中表達(dá)存在不同程度的上調(diào)，特別是結(jié)直腸癌中，已有研究證實(shí)miR-30a靶向CBX3，在小鼠異種移植模型中特異性地抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[5]，說明CBX3在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而其可能涉及到的下游機(jī)制還未被完全闡明，有待進(jìn)一步的研究。本研究旨在探討CBX3在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，及其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響，并初步研究其下游作用機(jī)制，以期為結(jié)直腸癌治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系(NCM460)及人結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116、HT29、SW620)購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection，ATCC)公司。16例結(jié)直腸癌患者組織樣本及其配對(duì)癌旁組織樣本來自南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院病理科，病理診斷均為腺癌。

1.2 研究方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析利用基因表達(dá)譜交互分析(GEPIA)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.pku.cn/)分析CBX3在各個(gè)類型癌癥中癌組織及癌旁組織的表達(dá)情況，并對(duì)TCGA數(shù)據(jù)集內(nèi)270例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行生存期分析，Kaplan-Meier生存曲線評(píng)估CBX3表達(dá)與結(jié)直腸癌生存結(jié)果之間的相關(guān)性；利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.oncomine.org/)分析CBX3基因在結(jié)直腸癌中表達(dá)差異，閾值的確定依據(jù)如下值：P值為0.0001，倍數(shù)變化為2，各基因排序；利用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.linkedomics. org/login.php)篩選CBX3相關(guān)基因并進(jìn)行京都基因與基因組百科全書通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway，KEGG通路)富集分析。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色使用鏈霉菌生物素-過氧化物酶法(SP法)對(duì)收集的16例結(jié)直腸癌配對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。兔抗人CBX3抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，鼠兔通用型二抗及濃縮型DAB購(gòu)自北京中山金橋公司。染色結(jié)果由2位病理醫(yī)師獨(dú)立評(píng)分并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，根據(jù)CBX3表達(dá)量，陰性0分，弱陽(yáng)性1分，陽(yáng)性2分，強(qiáng)陽(yáng)性3分。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460，人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、HT29、SW620，均使用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：95%空氣，5%二氧化碳，37 ℃，培養(yǎng)箱濕度70%～80%。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)量收取正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460和結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116、HT29、SW620的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。使用10%或12%的SDS-PAGE膠進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，每孔上樣量20 μg。濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF膜上，室溫下5%的脫脂奶粉溶液封閉2 h。分別加入一抗4 ℃過夜，次日二抗室溫孵育1～2 h。在搖床上進(jìn)行以上操作，每個(gè)步驟之間用TBST洗膜10 min×3次，最后加ECL超敏發(fā)光液暗室內(nèi)曝光，拍照并進(jìn)行灰度分析。

1.2.5 結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染CBX3過表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，CBX3特異性小干擾購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒載體經(jīng)DNA Mini-prep(QIAGEN公司，德國(guó))提取。按照脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑使用說明書(上海翊圣生物科技有限公司)將CBX3過表達(dá)質(zhì)粒(記作CBX3-OE組)、空載質(zhì)粒(記作Vector組)，或特異性小干擾(共三組序列，后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用si-1、si-2及si-3混合組進(jìn)行，記作CBX3-RNAi組)、無義序列(同記作Vector組)轉(zhuǎn)染至6孔板上培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞。24 h后用于增殖實(shí)驗(yàn)；48 h后收集細(xì)胞用于Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用SRB實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn)來觀察細(xì)胞增殖情況。用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并計(jì)數(shù)，在96孔板中每孔接種3000個(gè)細(xì)胞，完全培養(yǎng)基體積200 μL，分別于24 h、48 h、72 h和96 h收取細(xì)胞進(jìn)行SRB染色，檢測(cè)515 nm波長(zhǎng)處吸光值；在六孔板中每孔接種300～500個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)10～14 d，肉眼可見細(xì)胞克隆時(shí)，進(jìn)行結(jié)晶紫染色后拍照，鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)目。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染特異性小干擾及無義序列后，提取RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Qiagen 公司)說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，存于-20 ℃。訂購(gòu)CBX3及CEBPD(CCAAT/enhancer-binding protein delta，CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白delta)引物，按照qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)體系加樣，在實(shí)時(shí)定量PCR儀(ABI公司，美國(guó))上運(yùn)行程序。CBX3及CEBPD相對(duì)于GAPDH的表達(dá)使用2-ΔΔCt法計(jì)算和標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.8 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序選取HCT116細(xì)胞系，利用siRNA敲低CBX3表達(dá)，對(duì)CBX3敲低組及其對(duì)照組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序后，對(duì)2組間基因表達(dá)量進(jìn)行差異分析，篩選出顯著差異基因并制作熱圖。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)分析

2.1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析CBX3表達(dá)及其與生存期關(guān)系GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示,CBX3在多種癌癥中呈現(xiàn)高表達(dá)，尤其在結(jié)腸癌與直腸癌中，CBX3顯著高表達(dá)，見圖1。在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中，CBX3的mRNA表達(dá)水平明顯高于正常組織(P<0.01)。上述結(jié)果提示CBX3表達(dá)水平在結(jié)直腸癌中明顯升高。Kaplan-Meier生存曲線顯示，高表達(dá)CBX3的患者無病生存期低于低表達(dá)組(log-rank檢驗(yàn)，P=0.034)，提示CBX3高表達(dá)與低生存率相關(guān)，見圖2。

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析CBX3在癌癥特別是結(jié)直腸癌中表達(dá)水平

圖2 CBX3表達(dá)水平與無病生存期關(guān)系

2.1.2 CBX3共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)研究KEGG通路分析結(jié)果顯示，CBX3相關(guān)基因在核糖體、剪接體、蛋白酶體、RNA運(yùn)輸及降解、錯(cuò)配修復(fù)、細(xì)胞周期、Th17細(xì)胞分化、T細(xì)胞受體信號(hào)等多種途徑富集，表明CBX3對(duì)轉(zhuǎn)錄組的影響廣泛且復(fù)雜。

2.2 結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中CBX3表達(dá)水平免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CBX3主要定位于細(xì)胞核中，且在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁組織，染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分統(tǒng)計(jì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)，見圖3。Western blot實(shí)驗(yàn)表明，CBX3在各結(jié)直腸癌細(xì)胞系中蛋白表達(dá)量顯著高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系，見圖4。

*P<0.01圖4 Western blot檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系中CBX3蛋白相對(duì)表達(dá)量(n=3)

2.3 CBX3對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響Western blot結(jié)果顯示過表達(dá)及敲低效率顯著，見圖5。SRB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Vector組相比，CBX3-OE組細(xì)胞增殖速率明顯上升，CBX3-RNAi組細(xì)胞增殖速率明顯下降;克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Vector組相比，CBX3-OE組細(xì)胞克隆形成數(shù)量明顯增多，CBX3-RNAi組克隆形成數(shù)目明顯減少;見圖6。以上結(jié)果提示CBX3能夠促進(jìn)HCT116細(xì)胞的增殖。

*P<0.05圖5 Western blot驗(yàn)證CBX3過表達(dá)或敲低效率(n=3)

a：SRB實(shí)驗(yàn)(與24 h相比)；b：克隆形成實(shí)驗(yàn)*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001圖6 SRB實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力(n=3)

2.4 敲低CBX3后對(duì)CEBPD表達(dá)的影響轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選差異基因熱圖見圖7a，查閱其基因功能最終選取CEBPD、ADAM9、NT5E進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR結(jié)果顯示，敲低CBX3后，CEBPD mRNA水平顯著升高，見圖7b。Western blot結(jié)果顯示，CEBPD蛋白水平也相應(yīng)升高，見圖8a。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中CBX3與CEBPD相關(guān)性分析提示兩者存在負(fù)性相關(guān)，見圖8b。以上結(jié)果提示，CBX3的促癌作用可能通過抑制下游CEBPD的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

a：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序差異基因熱圖；b：qRT-PCR檢測(cè)差異基因表達(dá)*P<0.001圖7 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選差異基因并進(jìn)行驗(yàn)證(n=3)

a：Western blot檢測(cè)CEBPD蛋白相對(duì)表達(dá)量；b：CBX3與CEBPD相關(guān)性分析(GEPIA)*P<0.05、**P<0.001圖8 Western blot檢測(cè)CEBPD表達(dá)水平(n=3)

3 討 論

CBX3蛋白屬于CBX蛋白家族，與其結(jié)構(gòu)相似的還有CBX1和CBX5，均屬于異染色質(zhì)蛋白。已知異染色質(zhì)蛋白高度保守并參與細(xì)胞功能，包括DNA復(fù)制和修復(fù)[6]、轉(zhuǎn)錄調(diào)控[7]和RNA拼接[8]、細(xì)胞分化[9-10]、細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂調(diào)控[11]、著絲粒和端粒內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[12]等。而不同的亞型又具有各自獨(dú)特的功能，本課題重點(diǎn)關(guān)注CBX3的功能及機(jī)制。

前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，CBX3與多種癌癥相關(guān)，例如，有研究顯示CBX3的體內(nèi)敲低減少了K-RasG12D誘導(dǎo)的肺腺癌的發(fā)生，延長(zhǎng)了K-RasG12D誘導(dǎo)的肺腺癌小鼠的存活期[13]；有關(guān)胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CBX3的過度表達(dá)可以誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的體外增殖、無錨定生長(zhǎng)、遷移和侵襲等等[14]。課題組通過生物信息學(xué)分析，明確了CBX3在多種癌癥中均呈現(xiàn)高表達(dá)，尤其在結(jié)直腸癌中，CBX3表達(dá)顯著升高且與預(yù)后相關(guān)。KEGG通路分析提示，CBX3可能通過蛋白酶體、RNA運(yùn)輸及降解、錯(cuò)配修復(fù)、細(xì)胞周期等途徑影響結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，從而發(fā)揮積極的促癌作用。

后續(xù)研究中，利用免疫組織化學(xué)染色及Western blot實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)了CBX3在結(jié)直腸癌組織中及細(xì)胞中均顯著高表達(dá)。通過在結(jié)直腸癌細(xì)胞中過表達(dá)或敲低CBX3證明了CBX3能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外增殖。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，以期能夠找到CBX3促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的下游分子機(jī)制。

通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在敲低CBX3后，課題組發(fā)現(xiàn)多個(gè)癌癥相關(guān)因子表達(dá)發(fā)生改變，其中CEBPD表達(dá)明顯升高。CEBPD是一種轉(zhuǎn)錄因子，由單個(gè)外顯子CEBPD基因編碼，能夠調(diào)控細(xì)胞分化、運(yùn)動(dòng)、生長(zhǎng)停滯、增殖和死亡等多種生物學(xué)過程。有研究顯示，紫草素對(duì)銀屑病局部皮損JAK/STAT3信號(hào)通路有明顯抑制作用，并增加CEBPD的表達(dá)，從而顯著抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡[15]。而另有研究證實(shí)，CBX3敲低可以導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞中G0和G1期的凋亡增加和細(xì)胞周期停滯[16]，提示CBX3與細(xì)胞凋亡途徑密切相關(guān)。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CBX3和CEBPD進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者存在負(fù)性相關(guān)，因此推測(cè)，CBX3可能通過抑制CEBPD表達(dá)從而進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡，在結(jié)直腸癌中發(fā)揮促癌作用。但兩者之間具體的作用機(jī)制還未完全明確，有待進(jìn)一步研究與完善。

綜上所述，本課題組在細(xì)胞水平驗(yàn)證了CBX3能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，并發(fā)現(xiàn)這種促進(jìn)作用可能是通過抑制CEBPD轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，從而為基于CBX3為靶標(biāo)的結(jié)直腸癌早期診療提供了新思路。